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方法文章

冷冻保存从卵巢组织中获取的卵母细胞以优化青春期前女孩和女性的生育力保存

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DOI：

10.3791/61777

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2020年10月23日

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1Développement Embryonnaire Précoce Humain et Pluripotence, Univ Montpellier, INSERM 1203, 2Département de Biologie de la Reproduction, Biologie de la Reproduction/DPI et CECOS, CHU Montpellier, Univ Montpellier, 3Centre d'AMP-CECOS, CHU Grenoble-Alpes, Univ Grenoble-Alpes

本文内容

摘要

我们提出了一种针对青春期前女孩及有早发性卵巢功能不全风险女性的生育力保存方案。该方案结合了卵巢组织冷冻与从卵巢组织中获取卵母细胞进行冷冻保存的技术。此策略提高了生育力保存的安全性，并优化了生殖潜能，从而最大化实现生育的机会。

摘要

人类卵巢组织冷冻保存（OTC）在全球范围内日益广泛应用，用于保存青春期前女孩及面临早发性卵巢功能不全（POI）风险的女性的生育力，尤其是在紧急接受性腺毒性治疗或卵巢手术的情况下。由于目前在患者管理、生育力保存策略以及实验室技术操作流程方面尚无统一共识，生育力保存仍具挑战性，这意味着每项操作都必须根据患者的个体特征及其特有的风险-获益比进行个性化调整。在OTC过程中，可在青春期前女孩和女性中，直接从卵巢组织样本内的大/小窦状卵泡中抽吸成熟/未成熟卵母细胞，或在卵巢组织分离过程中使生长中的卵泡将卵母细胞释放至培养基中。本文介绍了一种将卵巢组织冷冻与从卵巢组织样本中获取的成熟/未成熟卵母细胞冷冻保存相结合的方案，以提升生育力保存的生殖潜能。本文将详细描述卵巢组织和卵母细胞在冷冻保存前、中、后的恰当采集、处理与储存方法。同时还将讨论冷冻保存后解冻的卵巢组织样本及卵母细胞的后续使用与安全性，以及未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）的最佳时机。我们建议在青春期前女孩和女性的生育力保存中系统性地采用该方案，因其不仅提高了整体生育力保存的生殖潜能（即在OTC基础上增加卵母细胞玻璃化冷冻），还改善了生育力保存的安全性与实用性（即使用解冻卵母细胞而非卵巢移植），从而最大化POI高风险患者成功分娩的机会。

引言

由于面临早发性卵巢功能不全（POI）风险的患者人数在过去二十年中不断增加，生育力保存领域也随之发展1,2,3。目前可用于保存生育力的医疗手段包括卵巢组织冷冻保存（OTC）4、经卵巢刺激后的卵母细胞/胚胎冷冻5、促性腺激素释放激素类似物（GnRH类似物）的应用6以及卵巢移位术7。其中，卵巢组织冷冻保存是生育力保存领域的一项重大进展，尤其适用于青春期前女孩——这是目前唯一可保存其生育力的方法，同时也适用于那些无法推迟开始接受性腺毒性治疗的女性患者2,4。

OTC技术能够保存大量原始卵泡，这些卵泡位于卵巢皮质的最外层1 mm内2。冷冻/解冻后的卵巢组织可通过移植（原位或异位，自体或供体）或体外培养以获得成熟卵母细胞2。研究表明，将冷冻-解冻后的青春期前卵巢组织样本进行移植可诱导青春期启动8,9。在女性中，冷冻-解冻卵巢皮质组织进行原位自体移植后的生殖结局令人鼓舞，自然受孕后的活产率可达57.5%10，而通过辅助生殖技术（ART）受孕后的活产率则介于30%至70%之间11。自2004年首次实现冷冻/解冻人卵巢组织原位移植后成功分娩活婴以来12，该技术已在全球范围内促成至少130名婴儿的出生2。移植组织的激素分泌和生殖功能通常可持续数年11,13,14，证实了其长期功能的有效性。

