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方法文章

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

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DOI：

10.3791/61767

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2021年9月15日

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

本文内容

摘要

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。

摘要

移植实验室培养的组织或医疗器械在个体中的成功与否，取决于受体宿主的免疫反应。由于植入物被视为异物，可能引发敌对且失调的免疫反应，从而导致植入物被排斥；而若免疫反应受到调控并恢复稳态，则可实现对植入物的接纳。通过分析从体内分离出的植入物周围微环境 体内 或 离体 设置有助于理解免疫反应的模式，最终有助于开发新一代生物材料。流式细胞术是一种基于细胞表面标志物对免疫细胞及其亚群进行表征的常用技术。本文综述了一种从剥离的植入物组织中制备均一细胞悬液的实验方案，该方案包括手工切碎、酶消化以及通过细胞筛滤过。此外，还详细阐述了多色流式细胞术染色方案，以及流式细胞仪初始设置步骤，用于对分离获得的细胞进行流式细胞术表征与定量分析。

引言

医学领域的进步使得植入材料在支持受损组织功能或再生方面得到广泛应用1,2。这些材料包括起搏器、用于整形修复的美容植入物以及用于骨折固定的骨科钢板等装置3,4。然而，制造这些植入物所使用的材料及其植入部位在决定植入成功与否方面起着重要作用5,6,7。作为异物，这些植入物可能引发宿主的免疫反应，导致排斥或耐受8。这一因素推动了生物材料研究的发展，旨在开发出在植入后能够诱导理想免疫反应的材料9,10,11,12。

免疫反应是再生医学领域中的一个基本要求，在该领域中，组织或器官在实验室中围绕生物材料支架（scaffold）生长，以替代受损的组织或器官13,14,15,16。在再生医学中，目标是利用细胞、信号分子和支架来替代缺失或受损的组织，而这些要素均可受到免疫反应的显著调控17。此外，即使在期望避免免疫反应的情况下，通常所追求的也并非完全缺乏免疫活性，而是希望形成一种具有调节特性的免疫应答模式18。诸如流式细胞术等技术可在表征不同生物材料所引发的免疫反应模式方面发挥重要作用，这些生物材料被用于植入器械的涂层或组织工程支架的开发19。

这些信息最终将有助于开发出可被免疫系统良好耐受的植入物生物材料，或有助于构建在组织工程中发挥积极作用的支架。为流式细胞术分析正确制备样品，是避免通过荧光激活细胞分选进行免疫表征时获得不准确结果的重要步骤20,21。因此，本综述提供了一种详细的方法学，可用于从支架组织中分离细胞、对细胞悬液进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

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方案

注意：图1 概述了流式细胞术实验方案的流程。

1）试剂准备

  1. 准备用于稀释酶和组织培养的培养基。
    1. 将 5 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液加入 500 mL RPMI 培养基中，充分混匀。将培养基于 4 °C 保存，待后续使用。
  2. 计算酶溶液的体积。
    ​注意：酶溶液的体积是指含有消化酶（胶原酶和 DNase I）的培养基体积，用于在 6 孔板中消化剪碎的组织；其体积取决于样本数量。
    1. 使用以下公式计算所需体积：
      （待消化样本数）× 5 mL 无血清 RPMI 加 10 mM HEPES 缓冲液
      ​注意：例如，对于 0.1 至 0.3 g 的小鼠脾脏组织，使用 5 mL 培养基配制酶溶液。本文所述的酶消化方案主要适用于从小鼠中分离的软组织（0.1 至 1 g），包括脑、肾、皮肤、肝、肺、脾、肌肉，以及由合成材料或细胞外基质蛋白制成的皮下植入物周围的包膜组织。硬质软骨组织的消化可能需要不同的条件和酶体积，需通过优化实验确定。
    2. 计算配制酶溶液所需的胶原酶和 DNase I 用量。
      注意：本方案中使用的胶原酶浓度为 0.25 mg/mL，DNase I 浓度为 0.2 mg/mL。不同组织类型所需的胶原酶和 DNase 工作浓度可能有所不同19。
  3. 通过将 1 µL 活性染料（见材料表）加入 999 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 1:1000 的活性染料溶液，并涡旋混匀。将溶液避光保存于 4 °C，待后续使用。
  4. 将 1 g 牛血清白蛋白（BSA）加入 100 mL PBS 中，配制染色缓冲液，并涡旋至 BSA 完全溶解。将溶液于 4 °C 保存，待后续使用。

