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量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

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DOI：

10.3791/61759

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2020年12月14日

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

本文内容

摘要

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT 软件对生物膜结构的差异进行定量分析。例如，表面积、厚度、生物量）以评估抗感染药物对单个分离株的疗效。

摘要

生物膜是由微生物聚集形成的群落，依赖自身产生的胞外聚合物基质来维持其保护功能和结构完整性。医院内病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）能够以生物膜形式生长，导致囊性纤维化（CF）患者发生慢性肺部感染。计算机程序COMSTAT是一种有效的工具，可通过提取三维共聚焦图像中的数据，定量分析抗菌剂诱导的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜结构变化。然而，该软件的标准化操作较少被关注，而标准化操作对于准确报告生物膜行为以及实现不同研究中心之间的数据比较至关重要。因此，本实验方案旨在提供一个简单且可重复的框架，利用COMSTAT对不同抗菌条件下体外（in vitro）培养的生物膜结构进行定量分析。本方法以一株来自囊性纤维化患者的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）分离株为模型，在形成生物膜复制品后，分别暴露于妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096中。该逐步操作流程旨在减少操作者的理解歧义，并最大限度降低遗漏关键图像处理步骤的可能性。具体而言，本方案强调消除与COMSTAT手动操作相关的主观差异，包括图像分割以及定量分析函数的合理选择。尽管该方法要求用户在运行COMSTAT前额外花费时间处理共聚焦图像，但有助于减少自动化输出中对生物膜异质性的误判。

引言

生物膜是由微生物在自身产生的胞外聚合物基质（EPS）中定向聚集而成的结构。EPS基质极为复杂，主要由细菌细胞、水、蛋白质、多糖、脂类和核酸1组成，这些成分使生物膜与自由生活的浮游细胞显著不同。生物膜中的EPS相互黏附，并可附着于各种表面。EPS基质具有介导细胞间代谢物、遗传物质以及用于细胞间信号传递和防御的化合物交换的特性2。这些特性共同赋予生物膜结构完整性，并使其能够抵御外界胁迫因素，从而有助于逃避免疫识别并产生抗微生物能力3。

Pseudomonas aeruginosa 是一种公认的医院内病原菌，已知其在面对抗菌药物时会采取逃避性的生物膜生长策略。一个典型的例子是囊性纤维化（CF）患者，这是一种隐性遗传病。生物膜在耐抗菌药物的 P. aeruginosa4 的形成过程中起着关键作用，并促使 CF 患者发生慢性肺部感染，导致肺功能加速下降以及过早死亡5。因此，通常开展体外（in vitro）生物膜研究，以评估抗生素及新型抗感染药物对从 CF 患者体内分离的 P. aeruginosa 菌株的作用效果6,7。在生物膜形成后，将抗菌药物外加于生物膜结构，随后利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对生物膜片段进行高分辨率的三维重建。随后通常使用计算机软件 COMSTAT（作为 ImageJ 的插件）来定量分析生物膜结构的变化8,9,10,11。

尽管 COMSTAT 是 有用的 用于量化生物膜结构的图像分析的可重复性与标准化 较少受到关注。例如，在运行 COMSTAT 之前进行的图像处理步骤在操作上是客观的，但在设定图像阈值时包含一定的主观性12,13以类似方式，COMSTAT 程序允许操作者从基础到高级的条件和参数中选择用于图像分割的选项，以及十种定量分析功能（例如，厚度分布、表面积、生物量、无量纲粗糙度系数）。用户可选参数众多，加之操作者技术水平参差，可能导致对生物膜行为的误报。

因此，本实验方案的目标是提供一种相对简单的方法，用于定量比较 体外 使用 COMSTAT 分析生物膜结构。在此，来自囊性纤维化患者样本的生物膜片段的三维图像 P. aeruginosa 使用腔室盖玻片模型，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）捕获分离的细胞14——一种用于实现可重复操作的成熟技术 体外 生物膜实验。利用COMSTAT作为ImageJ的插件，该方法可使研究人员在不同条件下定量识别抗菌剂存在时生物膜结构的变化。总体而言，该方法旨在消除与COMSTAT手动操作相关的主观差异，从而促进各研究机构间实验方案的标准化。

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方案

1. 细菌分离物收集

  1. 从在病童医院（多伦多）接受吸入性妥布霉素根除治疗的囊性纤维化儿童患者队列中获取P. aeruginosa分离株。将分离株在甘油柠檬酸盐中于-80 °C冷冻保存，并在使用前至少传代三次。

2. 体外 生物膜形成

注意：采用带腔室的盖玻片法1 用于 体外 生物膜形成的改良方法。该模型的整体工作流程如下所示 图1.

