脂结合蛋白和过敏原中内源性配体的去除与替换

摘要

本方案描述了通过反相高效液相色谱结合热退火技术，从过敏原中去除内源性脂质，并用用户指定的配体进行替换的方法。³¹P-核磁共振和圆二色光谱可用于快速确认配体的去除与加载，以及过敏原天然结构的恢复。

摘要

许多主要过敏原能够结合疏水性类脂分子，包括 Mus m 1、Bet v 1、Der p 2 和 Fel d 1。这些配体被强烈保留，并可能通过直接刺激免疫系统或改变过敏原蛋白的生物物理特性，影响致敏过程。为了控制这些变量，需要采用技术手段去除内源性结合的配体，并在必要时替换为成分明确的脂质。蟑螂过敏原 Bla g 1 具有一个大的疏水性空腔，使用传统方法纯化时，该空腔会结合多种内源性脂质的混合物。本文介绍一种方法，通过反相高效液相色谱（HPLC）去除这些脂质，随后进行热退火处理，从而获得无配体（Apo-form）的 Bla g 1，或重新加载用户定义的脂肪酸或磷脂货物。将该方案与生化检测相结合发现，脂肪酸货物显著改变了 Bla g 1 的热稳定性和蛋白酶抗性，进而影响 T 细胞表位的生成速率及过敏原性。这些结果强调了在研究来自重组或天然来源的过敏原时，采用此类脂质去除/重加载方案的重要性。该方案可推广至其他过敏原家族，包括脂质结合蛋白（lipocalins，如 Mus m 1）、PR-10 蛋白（如 Bet v 1）、MD-2 样蛋白（如 Der p 2）和 uteroglobin（如 Fel d 1），为研究脂质在过敏反应中的作用提供了有力工具。

引言

对过敏原数据库的调查显示，过敏原仅存在于所有已知蛋白质家族的2%中，这表明共同的功能和生物物理特性可能有助于致敏性¹。在这些特性中，结合脂质货物的能力在过敏原中显著富集，提示这些脂质货物可能影响致敏过程¹。事实上，已有研究显示，巴西坚果过敏原Ber e 1需要与其内源性脂质共同施用才能发挥其完全的致敏潜力²。这些脂质可能直接刺激免疫系统，例如尘螨过敏原Der p 2和Der p 7，二者在结构上均与脂多糖（LPS）结合蛋白具有高度同源性^3,4,5。基于这一观察结果，有研究提出Der p 2和Der p 7可能结合细菌脂质，并通过TLR4介导的信号通路直接激活宿主免疫系统，从而促进致敏过程^5,6。此外，内源性结合的脂质也可能改变过敏原 蛋白自身的生物物理特性。例如，芥菜过敏原Sin a 2和花生过敏原Ara h 1与磷脂囊泡相互作用的能力显著增强了它们对胃和内体降解的抵抗能力⁷；而桦树花粉主要过敏原Bet v 1与配体结合后，则改变了内体加工速率以及所产生的肽段的多样性⁸。这一点对于致敏性尤为重要，因为已有研究观察到蛋白质的稳定性、T细胞表位的产生与致敏性之间存在相关性，如Bet v 1和Bla g 1；后者将是本研究的重点^9,10。

Bla g 1 是昆虫主要过敏原（MA）蛋白家族的典型成员，具有由12个两亲性α螺旋组成的独特结构，这些螺旋包裹着一个异常大的疏水性空腔^9,11。现有的Bla g 1 X射线晶体结构显示，该空腔内存在电子密度，与结合的磷脂或脂肪酸配体一致；这一推测已通过³¹P-NMR和质谱分析得到证实。这些结合的分子具有异质性，其组成高度依赖于过敏原来源，在大肠杆菌（E. coli）和毕赤酵母（P. pastoris）中表达的重组Bla g 1中观察到不同的脂质谱型。有趣的是，从天然过敏原来源（蟑螂粪便）纯化的Bla g 1在其结合位点主要含有脂肪酸，其中棕榈酸、油酸和硬脂酸的混合物被鉴定为其“天然”配体^9,11。Bla g 1在经历多次纯化步骤后仍能保留脂质和脂肪酸，这阻碍了对该蛋白本身特性的独立研究。相反，有研究提出，Bla g 1的天然配体——棕榈酸、硬脂酸和油酸（下文简称nMix）——在其致敏性和天然生物学功能中均发挥关键作用⁹。然而，来源于重组系统的Bla g 1不含这些配体，使得验证该假说变得困难。类似问题也见于其他脂质结合型过敏原，如Bet v 1^12,13。为了系统研究脂质与过敏原之间的相互作用，我们开发了一种实验方案，可将过敏原内源性结合的脂质定量去除，并将其重构为无配体的Apo形式，或加载特定的配体。

变应原通常通过亲和层析和/或尺寸排阻层析从天然来源或重组来源中纯化。本文介绍了一种额外的纯化步骤，即采用反相C18柱的高效液相色谱法（HPLC），使变应原洗脱至有机溶剂中，该方法类似于为脂肪酸结合蛋白开发的纯化方案¹⁴。所得蛋白质随后在有或无脂肪酸和/或磷脂的条件下进行热退火处理。该方法不仅可恢复Bla g 1的天然构象，而且升高的温度还能提高脂质配体的溶解度和可及性，从而获得以Apo形式存在或均匀负载目标疏水性配体的Bla g 1蛋白。 通过此方法纯化的Bla g 1的³¹P-NMR谱图证实了内源性结合配体被完全去除，并被目标化合物均匀取代，而圆二色谱则确认了Bla g 1正确折叠结构的成功恢复。该方法的有效性在最近的一项研究中得到凸显，研究发现配体结合可增强Bla g 1的热稳定性和抗蛋白水解能力，改变T细胞表位生成的动力学，可能对致敏性和变应原性产生影响⁹。

