小鼠经子宫胎儿气管阻塞模型

摘要

关于先天性膈疝和胎儿气管阻塞的各种动物模型，在伦理问题、成本、手术难度、体型、存活率以及遗传工具的可获得性方面各有优缺点。该模型为研究气管阻塞及管腔内压力升高对肺发育的影响提供了一种新工具。

摘要

胎儿气管阻塞（TO）是一种已确立的治疗方式，可促进严重先天性膈疝（CDH）胎儿的肺生长并提高存活率。在实施TO后，分泌的上皮液滞留会增加管腔内压力，从而诱导肺组织生长。已有多种动物模型被用于研究CDH和TO的病理生理机制，这些模型各有优缺点，例如技术操作难度、动物体型、成本、高死亡率以及遗传工具的可获得性。本文描述了一种新型的经子宫小鼠胎儿TO模型。实验中，对怀孕小鼠进行麻醉，通过正中腹切口暴露子宫；选择特定胎儿，使用一根贯穿子宫的缝线，环绕其气管、一侧颈动脉和一侧颈静脉进行结扎，实现气管阻塞。随后关闭母体腹腔，使其恢复。在分娩前采集胎儿样本。结果显示，TO组胎儿的肺重量与体重量之比高于对照组胎儿。该模型为研究人员提供了一种新工具，可用于研究TO及管腔内压力升高对肺发育的影响。

引言

先天性膈疝（CDH）发生于约每2500次妊娠中1例，可导致肺发育不全和新生儿肺动脉高压^1,2,3,4,5,6胎儿气管阻塞（TO）是一种针对重度先天性膈疝（CDH）患者的成熟产前治疗方法，需在妊娠26至30周期间通过胎儿镜手术实施^th 在32周妊娠时，将球囊置于隆嵴上方，随后取出^nd 妊娠周。这种暂时性气管阻塞可促进胎儿肺生长并提高存活率。先天性上呼吸道梗阻综合征是一种致死性疾病，伴有肺部增生，这启发外科医生实施人工气管阻塞，以促进分泌的上皮液潴留。该阻塞增加了管腔内压力，从而诱导肺生长⁷然而，应解除阻塞以促进上皮细胞成熟。

已开发出多种用于研究先天性膈疝（CDH）和气管结扎术（TO）的动物模型——包括绵羊、兔、大鼠和小鼠模型——以深入了解CDH和TO的病理生理机制。这些模型各有优缺点，例如技术难度、动物体型、成本、高死亡率以及遗传工具的可获得性。尽管绵羊模型所采用的手术技术与人类极为相似且具有可....

方案

所有实验均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 80023，1978 年修订版）。该实验程序已获得辛辛那提儿童研究基金会机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议号 #2016-0068 的批准。

1. 准备

1. 为了使年龄相匹配的野生型（WT）C57BL/6小鼠交配，应在下午6:00将其放入同一笼中，并于次日上午9:00将其分开。
2. 为了确定胚胎发育第0天（E0），需观察阴道栓，其具有附着于阴道壁的均质外层区域，以及包含纤维结构和部分精子的内层区域，这些精子与栓塞物质的纤维交织成团块状。
3. 记录小鼠交配时的体重。
4. 在E10时重新称量小鼠体重，以确认妊娠持续进行。
5. 在E16.5（早期小管形成阶段）进行手术。
6. 对手术中将使用的器械进行灭菌：剪刀、持针器、镊子、钳子以及手术刀片和刀柄。
7. 术前将手术平台预热至24 °C，并准备好24 °C的温盐水。
8. 为术后恢复创造温暖环境，并在笼内放置湿粮以利于早期进食。
9. 在动物术后恢复期间应持续看护，直至其能够自主进食。
10. 手术后将小鼠单独饲养于各自的笼具中。

2. 麻醉

1. 在手术前1小时，对怀孕母鼠皮下注射0.1 mg/kg的丁....

结果

本研究共纳入37个胎儿：20例（54.1%）为气管阻塞组（TO组），17例（45.9%）为对照组。由于4例TO组胎儿气管无法成功阻塞，因此被排除在研究之外。两组间死亡率无显著差异：TO组4例胎儿（25%），对照组2例胎儿（12%）（p=0.334，比值比（OR）2.5，95%置信区间（CI）0.39-16.05）。TO组的平均体重、肺脏重量及肺重与体重比值（LBWR）均高于对照组（表1）。TO组与对照组之间的LBWR存在显著差异（p=0.006）。

为确定小肺症（LBWR）差异的原因，对DNA、RNA和蛋白质进行了定量分析（图2）。TO组肺组织中的DNA含量及DNA/蛋白质比值均高于对照组，肺组织RNA含量无显著差异，而TO组的蛋白质含量低于对照组，这一结果与先前在兔TO模型中观察到的上皮细胞增生现象一致¹²。此.......

讨论

本方法描述了小鼠胎儿气管阻塞的手术操作及其对肺发育的影响。该方案中有一些关键步骤需要仔细执行，以确保气管阻塞（TO）成功。手术平台的温度以及注入腹腔的生理盐水温度，对妊娠的顺利进行至关重要。此外，需对仔鼠头部施加轻微压力，以确保颈部充分暴露。

只有6.0规格的聚丙烯缝线可用于该技术。大于6.0规格的缝线针较粗，会破坏颈部气管周围的结构，导致胎儿丢失。而更细的缝线针则过短，无法穿过E16.5胎鼠（早期小管期）的颈部。此外，使用切割针并不合适，因其可能破坏邻近结构。

该模型存在一些局限性。首先，小鼠与人类在肺部发育阶段与妊娠期之间的相关性存在差异。其次，难以在小鼠中成功建立先天性膈疝（CDH）模型，最后，在小鼠模型中开展血流动力学研究也较为困难。然而，本研究中较短的学习曲线显著降低了胎儿死亡率。如前所述，兔和羊模型的主要限制因素包括动物本身及其维持成本、每胎胎儿数量、妊娠周期长度，以及可用的遗传学工具有限。

该小鼠模型的第一个优势在于无需进行子宫切开术即可完成胸腹腔分流术（T.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
布托啡诺	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	用于局部麻醉
异氟烷	Halocarbon Life Sciences	NDC 66794-017-25	用于全身麻醉
放大眼镜	USA Medical-Surgical	SLR-250LBLK	至少2.5倍放大
Nikon 90i 显微镜	Nikon	3417	电动荧光显微镜
Nucleospin 组织试剂盒	Macherey-Nagel, Düren, Germany	740952.5	DNA 提取
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒	Thermo Fisher, IL, USA	23225	蛋白质定量
聚乳酸-羟基乙酸缝合线	Ethicon	VCP451H	4-0，24 mm，切割型
多聚赖氨酸载玻片	VWR	48382-117	显微镜用粘附载玻片
聚丙烯缝合线	Ethicon	Y432H	6-0，13 mm 1/2c 锥形针
RIPA 裂解缓冲液	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	R0278-50ml	蛋白质提取
丝线缝合线	Ethicon	VCP682G	4-0，24 mm，切割型
Trizol	Invitrogen	15596026	RNA 提取