2）设置酶消化板

  1. 在6孔板的每个孔中放置70 µm细胞滤筛。向每孔加入3 mL步骤1.1.1中配制的培养基，并置于冰上孵育。
  2. 将剩余的培养基（每孔2 mL）保存在37 °C的培养箱或水浴中，用于悬浮计算量的胶原酶和DNase I（步骤1.2.2）。

3）细胞的分离

  1. 将解剖得到的植入物/组织放入培养板中，用剪刀充分剪碎。或者，可使用组织解离仪或手持式匀浆器进行机械性破碎处理。由于白细胞数量较多，每次实验均应分离出脾脏，作为染色对照使用。
    注意：由于某些材料会诱导更高程度的纤维化，本方案适用于高度纤维化和轻度纤维化材料。然而，在染色前应对每种处理方法的细胞得率和活性进行评估。解剖过程中应避免外周血污染。
  2. 将胶原酶和DNase I（体积按步骤1.2.2计算）加入已预热至37 °C的剩余RPMI培养基（2 mL）中。向每个孔中加入2 mL完全酶解液。
  3. 将培养板置于恒温摇床中，37 °C、100 rpm条件下孵育45分钟。
    注意：堆叠培养板时需谨慎，以免影响热传导效率。
  4. 同时，准备一个悬液加样枪头：用剪刀剪去1000 µL枪头末端3–4 mm。孵育结束后，使用剪短的枪头反复吹打各孔中的悬液，充分混匀。将细胞筛置于50 mL锥形管上方，将消化后的溶液通过细胞筛过滤。
    注意：70 µm细胞筛足以将细胞与植入的生物材料（如海藻酸盐）分离。若需要更高纯度，可采用密度梯度离心等方法，以获得富集的白细胞群体。
  5. 用1x PBS溶液冲洗各孔，并将冲洗液通过细胞筛滤入管中，随后继续用1x PBS冲洗细胞筛，直至管中液体体积达到50 mL。
    注意：1x PBS必须处于室温，以防止消化液黏度升高，并确保离心时细胞能够正常沉淀。
  6. 在室温下以300 × g离心5分钟。离心后，使用移液管小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于1000 µL的1x PBS中，并将悬液转移至微量离心管中。
  7. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，将混合液加载至细胞计数板，使用自动细胞计数仪进行计数，或在显微镜下用血细胞计数板进行传统方法计数。也可选用流式细胞术细胞计数微球进行计数。

