高台可固定大鼠，且在进行针刺操作时无限制地完全暴露背部穴位。本文介绍了高台的制作方法，建立大鼠哮喘模型，并采用无创实时全身体积描记（WBP）系统检测呼吸功能的变化。
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摘要
摘要
高台可固定大鼠而不加束缚，并在针刺操作过程中完全暴露背部的穴位。本文介绍了高台的制作方法，建立大鼠哮喘模型，并采用无创实时全身体积描记（WBP）系统检测呼吸功能的变化。
引言
哮喘是一种以支气管收缩和气道高反应性为特征的慢性疾病1。全球约有3.394亿人被诊断患有哮喘2。哮喘的患病率在全球范围内呈上升趋势，预计在未来十年内将新增1亿例病例3。吸入性糖皮质激素和长效β2-受体激动剂并不能有效控制所有患者的症状4。因此，针灸等替代疗法在治疗哮喘方面的应用正受到越来越多的关注5。一种治疗哮喘的有效方法是针刺督脉的GV14（大椎穴）以及双侧膀胱经的BL12（风门穴）和BL13（肺俞穴）6。针灸可显著降低过敏性哮喘患者唾液和鼻腔分泌物中分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的水平，减少外周血嗜酸性粒细胞计数，总有效率达85%6。在慢性哮喘小鼠模型中，针刺BL13和ST36（足三里）可使IL-17水平较卵清蛋白（OVA）模型组降低40%，平滑肌厚度减少33%，从而缓解炎症症状7,8。然而，针灸治疗哮喘的作用机制尚未完全明确。
动物模型是哮喘研究的重要工具9，因为动物模型可用于连续测量呼吸功能，以评估哮喘治疗的效果10。同时，哮喘病理生理学的研究需要检测样本，包括气管、肺组织和支气管肺泡灌洗液样本，以验证关键因子水平的变化11。大鼠哮喘模型常用于评估哮喘的病理生理过程，因其可产生持久的气道反应，并表现出即时相和迟发相气道反应12。然而，由于反复的实验刺激，大鼠常变得烦躁不安，因此需要一种合适的固定方法。常用的大鼠固定方法包括麻醉和束缚13。尽管麻醉法能更好地暴露穴位，但可能影响神经传导，最终干扰实验结果14。束缚法虽不会引起与麻醉相同的生理效应，但被束缚的大鼠会出现骨骼肌紧张，且针具难以准确到达指定位置15。本文介绍一种高台装置，可在不限制大鼠活动的情况下将其固定，并充分暴露背部穴位。在进行针刺操作时，可将大鼠置于该高台上。该高台仅允许大鼠直立站立时停留，且因其距离地面有一定高度，大鼠会因恐高而不愿移动16。
本文详细描述了高台的制备、大鼠哮喘模型的建立、在高台上对大鼠进行针刺操作以及使用整体容积描记法（WBP）系统测定呼吸功能的方法。
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方案
所有动物实验均经上海中医药大学动物实验伦理委员会审查和批准（伦理批件号 PZSHUTCM190308020）。
1. 高平台的制备
- 将支撑装置的长度和宽度设置为 86 cm × 17 cm（图 1）。
- 将连接装置垂直固定在支撑装置上。连接装置长度约为 30 cm，以防止大鼠跑至高平台的顶部表面，宽度为 14 cm。
- 将水平踏板（5 cm × 5 cm）固定在连接装置上。水平踏板底部的悬挂高度应大于或等于 50 cm。
注意：根据实验大鼠的数量，可使用多个水平踏板，每块踏板上放置一只大鼠。
2. 建立大鼠哮喘模型
- 用OVA致敏大鼠
- 在第0天配制致敏溶液。每1 mL致敏溶液含1 mg OVA和10 mg氢氧化铝，以生理盐水作为溶剂。
- 在第0天，对每只大鼠腹腔注射1 mL致敏溶液。使用合适的注射器抽取致敏溶液以备后续使用。
- 抓住大鼠尾巴并将其提起，放置于粗糙表面上，轻柔地向后拉尾巴。用左手拇指和食指捏住双耳及颈部皮肤，其余三指和手掌紧握背部皮肤（注意避免用力过大导致大鼠窒息）。
- 用右手持已准备好的注射器，向大鼠腹腔注射1 mL致敏溶液。
- 用OVA激发大鼠
- 选择一个带盖的盒子（长、宽、高分别为39 cm × 28 cm × 23 cm），在侧面钻一个小孔。用橡胶管将密闭盒、雾化杯和压缩雾化器连接起来（补充图1）。
注意：压缩雾化器产生的雾化颗粒大小为1–5 μm，雾化速率大于0.2 mL/min，最终压力为205 kPa。 - 致敏后第14天，打开自制密闭盒的盖子，将大鼠放入盒内（该盒可容纳5只大鼠），然后将密闭盒置于生物安全柜中。
- 配制激发溶液。将300 mg OVA与30 mL生理盐水充分混合。
- 开启超声雾化器，并将30 mL激发溶液加入雾化杯中。根据自制密闭盒的容积调整激发溶液的剂量和大鼠数量。
- 重复雾化多次（每日一次），或根据哮喘症状的严重程度调整操作方案。
- 选择一个带盖的盒子（长、宽、高分别为39 cm × 28 cm × 23 cm），在侧面钻一个小孔。用橡胶管将密闭盒、雾化杯和压缩雾化器连接起来（补充图1）。
3. 针灸治疗
- 根据中医治疗哮喘的理论，选取穴位，包括大椎穴（GV14）、双侧风门穴（BL12）和双侧肺俞穴（BL13）（补充图2）。于第2天开始进行手法针刺，每隔一天操作一次，共进行7次（图2）。
- 针刺位于第七颈椎与第一胸椎之间（肩胛骨凹陷处）、背部正中线上的大椎穴（GV14）（图3）。
- 针刺位于第三胸椎下方、两侧肋间隙处（肩胛骨下缘）的肺俞穴（BL13）。
- 针刺位于第二胸椎下方、两侧肋间隙处（肩胛骨下方，根据肺俞穴位置确定）的风门穴（BL12）。
- 抓握大鼠，将其放置于高台上。