  1. 在含有胰蛋白胨大豆琼脂和5%绵羊血的血琼脂平板上（见材料表），于37 °C培养P. aeruginosa分离株过夜。
  2. 从血琼脂平板上挑取1–2个细菌菌落接种至4 mL LB（溶菌肉汤）中，于37 °C、225 rpm振荡培养过夜。
  3. 取40 μL过夜培养物加入4 mL新鲜LB中，制备1:100的稀释接种液。于37 °C、225 rpm振荡培养3–4小时，使菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到约0.1（对数生长期早期）。
  4. 将220 μL接种液加入8孔盖玻片培养板的每个孔中，于37 °C静置孵育24小时。
  5. 缓慢移除各孔中的培养基，防止生物膜从底部脱落。
    注意：将载玻片向前倾斜约45°角，从每孔底部角落轻轻吸除培养基，避免移液枪头接触孔底。
  6. 配制并缓慢沿指定孔壁加入100 μL浓度为56 μg/mL的荧光标记单克隆抗体（mAb）（见材料表），室温（RT）孵育1小时，使抗体结合细菌抗原表位。
    注意：使用前将荧光标记（红色）单克隆抗体Psl0096用LB稀释至终浓度56 μg/mL。Psl0096是一种抗Psl单克隆抗体（Cam003的优化亲和力衍生物），可特异性结合P. aeruginosa生物膜胞外多糖基质中的I类Psl表位，该表位在初始细胞黏附和结构完整性中起关键作用15。
  7. 配制并缓慢沿指定孔壁加入100 μL浓度为1000 μg/mL的抗生素溶液（见材料表），于37 °C静置孵育24小时。
    注意：使用前将50 mg/mL的妥布霉素母液用LB稀释至终浓度1000 μg/mL。

3. 生物膜荧光染色

  1. 制备0.01 mM的活细胞染色荧光染料溶液。缓慢吸出腔室孔中的培养基，每孔加入200 μL染料混合液。在避光条件下室温孵育45分钟。
    注意：使用前，通过将4 μL的5 mM储存液加入2 mL LB培养基中，配制活细胞染色（绿色）荧光染料。
  2. 缓慢吸出每孔中的培养基，用200 μL新鲜LB培养基洗涤2次。
  3. 每孔加入200 μL新鲜LB培养基，随后通过共聚焦显微镜进行观察。

4. 共聚焦显微镜图像采集

注意：图像处理和 COMSTAT 分析流程见图2。应在生物膜染色的同一天获取各孔的图像。若观察延迟超过1小时，需将带孔盖玻片在避光条件下冷藏，直至后续处理。

  1. 使用共聚焦显微镜系统（参见材料表）并选择适当的激光激发波长和滤光片组合来获取孔板图像。
    注：此处分别使用561 nm和491 nm的激发波长来激发荧光标记（红色）的单克隆抗体和活细胞（绿色）染料。
  2. 使用20–25倍水浸物镜，以0.3 μm为步进间距，从基底至每个生物膜区域顶部采集分层的z轴堆栈图像。每孔至少采集6组图像堆栈。
    注：此处使用配备25倍水浸物镜的高分辨率相机采集图像，并通过图像分析软件进行处理（参见材料表）。在单次实验中，所有图像采集的软件设置和数字成像参数（即，亮度和灵敏度）应保持一致。
  3. 将图像保存为OME-TIFF格式，用于COMSTAT分析。
    注：确保将每个通道（即，红色和绿色）的OME-TIFF文件分别保存。此步骤根据所使用的图像分析软件可能有所不同。
  4. 重复步骤2.1–4.3，针对每种细菌分离株完成共计3次生物学重复（即，3次独立实验）的图像采集。

5. COMSTAT 分析

注意：使用免费的计算机程序 COMSTAT16,17 对图像进行定量分析，该程序已被重写为 ImageJ 的插件（Comstat2）。请阅读所下载软件包中关于分析生物膜图像堆栈的一般说明。本研究提供了一个简要的实验方案，并推荐了部分 ImageJ 图像处理步骤和 COMSTAT 功能，适用于定量评估抗菌剂对生物膜形成的影响。