4) 流式细胞术染色

  1. 参见图2，了解一个包含45个样本、荧光减一（FMO）对照、补偿对照以及完全染色的脾脏样本对照的14色实验示例板布局。在估算细胞总数后，计算每个样本染色所需1 × 106个细胞的细胞悬液体积，以及每个补偿对照和FMO对照所需0.5 × 106个细胞的体积。将所需体积的细胞悬液加入V型底96孔板的各孔中，并用1×PBS补足至100 µL。
    注：例如，若在步骤3.6中获得的1000 µL细胞悬液含有40 × 106个细胞，则对于1 × 106个细胞，所需细胞悬液体积为1000/40 × 106 = 25 µL。
  2. 在4 °C下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，然后在样本孔及用于检测活性的补偿对照孔中，用100 µL活性染料1:1000稀释液（见材料表）重悬细胞。
  3. 对于其他补偿孔、FMO孔及未染色孔中的细胞，用100 µL 1×PBS重悬。
  4. 将细胞在4 °C避光孵育30分钟。
  5. 在此期间，配制用于染色样本和FMO对照的表面抗体混合液：每样本或FMO需50 µL。参见表1中的抗体混合液示例。
  6. 孵育结束后，向每孔加入100 µL 1×PBS，在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  7. 吸除上清液，用200 µL染色缓冲液（1×PBS + 1% BSA）重悬细胞，然后在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  8. 吸除上清液后，用50 µL 1×PBS重悬补偿孔、FMO孔和未染色孔中的细胞。向相应的样本孔和FMO孔中加入50 µL抗体混合液。向不同的补偿孔中加入对应的单个抗体。
  9. 将板在4 °C避光孵育45分钟。孵育结束后，向每孔加入150 µL染色缓冲液，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  10. 吸除上清液，用200 µL染色缓冲液重悬细胞，然后在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  11. 若分析样本时不进行固定处理，则将其重悬于200 µL染色缓冲液中，并进入第6节进行流式细胞仪设置与样本分析。若需固定细胞，则在洗涤后吸除上清液，加入100 µL固定剂（如4%多聚甲醛）。若需进行胞内标志物染色，则进入第5节关于胞内染色的操作，并对细胞进行固定和通透处理（见材料表）。在4 °C避光孵育20分钟。
    注：由于固定可能影响某些荧光染料的荧光强度，应分别评估每组样本在固定与未固定条件下的结果。
  12. 孵育结束后，向每孔加入100 µL 1×PBS，随后在4 °C下以300 × g离心5分钟。吸除上清液，用1×PBS重悬细胞，再次在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  13. 将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中，在4 °C保存，待进行流式细胞术分析。

5) 胞内染色

  1. 从第4.11步继续进行细胞内标志物的固定和透化处理，加入100 µL适当的缓冲液。在4 °C下以350 × g离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于200 µL固定-透化试剂溶液中，再在4 °C下以350 × g离心5分钟。吸除上清液后，用适当缓冲液稀释的细胞内抗体将沉淀重悬。
    注意：抗体类型及稀释比例取决于目标细胞。例如，调节性T细胞常用的细胞内标志物之一是叉头框蛋白P3（forkhead box P3），通常使用1:100的稀释比例。
  2. 将细胞悬液在避光条件下于4 °C孵育45分钟。孵育结束后，加入150 µL适当的缓冲液，并在4 °C下以350 × g离心5分钟。
  3. 吸除上清液，将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中，随后在4 °C下以300 × g离心5分钟。再次吸除上清液，将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中，用于流式细胞术分析。

6) 流式细胞仪和补偿设置

  1. 在上机检测样本前，如果使用基于微珠的补偿而非基于细胞的补偿，请准备补偿微珠（参见材料表）。
    1. 为每种荧光染料偶联抗体分别标记离心管，每管加入 100 µL 1x PBS，然后向每管中各加入一整滴抗小鼠阴性对照补偿微珠和一滴阳性对照补偿微珠。向每个独立的离心管中加入 1 µL 相应的抗体。涡旋混匀后孵育 5 分钟，随后进行上机检测。
      注意：某些染料（如 BUV737）无法与微珠结合，应使用基于细胞的对照。
  2. 每次实验前，使用追踪微珠运行细胞仪设置以校准流式细胞仪，并在每次实验中保持细胞仪设置不变。
  3. 在分析样本前，运行未染色样本以调整流式细胞仪，使细胞群落在侧向散射光（SSC）对前向散射光（FSC）的图中位于中心位置，且未超出量程。
  4. 短暂运行已染色样本，以调整 FSC 和 SSC 以及各通道的电压，确保无任何事件超出各通道的对数尺度范围。每种单色补偿对照记录 5,000 个事件，随后对阳性与阴性细胞群进行设门。计算补偿矩阵，然后运行待测样本，至少采集目标细胞群的 1,000 个事件。
    注意：对于多色面板，应验证补偿效果，因为自动补偿容易出现过度或不足补偿。应将每个参数与其他所有参数逐一作图，以监测是否存在过度或不足补偿的迹象，并逐一评估每个单色对照。复杂多色实验的补偿操作应由具有丰富流式细胞术经验的合作者或核心设施协助完成。新型流式细胞仪（如光谱流式细胞仪）通过一种称为光谱解混的技术利用荧光染料的完整光谱信息，相比传统补偿方法可更清晰地区分荧光信号重叠22。