然而，卵巢组织样本的自体移植在某些患者中存在重新引入存活恶性细胞的理论风险15,16,17,18，尤其是在白血病幸存者中19。迄今为止，在健康的癌症幸存者中，尚未报道通过移植冻融卵巢皮质组织传播癌症的病例11，这表明卵巢皮质的纤维性无血管特性可能为恶性细胞的扩散提供了不利的微环境。尽管如此，卵巢组织移植仍属于一种实验性且具有挑战性的技术，提示目前应将卵母细胞的使用视为比卵巢组织移植更为简便和安全的生育力恢复方法。有趣的是，在OTC过程中，无论是在青春期前女孩还是成年女性中，均可从卵巢组织中轻松获取未成熟卵母细胞16，这表明其可作为除冷冻卵巢皮质组织外另一种可靠的资源，以最大化生育力恢复的潜力。这些卵母细胞可在ART实验室中通过体外手动抽吸自可见的窦状卵泡获得，或在卵巢组织切碎后从废弃的培养液中分离得到。所获得的卵母细胞可直接在未成熟阶段进行玻璃化冷冻，或在冷冻前通过体外成熟（IVM）技术进行成熟处理后再行玻璃化冷冻20,21。

在本文中，我们提出了一种联合方案，将卵巢组织冷冻保存与从卵巢组织中获取的成熟（MII期卵母细胞）和/或未成熟卵母细胞（即生发泡期（GV期）和第一次减数分裂中期（MI期）卵母细胞）的分离及冷冻保存相结合。该方案详细阐述了为青春期前女孩和成年女性最大化生育力保存潜力所需的所有具体操作步骤。

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方案

所有女性（18岁以上）以及所有未成年女孩及其父母均签署了知情同意书，以对有早发性卵巢功能不全（POI）风险的患者进行生育力保存。本方案在本中心被视为常规辅助生殖技术（ART）操作，遵循本机构人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 质量控制

  1. 纳入年龄 ≤ 38 岁、血清抗苗勒管激素浓度 >1 ng/mL 且因接受性腺毒性治疗而存在早发性卵巢功能不全（POI）高风险的女性。排除符合卵母细胞玻璃化冷冻以进行生育力保存的女性、无法充分知情同意的女性，或存在麻醉或手术高风险并发症的女性。
  2. 在开始本操作前，确认已签署患者知情同意书。
  3. 在两个不同的冷冻保存储存罐中分别确定两个空置位置。将一半冷冻管/麦管存放在第一个储存罐中，另一半存放在另一个储存罐中，以在储存罐发生故障时最大限度降低样本全部丢失的风险。
  4. 检查本方案所需的所有医疗器械的可用性和功能状态。解剖步骤推荐使用带有锋利直刃和精细尖端的无菌外科剪刀，以及无菌无创组织镊。
  5. 检查所有医疗器械是否均已执行质量控制步骤（特别是灭菌过程的验证和常规控制、有效期/批号的核对与追踪）。
  6. 整个操作过程中须维持无菌/无菌环境，并谨慎执行所有安全防护措施。
  7. 每位患者应使用不同的培养皿、移液管和外科器械。

2. 保存前一天

  1. 准备一个无菌的 60 mm IVF 培养皿，内含覆盖矿物油的 IVF 培养基，于 37 °C、5% O2 和 5% CO2 的环境中孵育过夜。用于收集可能从组织中获取的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）（见第 7.2 节）。
  2. 准备一个无菌的 35 mm IVF 培养皿，内含 IVF 培养基，并于 37 °C、5% O2 和 5% CO2 的环境中孵育过夜。此培养皿用于卵母细胞去丘步骤（见第 9.1 节）。
  3. 准备一个无菌的 35 mm IVF 培养皿，内含覆盖矿物油的 IVF 培养基，并于 37 °C、5% O2 和 5% CO2 的环境中孵育过夜。此培养皿用于去丘步骤后收集卵母细胞（见第 9.4 节）。

