我们提出了一种针对青春期前女孩及有早发性卵巢功能不全风险女性的生育力保存方案。该方案结合了卵巢组织冷冻与从卵巢组织中获取卵母细胞进行冷冻保存的技术。此策略提高了生育力保存的安全性，并优化了生殖潜能，从而最大化实现生育的机会。
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摘要
摘要
人类卵巢组织冷冻保存（OTC）在全球范围内日益广泛应用，用于保存青春期前女孩及面临早发性卵巢功能不全（POI）风险的女性的生育力，尤其是在紧急接受性腺毒性治疗或卵巢手术的情况下。由于目前在患者管理、生育力保存策略以及实验室技术操作流程方面尚无统一共识，生育力保存仍具挑战性，这意味着每项操作都必须根据患者的个体特征及其特有的风险-获益比进行个性化调整。在OTC过程中，可在青春期前女孩和女性中，直接从卵巢组织样本内的大/小窦状卵泡中抽吸成熟/未成熟卵母细胞，或在卵巢组织分离过程中使生长中的卵泡将卵母细胞释放至培养基中。本文介绍了一种将卵巢组织冷冻与从卵巢组织样本中获取的成熟/未成熟卵母细胞冷冻保存相结合的方案，以提升生育力保存的生殖潜能。本文将详细描述卵巢组织和卵母细胞在冷冻保存前、中、后的恰当采集、处理与储存方法。同时还将讨论冷冻保存后解冻的卵巢组织样本及卵母细胞的后续使用与安全性，以及未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）的最佳时机。我们建议在青春期前女孩和女性的生育力保存中系统性地采用该方案，因其不仅提高了整体生育力保存的生殖潜能（即在OTC基础上增加卵母细胞玻璃化冷冻），还改善了生育力保存的安全性与实用性（即使用解冻卵母细胞而非卵巢移植），从而最大化POI高风险患者成功分娩的机会。
引言
由于面临早发性卵巢功能不全（POI）风险的患者人数在过去二十年中不断增加，生育力保存领域也随之发展1,2,3。目前可用于保存生育力的医疗手段包括卵巢组织冷冻保存（OTC）4、经卵巢刺激后的卵母细胞/胚胎冷冻5、促性腺激素释放激素类似物（GnRH类似物）的应用6以及卵巢移位术7。其中，卵巢组织冷冻保存是生育力保存领域的一项重大进展，尤其适用于青春期前女孩——这是目前唯一可保存其生育力的方法，同时也适用于那些无法推迟开始接受性腺毒性治疗的女性患者2,4。
OTC技术能够保存大量原始卵泡，这些卵泡位于卵巢皮质的最外层1 mm内2。冷冻/解冻后的卵巢组织可通过移植（原位或异位，自体或供体）或体外培养以获得成熟卵母细胞2。研究表明，将冷冻-解冻后的青春期前卵巢组织样本进行移植可诱导青春期启动
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方案
所有女性（18岁以上）以及所有未成年女孩及其父母均签署了知情同意书，以对有早发性卵巢功能不全（POI）风险的患者进行生育力保存。本方案在本中心被视为常规辅助生殖技术（ART）操作，遵循本机构人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 质量控制
- 纳入年龄 ≤ 38 岁、血清抗苗勒管激素浓度 >1 ng/mL 且因接受性腺毒性治疗而存在早发性卵巢功能不全（POI）高风险的女性。排除符合卵母细胞玻璃化冷冻以进行生育力保存的女性、无法充分知情同意的女性，或存在麻醉或手术高风险并发症的女性。
- 在开始本操作前，确认已签署患者知情同意书。
- 在两个不同的冷冻保存储存罐中分别确定两个空置位置。将一半冷冻管/麦管存放在第一个储存罐中，另一半存放在另一个储存罐中，以在储存罐发生故障时最大限度降低样本全部丢失的风险。
- 检查本方案所需的所有医疗器械的可用性和功能状态。解剖步骤推荐使用带有锋利直刃和精细尖端的无菌外科剪刀，以及无菌无创组织镊。
- 检查所有医疗器械是否均已执行质量控制步骤（特别是灭菌过程的验证和常规控制、有效期/批号的核对与追踪）。
- 整个操作过程中须维持无菌/无菌环境，并谨慎执行所有安全防护措施。
- 每位患者应使用不同的培养皿、移液管和外科器械。
2. 保存前一天
- ....