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结果

免疫分析中流式细胞术检测方案的开发过程通常依赖于将实验结果与现有数据及领域内的文献进行比较。了解细胞群体在流式细胞术中的表现形式对于正确解读数据至关重要。然而，不同组织中的细胞群体和细胞类型可能会表现出差异，因此某些变异性的出现是可预期的。在具有明确定义的对照组织背景下，可依据已深入研究的组织及其细胞类型来评估染色优化的效果。图3展示了在对照小鼠组织上进行的14色FACS结果。在此例中，脾脏被用于鉴定所有目标染色标记物，并验证染色技术的有效性。自此之后，在未知条件下进行检测变得更加容易，同时也能更可靠地选择荧光染料，并针对不同来源的组织优化实验方案。图3还展示了从小鼠脾脏中分离出的不同细胞类型的群体19。

在此，可观察到若干明显的细胞群，例如 Ly6G+ 中性粒细胞，以及不同单核细胞亚群...

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讨论

本文综述了一种从生物材料植入物中分离细胞以获得单细胞悬液的详细方法。此外，还提供了对细胞悬液进行多色流式细胞术染色的详细方案，以及配置流式细胞仪以获得最佳结果的操作步骤。细胞分离方法通常包括多个步骤，一般先进行手动组织解剖，随后使用蛋白水解酶进行酶消化，以解离组织中的细胞外基质并破坏细胞间连接，从而释放单个细胞。消化完成后，还需进一步处理，例如细胞过滤，以去除残留碎片，确保获得单细胞悬液。某些含有大量碎片或其他细胞类型（如肿瘤组织）的样本，可能需要通过密度分离介质进行更彻底的纯化23。若样本未充分纯化，碎片或其他细胞群可能会遮蔽目标细胞群，导致数据偏差。过多的碎片还可能导致流式细胞仪流路系统完全或部分堵塞。

尽管免疫细胞的表征也可通过其他方法进行，例如通过细胞离心涂片制备后的显微镜检查进行分类细胞计数，但流式细胞术能够基于细胞表面标志物对细胞进行更精确的表征。此外，流式细胞术的数据更为精确，因其可在悬浮液中对数百万个细胞进行表征和定量，并且相较于仅基于400个细胞的手工分类计数，能够更快地提供不同细胞亚群的准确估算结果

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划的支持，包括国立生物医学成像与生物工程研究所。免责声明：美国国立卫生研究院及其官员和员工不对任何公司、产品或服务进行推荐或背书。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 一次性离心管Fisher Scientific14-432-22
6孔板Fisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain缓冲液PlusBD 生物科学566385
BD CytofixBD 生物科学554655仅用于固定细胞
牛血清白蛋白Millipore SigmaA7906用于制备FACS染色缓冲液
CD11b AF700Biolegend101222克隆：M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5Biolegend117325克隆：N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121克隆：4B12
CD200R3 APCBiolegend142207克隆：Ba13
CD206 PEBiolegend141705克隆：C068C2
CD45 BUV737BD 生物科学612778克隆：104/A20
CD86 BUV395BD 生物科学564199克隆：GL1
CD8a BV421Biolegend100737克隆：53-6.7
Comp Bead 抗小鼠BD 生物科学552843用于补偿对照
DNase IMillipore Sigma11284932001牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113克隆：BM8
Fc阻断Biolegend101301克隆：93
固定/通透溶液试剂盒BD 生物科学554714用于细胞的固定和通透。
HEPES缓冲液赛默飞世尔科技15630080用于补充细胞培养基的缓冲液
LiberaseMillipore Sigma5401127001纯化的胶原酶I与胶原酶II的混合物
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒赛默飞世尔科技L23105活力染料
Ly6c AF488Biolegend128015克隆：HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633克隆：1A8
MHCII BV786BD 生物科学742894克隆：M5/114.15.2
磷酸盐缓冲液赛默飞世尔科技D8537
RPMI赛默飞世尔科技11875176细胞培养基
Siglec F BV605BD 生物科学740388克隆：E50-2440
V型底96孔板

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