3. 卵巢组织的采集与运输

  1. 在全身麻醉下进行腹腔镜手术，于脐部置入一个10 mm穿刺套管，在左下腹象限和右侧分别置入两个5 mm穿刺套管。
  2. 根据肿瘤科医生、外科医生及辅助生殖技术（ART）单元医务人员共同商定的方案，结合双侧卵巢的储备功能、大小及大体形态（图1，A1–B1）以及计划实施的性腺毒性治疗方案，行单侧卵巢的部分或全部切除术。使用锐性剪刀或外科吻合钉进行卵巢切除。禁止使用可能对需保留的卵巢组织造成邻近、电或热损伤的分离器械。
    注意：通常对青春期前女孩施行单侧卵巢完全切除术16,22，而对于卵巢体积较大和/或卵巢储备较高的成年患者，则通常可行单侧卵巢部分切除术。

卵巢解剖结构、解剖操作及实验室组织分析；皮质与髓质的识别。
图1：卵巢组织冷冻保存。两名急性髓系白血病患者分别在青春期前（A，7岁患者）和成年女性（B，28岁患者）阶段进行卵巢组织冷冻保存。（A1–B1）卵巢的腹腔镜视野。（A2–B2–B3）卵巢组织的解剖过程。（B4）卵巢皮质组织。CL：黄体。SAF：小窦状卵泡。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用自制或商用的腹腔镜标本取出袋对卵巢组织进行取出操作。
  2. 将卵巢组织放入含有培养液的无菌管中，置于 4 °C 环境下。组织必须完全浸没在培养液中。
  3. 为获得最佳效果，应立即将卵巢组织置于 4 °C 的保温袋中运送至辅助生殖技术（ART）实验室。
    注意：如有必要，卵巢组织可在低温（约 4 °C）下运送，自采集后最长可达 26 小时，且不会影响组织质量23。

4. 卵巢组织制备

  1. 将卵巢组织转移至含有20 mL预冷培养基（4 °C）的无菌90 mm IVF培养皿中。
  2. 将盛有卵巢组织的培养皿置于垂直层流洁净台上的低温板（4 °C）中，以最大限度降低微生物污染风险。

5. 卵巢组织样本的手动卵泡抽吸

  1. 使用连接至1 mL一次性注射器的21 G注射针头，抽吸卵巢组织表面可见的窦状卵泡（若存在）。
    注意：此步骤可能较难操作。可选方法是用手术刀轻轻切开每个可见的窦状卵泡，并用体外受精（IVF）培养基冲洗卵泡内部，以轻柔释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）至解剖培养基中。
  2. 将收集的卵泡液冲洗至一个无菌的60 mm IVF培养皿中，该培养皿内含5 mL室温的IVF培养液。
  3. 用1 mL室温IVF培养液冲洗注射器，并将冲洗液注入同一IVF培养皿中。重复此步骤两次。
  4. 在倒置显微镜下（50x–200x放大倍数）识别并分离卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。
  5. 用移液器将健康的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至一个新的无菌60 mm IVF培养皿中，该培养皿内含预先平衡的IVF培养液，并在37 °C、5% O2 和5% CO2 的环境中覆盖矿物油。
    注意：健康的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包含透明的卵母细胞。呈棕色卵母细胞的退化性COCs应弃去。
  6. 将IVF培养皿置于37 °C、5% O2 和5% CO2 的培养箱中保存，直至进行去颗粒细胞操作（见步骤9）。