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结果
2007年至2020年间共对81名女性患者实施了81例卵巢组织冷冻（OTC），其中包括43名青春期前女孩和38名成年女性。女性患者（青春期前女孩和成年女性）的平均年龄为14.21 ± 9.61岁（平均值 ± 标准误）。最年轻的患者为5个月大，最年长的为33.6岁（表1）。青春期前女孩和成年女性的平均年龄分别为6.84 ± 4.81岁（最小值–最大值：0.5–15.1）和22.76 ± 5.92岁（最小值–最大值：14.2–33.6）（Mann-Whitney检验，p = 3.37 × 10-10）。
青春期前女孩中，在卵泡移植前有性腺毒性治疗史的患者比例为48.84%（21/43），而成年女性中该比例为13.16%（5/38）（卡方检验）2，p = 0.0006）。大多数患者接受了完全性卵巢切除术（88.89%（72/81），包括43名青春期前女孩和29名女性），而仅9名女性接受了部分卵巢切除术（Fisher精确检验，p = 0.0006）。 图4
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讨论
本论文提供了一种联合卵巢组织冷冻与从卵巢组织中获取卵母细胞进行冷冻保存的技术方案，可提高青春期前女孩及早发性卵巢功能不全（POI）风险女性的生育力保存潜力。我们强烈建议在任何具有性腺毒性的治疗开始之前实施该方案，以优化所保存卵母细胞的数量（即存活卵母细胞数目）和质量（即DNA完整性及胞质成熟能力），从而确保其在临床应用中的安全性24。若无法在性腺毒性治疗开始前实施该方案，则也可在治疗启动后进行，但在辅助生殖技术（ART）中使用此类卵母细胞时需格外谨慎，应采取特定的预防措施，如胚胎植入前遗传学检测（PGT）、严密的胎儿监护以及羊膜穿刺术16。
由于目前对于生育力保存所需获取的卵巢组织量尚无明确共识，我们建议对青春期前女孩以及具有中/高风险早发性卵巢功能不全（POI）或卵巢储备功能低下风险的患者实施全卵巢切除术。实际上，通过卵巢切除术所获取的卵巢组织体积将直接关系到同一位患者可回收并随后冷冻保存的卵母细胞数量。在我们的研究结果中，观察到女性在部分卵巢切除术与完全卵巢切除术中所获得的卵母细胞数.......
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披露
所有作者均无竞争利益。
致谢
感谢我们中心所有参与生育力保存工作的成员（妇科医生、生物学家、肿瘤学家和病理学家）。本研究作为生育力保存的常规程序的一部分进行，未获得任何资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 一次性注射器 | CDD | 1323101/7002655 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 21 号注射针头 | Merck | Z192481 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 35 mm 体外受精培养皿 | Nunc | 150255 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 60 mm 体外受精培养皿 | Nunc | 150270 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 90 mm 体外受精培养皿 | Nunc | 150360 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 无创镊子 | Medlane | PI 299 04 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 含人血清白蛋白的连续单细胞培养完全培养基 | Irvine Scientific | 90165 | 用于卵泡液采集、卵丘-卵母细胞复合体（COCs）孵育、卵母细胞去颗粒细胞及卵母细胞在玻璃化冷冻前的孵育的体外受精培养液 |
| 冻存管 | Thermo Scientific | 368632 | 其他产品也可能适用 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | MILTENYI BIOTEC SAS | 170-076-303 | CryoMACS DMSO 10 (EP) |
| GT40 | Air Liquide | 1,13,517 | 储存罐 |
| HSV 高安全性玻璃化冷冻 straw | Irvine Scientific | 25251 | 玻璃化冷冻 straw |
| 人血清白蛋白 | Vitrolife | 10064 | 其他产品也可能适用 |
| Leibovitz L15 培养基 | Eurobio | CM1L15000U | 用于卵巢组织采集、运输及组织解剖的培养基 |
| Leibovitz L15 培养基 | Eurobio | CM1L15000U | 用于冷冻溶液的培养基 |
| Mars-IVF II 级工作站/L126 IVF 双工位 | CooperSurgical | WM1500/6-133-911-121 | 工作站 |
| 程序降温仪 | Planner KRYO 500 | Kryo 560-16 | 其他设备也可能适用 |
| 带锋利直刃和精细尖端的剪刀 | Medlane | CI 034 03 | 其他材质和规格也可能适用 |
| 去颗粒细胞装置 | CooperSurgical | MXL3-STR-CGR | 其他产品也可能适用 |
| 去颗粒细胞装置专用吸头（150µm） | CooperSurgical | MXL3-150 | 其他产品也可能适用 |
| 玻璃化冷冻试剂盒 | Irvine Scientific | 90133 | 操作方案可访问 http://www.irvinesci.com/products/90133-so-vitrification-freeze-solutions 获取。其他产品也可能适用 |
参考文献
- Ataman, L. M., et al. Creating a global community of practice for oncofertility. Journal of Global Oncology. 2 (2), 83-96 (2016).
- Rivas Leonel, E. C., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine a....
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