  1. 从 http://www.comstat.dk/ 下载 Comstat2 软件包。在安装后的文件夹中找到 ImageJ 并运行。
  2. 在桌面上创建一个源文件夹，并将单个 OME-TIFF 文件添加到该文件夹中。
  3. 从源文件夹中打开 OME-TIFF 文件，并删除不包含生物量的空白层。这些空白层通常位于 z 轴堆栈的最前面或最后面几层。
    注意：用户有时会高估显微镜定义的z轴堆叠范围。删除这些空白层可为COMSTAT分析建立更精确的z轴堆叠边界。
  4. 在 ImageJ 中通过选择导入 OME-TIFF 文件 | 导入 | 图像序列. 找到源文件夹，选中但不打开，然后点击 选择“序列选项”窗口将出现。请选择 好的.
    注意：若要在 ImageJ 中导入其他图像，需先从源文件夹中移除之前的 OME-TIFF 文件，然后将新的 OME-TIFF 文件添加到该文件夹，并重复步骤 5.3 和 5.4。
  5. 通过选择翻转生物膜的方向 图像 | 变换 | Z轴翻转 将基质置于最上方（顶层）作为第一层堆叠。
    注意：COMSTAT 算法在 z 方向从顶部（图像栈 1）到底部读取生物膜。根据所使用的共聚焦显微镜系统，OME-TIFF 输出可能被反转。因此，必须通过调整切片顺序，将基底设为图像栈 1，以防止输出数据出现错误。
  6. 通过选择定义图像属性 图像 | 属性“源”窗口将出现。
    1. 将“长度单位”指定为“micron”。
    2. 使用以下公式计算“像素宽度”和“像素高度”：
      Cell size calculation formula, showing pixel size on CCD over magnification and position. (1)
      此处，“像素宽度”和“像素高度”定义为0.427，其中电荷耦合器件（CCD）上单个像素的物理长度为16 μm；总放大倍数为25倍；放大镜位置为1.5倍。
      注意：用于计算每个像素对应的细胞大小的公式可能因显微镜相机制造商的不同而有所差异。或者，“像素宽度”和“像素高度”可通过空间校准来确定（参见 https://imagej.net/Spatial_Calibration）。
    3. 将“体素深度”定义为 0.3（即每个 z-stack 层之间的增量间距）。选择 好的 在“源”窗口中。
  7. 调整图像阈值，方法是选择 图像 | 调整 | 阈值将出现一个“阈值”窗口。
    注意：图像中的对象将显示为红色，背景为灰度。或者，可通过“阈值”窗口中的下拉菜单将“红色”更改为“黑色”，以黑白模式调整阈值。&W’
    1. 在图像窗口中，将滑块调整到最右侧（即，生物膜的最上层）。为去除背景噪声，使用“Threshold”窗口（显示图像的直方图）手动设置最大和最小阈值。首先，通过将下方滑块尽可能向右移动，设定最大阈值；其次，使用上方滑块调整最小阈值，从而将图像分割为两个独立相：红色生物量和灰度背景图3).
      注意： 体外 生物膜形成及荧光显微镜操作流程在理想情况下可生成OME-TIFF格式图像，从而能够通过简单的直方图阈值法将图像分割为两个不同相。然而，在某些情况下，不同相之间的直方图区分并不十分明显。这可能是由于存在较强的背景噪声、背景强度变化较大，或生物量与背景之间的强度对比度较低所致。在此类情况下，用户应采用增强的分割流程。18,19.
      1. 或者，在“阈值”窗口中，通过左侧下拉菜单（设置为“默认”）为单个图像算法调整阈值。此功能提供17种不同的算法阈值选项可供选择（参见 https://imagej.net/Auto_Threshold）。选择最合适的选项，然后点击“自动”以设定阈值。
    2. 调整阈值时，使用图像窗口中的滑块逐层浏览，以确保在整个图像中充分去除背景噪声。
    3. 选择 设置 在“阈值”窗口中，首先设定下限阈值。此时将弹出“设置阈值水平”窗口。选择 好的选择 设置 再次重复此步骤以确定最大阈值。
      注意：每次选择“Set”时，下方滑块可能会自动调整。此时，需手动重新调整滑块（若使用算法阈值之一，则可选择“Auto”），并重复步骤5.6.2–5.6.3。关键原则是：每当滑块发生自动调整后，应额外再选择两次“Set”，以确保上下阈值均被固定。
    4. 选择 应用 “将栈转换为二进制”窗口将出现。选择 好的，然后退出“Threshold”窗口。
    5. 通过选择保存新调整的 OME-TIFF 插件 | Bio-Formats | Bio-Formats 导出器输入新的文件名，并将文件保存为源文件夹中的 OME-TIFF 格式。此时将弹出“Bio-Formats Exporter – Multiple Files”窗口。选择 好的“Bio-Formats 导出选项”窗口将出现。选择 好的.
      注意：在进行 COMSTAT 分析之前，确保仅将新调整的黑白 OME-TIFF 文件保存在源文件夹中，并从文件夹中移除所有原始 OME-TIFF 文件。
  8. 运行 COMSTAT，方法是选择 插件 | Comstat2 |“关于”窗口将出现。请选择 好的将出现三个窗口。
    1. 在“已观察目录”窗口（右上角）中，选择 添加. 找到源文件夹，选中但不打开，然后选择 选择将出现一个“目录中的图像”窗口（左上角），列出将通过 COMSTAT 进行分析的 OME-TIFF 文件。
    2. 在“Comstat 2.1”窗口（右下角）中，取消选择“自动阈值设定（Otsu 法）”，以确保软件使用先前为各个 OME-TIFF 文件设置的阈值。同时取消选择 连接体积过滤g（CVF），以确保生物膜中极薄的部分以及存在于生物膜结构孔隙中的游离细胞或生物量均被纳入分析。
      注意：此处取消选择CVF，因为COMSTAT分析针对的是早期生物膜（初始培养24小时）以及抗菌处理后残留的浮游细胞/菌落。对于成熟生物膜，应选择CVF，以确保仅对与生物膜结构相连的生物量进行定量。
    3. 在“Comstat 2.1”窗口（右下角）中，选择用于定量分析的所需特征。此处请选择 生物质量，厚度分布 和 表面积选择 开始 运行程序。在左下角的“Log”窗口中，将显示数据处理过程，直至出现“Done with selected functions/images!”。记录COMSTAT测量结果。这些测量结果也会自动保存为源文件夹中的TXT文件。

