高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

摘要

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。

摘要

移植实验室培养的组织或医疗器械在个体中的成功与否，取决于受体宿主的免疫反应。由于植入物被视为异物，可能引发敌对且失调的免疫反应，从而导致植入物被排斥；而若免疫反应受到调控并恢复稳态，则可实现对植入物的接纳。通过分析从体内分离出的植入物周围微环境 体内 或 离体 设置有助于理解免疫反应的模式，最终有助于开发新一代生物材料。流式细胞术是一种基于细胞表面标志物对免疫细胞及其亚群进行表征的常用技术。本文综述了一种从剥离的植入物组织中制备均一细胞悬液的实验方案，该方案包括手工切碎、酶消化以及通过细胞筛滤过。此外，还详细阐述了多色流式细胞术染色方案，以及流式细胞仪初始设置步骤，用于对分离获得的细胞进行流式细胞术表征与定量分析。

引言

医学领域的进步使得植入材料在支持受损组织功能或再生方面得到广泛应用^1,2。这些材料包括起搏器、用于整形修复的美容植入物以及用于骨折固定的骨科钢板等装置^3,4。然而，制造这些植入物所使用的材料及其植入部位在决定植入成功与否方面起着重要作用^5,6,7。作为异物，这些植入物可能引发宿主的免疫反应，导致排斥或耐受⁸。这一因素推动了生物材料研究的发展，旨在开发出在植入后能够诱导理想免疫反应的材料^9,10,11,12。

免疫反应是再生医学领域中的一个基本要求，在该领域中，组织或器官在实验室中围绕生物材料支架（scaffold）生长，以替代受损的组织或器官

方案

注意：图1 概述了流式细胞术实验方案的流程。

1）试剂准备

1. 准备用于稀释酶和组织培养的培养基。
   1. 将 5 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液加入 500 mL RPMI 培养基中，充分混匀。将培养基于 4 °C 保存，待后续使用。
2. 计算酶溶液的体积。
   ​注意：酶溶液的体积是指含有消化酶（胶原酶和 DNase I）的培养基体积，用于在 6 孔板中消化剪碎的组织；其体积取决于样本数量。
   1. 使用以下公式计算所需体积：
      （待消化样本数）× 5 mL 无血清 RPMI 加 10 mM HEPES 缓冲液
      ​注意：例如，对于 0.1 至 0.3 g 的小鼠脾脏组织，使用 5 mL 培养基配制酶溶液。本文所述的酶消化方案主要适用于从小鼠中分离的软组织（0.1 至 1 g），包括脑、肾、皮肤、肝、肺、脾、肌肉，以及由合成材料或细胞外基质蛋白制成的皮下植入物周围的包膜组织。硬质软骨组织的消化可能需要不同的条件和酶体积，需通过优化实验确定。
   2. 计算配制酶溶液所需的胶原酶和 DNase I 用量。
      注意：本方案中使用的胶原酶浓度为 0.25 mg/mL，DNase I 浓度为 0.2 mg/mL....

结果

免疫分析中流式细胞术检测方案的开发过程通常依赖于将实验结果与现有数据及领域内的文献进行比较。了解细胞群体在流式细胞术中的表现形式对于正确解读数据至关重要。然而，不同组织中的细胞群体和细胞类型可能会表现出差异，因此某些变异性的出现是可预期的。在具有明确定义的对照组织背景下，可依据已深入研究的组织及其细胞类型来评估染色优化的效果。图3展示了在对照小鼠组织上进行的14色FACS结果。在此例中，脾脏被用于鉴定所有目标染色标记物，并验证染色技术的有效性。自此之后，在未知条件下进行检测变得更加容易，同时也能更可靠地选择荧光染料，并针对不同来源的组织优化实验方案。图3还展示了从小鼠脾脏中分离出的不同细胞类型的群体¹⁹。

在此，可观察到若干明显的细胞群，例如 Ly6G+ 中性粒细胞，以及不同单核细胞亚群.......

讨论

本文综述了一种从生物材料植入物中分离细胞以获得单细胞悬液的详细方法。此外，还提供了对细胞悬液进行多色流式细胞术染色的详细方案，以及配置流式细胞仪以获得最佳结果的操作步骤。细胞分离方法通常包括多个步骤，一般先进行手动组织解剖，随后使用蛋白水解酶进行酶消化，以解离组织中的细胞外基质并破坏细胞间连接，从而释放单个细胞。消化完成后，还需进一步处理，例如细胞过滤，以去除残留碎片，确保获得单细胞悬液。某些含有大量碎片或其他细胞类型（如肿瘤组织）的样本，可能需要通过密度分离介质进行更彻底的纯化²³。若样本未充分纯化，碎片或其他细胞群可能会遮蔽目标细胞群，导致数据偏差。过多的碎片还可能导致流式细胞仪流路系统完全或部分堵塞。

尽管免疫细胞的表征也可通过其他方法进行，例如通过细胞离心涂片制备后的显微镜检查进行分类细胞计数，但流式细胞术能够基于细胞表面标志物对细胞进行更精确的表征。此外，流式细胞术的数据更为精确，因其可在悬浮液中对数百万个细胞进行表征和定量，并且相较于仅基于400个细胞的手工分类计数，能够更快地提供不同细胞亚群的准确估算结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 一次性离心管	Fisher Scientific	14-432-22
6孔板	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain缓冲液Plus	BD 生物科学	566385
BD Cytofix	BD 生物科学	554655	仅用于固定细胞
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A7906	用于制备FACS染色缓冲液
CD11b AF700	Biolegend	101222	克隆：M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	克隆：N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	克隆：4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	克隆：Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	克隆：C068C2
CD45 BUV737	BD 生物科学	612778	克隆：104/A20
CD86 BUV395	BD 生物科学	564199	克隆：GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	克隆：53-6.7
Comp Bead 抗小鼠	BD 生物科学	552843	用于补偿对照
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	克隆：BM8
Fc阻断	Biolegend	101301	克隆：93
固定/通透溶液试剂盒	BD 生物科学	554714	用于细胞的固定和通透。
HEPES缓冲液	赛默飞世尔科技	15630080	用于补充细胞培养基的缓冲液
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	纯化的胶原酶I与胶原酶II的混合物
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒	赛默飞世尔科技	L23105	活力染料
Ly6c AF488	Biolegend	128015	克隆：HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	克隆：1A8
MHCII BV786	BD 生物科学	742894	克隆：M5/114.15.2
磷酸盐缓冲液	赛默飞世尔科技	D8537
RPMI	赛默飞世尔科技	11875176	细胞培养基
Siglec F BV605	BD 生物科学	740388	克隆：E50-2440
V型底96孔板