6. 卵巢组织解剖

  1. 在50 mL无菌离心管中配制新鲜的冷冻溶液。冷冻溶液包含1.5 M二甲基亚砜（DMSO）和10%人血清白蛋白，溶于体外受精（IVF）培养液中。轻轻涡旋混匀。
    注意：应在使用前立即配制。
  2. 切割卵巢组织，并尽可能去除髓质（图1，B4）。
  3. 将卵巢皮质切成10 mm × 10 mm × 1 mm的片状；若为单侧完全或部分卵巢切除术，则分别切成0.5 mm × 0.5 mm × 1 mm的片状（图1，A2–B2–B3）。切割时使用无菌外科剪刀和无创镊子进行。
    注意：保留一片完整的卵巢组织（包含皮质和髓质），用于后续组织学分析（见步骤8）。
  4. 解剖后，将每份卵巢皮质样本在1 mL IVF培养液中洗涤两次（或根据需要更多次），以去除血液。洗涤后，将所有组织样本转移至新的60 mm培养皿中，内含新鲜IVF培养液。
  5. 将每份卵巢皮质样本放入含有1 mL冷冻溶液的冻存管中。
    注意：无需混合。用于后续组织学分析的卵巢组织切片不进行冷冻保存（见步骤8）。
  6. 将样本在4 °C下静置30分钟，使其与冷冻溶液充分平衡。
  7. 采用慢速冷冻法对所有样本进行冷冻保存。使用程序化冷冻仪，降温速率为：从+4 °C以-2 °C/min降至-9 °C，再以-50 °C/min降至-30 °C；保持1分钟，然后以+4 °C/min升至-15 °C，再以-2 °C/min降至-40 °C；最后以-25 °C/min降至-150 °C。
  8. 立即取出冻存管，并迅速浸入-196 °C的液氮中。
  9. 将一半冻存管放入第一个液氮储存罐，另一半放入第二个液氮储存罐中。

7. 从解剖后培养基中手动分离冠卵复合体

  1. 在显微镜下（50x–200x 放大倍数）从解剖用过的培养基中鉴定卵丘-卵母细胞复合体（COCs）（图 2）。

显示卵丘细胞和放射冠细胞排列的卵母细胞发育阶段显微图像。
图2：从卵巢组织中获取的成熟与未成熟COCs。 从卵巢组织中获取的成熟（A）和未成熟（B1–B3, C1–C2）COCs。（A）包含成熟卵母细胞的成熟COC（存在第一极体，处于中期II阶段的卵母细胞）。（B1）包含未成熟卵母细胞的健康未成熟COC（无极体，处于中期I阶段的卵母细胞）。（B2–B3）包含未成熟生发泡阶段卵母细胞的健康未成熟COC（无极体，处于前期I阶段的卵母细胞）。（C1–C2）包含退化性棕色卵母细胞的不健康COCs。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用移液器将健康的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至一个新的无菌60 mm体外受精（IVF）培养皿中，该培养皿内含有已在37°C、5% O2 和5% CO2 气氛中预平衡的IVF培养液，并覆盖油层（参见步骤2.1）。
    注意：弃去退化的COCs。
  2. 将IVF培养皿置于37°C、5% O2 和5% CO2 气氛的培养箱中，直至去丘化步骤（参见步骤9）。

8. 卵巢组织组织学分析

  1. 在化学洁净工作台中，将剩余的卵巢组织切片（包含卵巢皮质和髓质）置于3%甲醛溶液中固定，用于组织学检查。
    注意：此步骤仅可在皮质样本成功冷冻并储存后进行。
    警告：甲醛溶液具有刺激性、腐蚀性和毒性。此步骤应谨慎操作，并在体外受精（IVF）实验室外进行。
  2. 对该卵巢组织样本开具完整的组织学分析，评估潜在恶性细胞的存在情况，并描述卵巢卵泡的数量和类型（即原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡）。