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结果

A P. aeruginosa 从感染样本中分离培养 用于展示该方法在准确量化抗菌治疗引起的变化方面的优势 体外 生物膜结构。该模型的整体工作流程如图所示。 图1图像处理与COMSTAT分析流程 在 ImageJ 中的显示如图所示 图2一种简单的直方图阈值分割方法在ImageJ中的应用，用于图像分割 共聚焦激光扫描显微镜z轴层扫图像（保存为OME-TIFF格式）如图所示 图3由妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096引起的生物膜结构变化如图所示 图4代表性共聚焦图像显示了生物膜片段的活细胞（绿色）和抗体（红色）通道分离结果 图4A相应的COMSTAT参数数据，包括平均生物膜厚度、生物量和表面积与生物体积比，如图所示。 图4<...

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讨论

目前尚无定量比较三维图像的既定方法 体外 生物膜结构以及本文所述的操作步骤常因操作者间的差异而难以实现标准化20因此，本方案为旨在量化变化的 COMSTAT 应用提供了一个简单且可重复的框架 体外 不同抗菌条件下生物膜结构的构建。该技术的优势通过使用CF进行建模 P. aeruginosa 分离后以生物膜形式培养的复孔，暴露于妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096。

在本方案以及相关研究中，最关键的步骤之一是图像阈值化13,21。图像阈值化是一种分割技术，可将灰度图像转换为COMSTAT算法可读的黑白格式。在此过程中，必须有效区分哪些灰度像素应被视为生物膜（黑色）而哪些属于背景噪声（白色），否则阈值的选择将改变单个生物膜图像所对应的体积和形态22。在ImageJ中，阈值化可通过多种方式实现：手动设置，或从17种算法...

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致谢

作者谨感谢囊性纤维化基金会为本研究提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗Psl单克隆抗体，Psl0096Medimmune
血琼脂培养基（含5%绵羊血的TSA）Fisher ScientificR01200
八孔腔室盖玻片（不可拆卸孔）Thermo Fisher Scientific155411
Invitrogen SYTO 9绿色荧光核酸染料Thermo Fisher ScientificS34854
LB肉汤（Lennox型），液体，高压灭菌BioShop CanadaLBL666
妥布霉素，900 µg/mgAlfa Aesar by Thermo Fisher ScientificJ66040建议对每批制备的妥布霉素进行最低抑菌浓度（MIC）测试，以确保抗菌活性的质量控制
Quorum Volocity 6.3Quorum Technologies图像分析软件

参考文献

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. Ø, Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819(2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , Kongens Lyngby. Denmark. (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260(2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677(2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

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