- 用右手拇指和食指夹持一次性不锈钢针（0.3 mm × 13.0 mm，补充图3）的针柄，同时用右手掌固定大鼠背部。
注意：一次性针具仅可使用一次。重复使用会导致针尖变钝，增加大鼠疼痛感。 - 触摸上缘中点处的凹陷（GV14）或肩胛骨下缘（BL12和BL13），然后用针尖轻轻刺入大鼠皮肤以定位穴位。
- 确定穴位具体位置后，迅速进针，并立即移开右手。
- 均匀捻转针体约360°，频率为60次/分钟，持续10–20秒，每隔5分钟操作一次，留针20–30分钟后取出（补充图4）。
4. Penh 值的测量
- 制备乙酰甲胆碱：取100 mg乙酰甲胆碱放入5 mL离心管中，加入PBS至总体积为2 mL（得到50 mg/mL的乙酰甲胆碱溶液）。然后将50 mg/mL的乙酰甲胆碱溶液稀释为25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL和3.125 mg/mL。
- 仪器检查
- 打开信号放大器（此时气溶胶分配系统和啮齿类动物偏流供气系统均处于关闭状态，雾化连接器也应关闭）。
- 检查通道：点击校准，将粗调基线归零，并切换至直流（DC）位置。微调基线至零，用注射器注入5 mL气体，然后切换至交流（AC）位置。
- 完成通道检查后，确保误差值小于0.5%。
- 设置参数
- 打开气溶胶分配系统和啮齿类动物偏流供气系统。根据汞球液面将流速调节至4.5 mL。
- 点击创建研究选项，选择剂量反应研究，选择物种为大鼠，然后点击下一步。
- 选择简单剂量列表，将剂量数量设置为6，然后点击下一步。
- 选择Penh和Area参数：设置动物适应时间为5分钟，雾化时间为2分钟，反应时间为3分钟，恢复时间为2分钟。
- 依次向雾化器中加入以下溶液（每只大鼠200 μL）：乙酰甲胆碱（0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL和50 mg/mL）。可实时观察Penh的变化（图4）。
- 完成所有6种不同浓度溶液的反应后，点击文件和结束会话以结束实验。
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结果
针刺大椎穴（GV14）、双侧风门穴（BL12）和双侧肺俞穴（BL13）时，大鼠保持俯卧位。由于一侧被木板阻挡，大鼠只能将头部向外侧扭转，无法向内侧转动（图5）。
随着甲胆碱浓度的增加，Penh 呈现上升趋势，且增长速率逐渐加快。在浓度分别为 3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL 和 50 mg/mL 时，Penh 分别增加了 18.40% ± 10.70%、27.55% ± 26.30%、88.10% ± 45.63%、427.60% ± 172.92% 和 882.27% ± 121.97%，显示出随剂量增加而增强的效应（图6）。
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讨论
本研究中使用的背部穴位GV14、双侧BL12和双侧BL13，因此使用高台固定大鼠较为合适。在其他研究中，应根据穴位的位置选择适当的固定方法15。对于腹部穴位，可将大鼠头朝下置于黑色锥形容器中（类似于烘焙师使用的裱花袋）17。该限制用锥形容器上附有链条用于固定，同时固定大鼠的后肢。这样可使动物身体前部牢固地固定在锥形容器内，同时暴露腹部和背部。对于腿部穴位，可将大鼠垂直放置于特制的透明桶内，使尾巴和后肢自然留在桶外18。透明桶覆盖大鼠身体，但便于对腿部进行针刺操作。
进行这些方法时应考虑几个关键步骤。在针灸治疗前，应提前数天将大鼠放置于高台上进行适应性训练，直至大鼠在高台上保持安静并呼吸平稳。进行针灸操作时，右手掌用力按压大鼠背部的力度越大，越容易进针。在呼吸功能测量方面，全身体积描记（WBP）系统通过无创方式测量气道阻力指数（Penh）的变化，以反映大鼠肺阻力的改变，同时最大限度地减少心理应激的影响19<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（编号：81922076、81973951、81873373）和上海市协同创新建设项目（编号：ZYJKFW201811010、ZYJKFW201701005）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.3 mm x 13.0 mm 针灸针 | 中国苏州医疗器械厂 | ||
| Al(OH)3 | 美国 Thermo | 77161 | |
| 压缩式雾化器 | 江苏鲁迪电子科技有限公司 | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | 美国 Buxco | ||
| 实验室气体干燥装置 | 美国 Drierite | 26800 | |
| 乙酰甲胆碱 | 美国 Sigma | MKCF6054 | |
| 卵清蛋白 | 美国 Sigma | A5503-25G | |
| 磷酸盐缓冲液 (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| 密封箱 | 日本 IRIS 公司 | ||
| 全身体积描记呼吸功能测量系统 | 美国 Buxco |
参考文献
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重印与许可