9. 卵母细胞去丘和筛选

  1. 进行卵母细胞去丘。将卵丘复合体（COCs）短暂暴露于透明质酸酶溶液（80 IU/mL 或终浓度 0.1 mg/mL）中，使用大直径移液吸头（体积 0.1–20 µL，长度：40.5 mm，工作锥体直径：6 mm，开口直径：0.36 mm）轻轻吹打 30 秒（反复将 COCs 吸入并推出至去丘液中），随后立即在预先平衡并覆盖矿物油的培养基中洗涤两次，以去除多余的酶（参见步骤 2.1）。
  2. 在预先平衡的体外受精（IVF）培养基中，使用内径 150 µm 的移液吸头通过轻柔吹打，优化去除卵丘细胞和放射冠细胞（参见步骤 2.1）。
  3. 使用倒置显微镜（200x–400x 放大倍数）进行健康卵母细胞的筛选。健康卵母细胞的成熟阶段可为生发泡期（GV）、第一次减数分裂中期（MI）或第二次减数分裂中期（MII）卵母细胞（图 3）。健康卵母细胞具有以下形态学特征：细胞质完整且呈圆形，大小在 100–150 µm 之间，颜色较浅。
    注意：弃去萎缩性和不健康的卵母细胞（图 3，D1–D3）。

卵母细胞发育阶段的显微镜图像；标注生发泡，比例尺为 30 μm。
图 3：从卵巢组织中获取的成熟与未成熟卵母细胞。（A）成熟卵母细胞（第二次减数分裂中期卵母细胞：可见第一极体（PB，箭头），无可见细胞核）；（B1–B2）未成熟卵母细胞（第一次减数分裂中期卵母细胞：无极体，无可见细胞核）；（C1–C3）未成熟卵母细胞（生发泡期（VG）卵母细胞：无极体，细胞质内可见含有核仁的大晕环结构（箭头））。在C1中，生发泡期卵母细胞表现出大小异质性。（D1–D3）退化卵母细胞。PB：极体。GV：生发泡。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将健康的卵母细胞置于培养箱中，在 37 °C、5% O2 和 5% CO2 条件下孵育，直至进行玻璃化冷冻步骤（见步骤 2.1）。

10. 卵母细胞玻璃化冷冻

  1. 确认患者/样本的身份信息。
  2. 使用倒置显微镜（200x–400x 放大倍数）进行健康卵母细胞的重新筛选步骤。
    注意：丢弃退化或不健康的卵母游戏副本。
  3. 在玻璃化冷冻步骤前，使用倒置显微镜对每个健康卵母细胞拍照，并记录每个卵母细胞的成熟阶段。
    注意：将所有这些数据（图像、大小、成熟阶段）附在患者的病历文件中。
  4. 若对同一患者冷冻保存多个麦管，应为每个麦管使用不同的编号以作区分。
  5. 每个麦管中冷冻保存一个或两个卵母细胞。
    注意：成熟与未成熟的可存活卵母细胞必须分别冷冻保存。当在同一麦管中共同冷冻两个卵母细胞时，建议选择具有相似形态学特征的卵母细胞。
  6. 根据生产商说明书，使用玻璃化冷冻试剂盒对健康卵母细胞进行冷冻保存（参见 材料表）。
  7. 根据生产商说明书，将已冷冻的卵母细胞装载至适当的装置上，用于在液氮中进行冷冻储存（参见 材料表）。
  8. 将一半麦管放入第一个液氮储存罐中，另一半麦管放入第二个液氮储存罐中。

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结果

2007年至2020年间共对81名女性患者实施了81例卵巢组织冷冻（OTC），其中包括43名青春期前女孩和38名成年女性。女性患者（青春期前女孩和成年女性）的平均年龄为14.21 ± 9.61岁（平均值 ± 标准误）。最年轻的患者为5个月大，最年长的为33.6岁（表1）。青春期前女孩和成年女性的平均年龄分别为6.84 ± 4.81岁（最小值–最大值：0.5–15.1）和22.76 ± 5.92岁（最小值–最大值：14.2–33.6）（Mann-Whitney检验，p = 3.37 × 10-10）。

青春期前女孩中，在卵泡移植前有性腺毒性治疗史的患者比例为48.84%（21/43），而成年女性中该比例为13.16%（5/38）（卡方检验）2，p = 0.0006）。大多数患者接受了完全性卵巢切除术（88.89%（72/81），包括43名青春期前女孩和29名女性），而仅9名女性接受了部分卵巢切除术（Fisher精确检验，p = 0.0006）。 图4

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讨论

本论文提供了一种联合卵巢组织冷冻与从卵巢组织中获取卵母细胞进行冷冻保存的技术方案，可提高青春期前女孩及早发性卵巢功能不全（POI）风险女性的生育力保存潜力。我们强烈建议在任何具有性腺毒性的治疗开始之前实施该方案，以优化所保存卵母细胞的数量（即存活卵母细胞数目）和质量（即DNA完整性及胞质成熟能力），从而确保其在临床应用中的安全性24。若无法在性腺毒性治疗开始前实施该方案，则也可在治疗启动后进行，但在辅助生殖技术（ART）中使用此类卵母细胞时需格外谨慎，应采取特定的预防措施，如胚胎植入前遗传学检测（PGT）、严密的胎儿监护以及羊膜穿刺术16。

由于目前对于生育力保存所需获取的卵巢组织量尚无明确共识，我们建议对青春期前女孩以及具有中/高风险早发性卵巢功能不全（POI）或卵巢储备功能低下风险的患者实施全卵巢切除术。实际上，通过卵巢切除术所获取的卵巢组织体积将直接关系到同一位患者可回收并随后冷冻保存的卵母细胞数量。在我们的研究结果中，观察到女性在部分卵巢切除术与完全卵巢切除术中所获得的卵母细胞数...

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披露

所有作者均无竞争利益。

致谢

感谢我们中心所有参与生育力保存工作的成员（妇科医生、生物学家、肿瘤学家和病理学家）。本研究作为生育力保存的常规程序的一部分进行，未获得任何资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 ml 一次性注射器CDD1323101/7002655其他材质和规格也可能适用
21 号注射针头MerckZ192481其他材质和规格也可能适用
35 mm 体外受精培养皿Nunc150255其他材质和规格也可能适用
60 mm 体外受精培养皿Nunc150270其他材质和规格也可能适用
90 mm 体外受精培养皿Nunc150360其他材质和规格也可能适用
无创镊子MedlanePI 299 04其他材质和规格也可能适用
含人血清白蛋白的连续单细胞培养完全培养基Irvine Scientific90165用于卵泡液采集、卵丘-卵母细胞复合体（COCs）孵育、卵母细胞去颗粒细胞及卵母细胞在玻璃化冷冻前的孵育的体外受精培养液
冻存管Thermo Scientific368632其他产品也可能适用
二甲基亚砜（DMSO）MILTENYI BIOTEC SAS170-076-303CryoMACS DMSO 10 (EP)
GT40Air Liquide1,13,517储存罐
HSV 高安全性玻璃化冷冻 strawIrvine Scientific25251玻璃化冷冻 straw
人血清白蛋白Vitrolife10064其他产品也可能适用
Leibovitz L15 培养基EurobioCM1L15000U用于卵巢组织采集、运输及组织解剖的培养基
Leibovitz L15 培养基EurobioCM1L15000U用于冷冻溶液的培养基
Mars-IVF II 级工作站/L126 IVF 双工位CooperSurgicalWM1500/6-133-911-121工作站
程序降温仪Planner KRYO 500Kryo 560-16其他设备也可能适用
带锋利直刃和精细尖端的剪刀MedlaneCI 034 03其他材质和规格也可能适用
去颗粒细胞装置CooperSurgicalMXL3-STR-CGR其他产品也可能适用
去颗粒细胞装置专用吸头（150µm）CooperSurgicalMXL3-150其他产品也可能适用
玻璃化冷冻试剂盒Irvine Scientific90133操作方案可访问 http://www.irvinesci.com/products/90133-so-vitrification-freeze-solutions 获取。其他产品也可能适用

参考文献

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