方案

1. Bla g 1 克隆

1. 获取代表MA结构域单个重复序列的蟑螂过敏原Bla g 1.0101（第34-216位氨基酸）的基因。为简便起见，本研究中将使用Bla g 1表示该单个重复序列，而非完整的Bla g 1.0101转录本。
2. 将Bla g 1基因亚克隆至目标载体中。本研究中，将含有N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签并连接烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点的基因插入pGEX载体中进行表达，具体方法如前所述¹¹。
3. 将Bla g 1 pGEX载体转化至BL21 DE3 E. coli细胞中。
   1. 制备浓度为10 ng/µL的目标载体储备液。
   2. 取1 µL浓度为10 ng/µL的DNA储备液与50 µL BL21 DE3细胞（按制造商提供）混合。
   3. 将BL21 DE3与DNA的混合物置于冰上孵育30分钟，随后转移至42 ˚C水浴中1分钟，立即再次放回冰上继续孵育1分钟。
   4. 向细胞中加入200 µL LB培养基，并在37 ˚C下额外孵育1小时。
   5. 将转化后的细胞涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 ˚C过夜培养。

2. 初步表达与纯化

1. 按照1.3节所述方法，将含有Bla g 1质粒的BL21 DE3细胞单菌落接种于1 L含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37 ˚C过夜培养。
2. 次日，通过离心（6,000 x g，10分钟）收集细胞（OD₆₀₀ ~1.5），重悬于2 L含100 mg/L氨苄青霉素的2x YT培养基中。继续在37 ˚C培养约1小时，使OD₆₀₀达到> 0.6。
3. 加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，将细胞转移至18 ˚C继续过夜培养。
4. 次日，按照2.2节所述方法收集细胞。所得细胞沉淀可冷冻并保存于-20 ˚C。
5. 将1 L培养物所得沉淀重悬于50 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.5，100 mM NaCl）中，其中加入1片蛋白酶抑制剂（或等效物）和1 µL苯并核酸酶（benzonase nuclease）。
6. 使用探头式超声破碎仪（500 W，20 kHz），设定功率为30–50%，占空比50%，超声处理4分钟。超声过程中将裂解液置于冰浴中冷却。
7. 将裂解液在45,000 x g离心20分钟，弃去不溶性组分（沉淀）。
   1. 取28 µL可溶性蛋白，加入7 µL 5x SDS-PAGE上样缓冲液，保存用于后续SDS-PAGE分析。在TEV蛋白酶孵育前后，对GST柱的穿流液、洗涤液和洗脱液组分均重复此操作。
8. 将可溶性蛋白（上清液）上样至预先用pH 7.4 PBS平衡的谷胱甘肽树脂柱（总柱床体积约10 mL）。
9. 用50 mL PBS洗涤未结合的蛋白。
10. 用含10 mM还原型谷胱甘肽的50 mL PBS洗脱GST-Bla g 1融合蛋白。
11. 将洗脱的蛋白与0.2 kU TEV蛋白酶在4 ˚C孵育过夜，或在室温孵育6小时，以切除GST标签。

3. 通过反相高效液相色谱法去除内源性脂质

1. 收集切割后的Bla g 1，并使用具有适当截留分子量的离心过滤装置将其浓缩至约2 mL <10 kDa 分子量截留值
   1. 添加 <将12 mL样品加至浓缩管顶部，于5,000离心 x g 在摆桶转子中离心10–15分钟。
      注意：样品体积和离心速度将根据所使用的特定滤器和转子类型而有所不同。使用前请查阅制造商提供的说明书。
2. 将浓缩液上样至配备C18反相色谱柱（250 × 10 mm）的高效液相色谱系统，该色谱柱预先用97%缓冲液A（水，0.1%三氟乙酸）和3%缓冲液B（乙腈，0.1%三氟乙酸）平衡。
   注意：可以使用较小的层析柱，但可能需要通过多次循环上样和洗脱以适应其降低的结合容量。选择层析柱时，应确保树脂微珠的粒径为 < 5 μm，孔径大小为 >200 Å，以实现对蛋白质大小分子的有效分离
   警告：三氟乙酸具有强腐蚀性，应在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（即腈类手套、实验服和护目镜）进行操作。乙腈具有中等毒性、易挥发且高度易燃，应在通风橱内使用，并佩戴适当的个人防护装备（即腈类手套、实验服和护目镜）。
3. 使用所示方案洗脱Bla g 1 表1 以1.5–4.0 mL/min的流速进行。通过280 nm处的荧光吸光度监测洗脱过程。
   1. 收集并合并 Bla g 1 组分。Bla g 1 通常在 >74% 缓冲液 B，或约 34–40 分钟。
      注意：洗脱时间会因流速或柱体积的不同而略有差异。根据A值收集组分₂₈₀ 为获得最佳效果。

时间（分钟）	缓冲液 A (%)	缓冲液 B (%)
0	97	3
10	97	3
25	35	65
55	5	95
65	5	95
70	97	3

表1：Bla g 1的洗脱方案。该表格展示了使用C18高效液相色谱柱分离Bla g 1时所采用的梯度洗脱程序。

4. 将样品分装至玻璃试管中，每管装液量不超过试管一半（约 4 mL）。用石蜡膜封口，并在封口膜上打两个孔，以便通气。
   1. 单独准备一份 1 mL 的分装样品（测试分装样），用于测定预期产量。
5. 将样品和测试分装样置于 -80 ˚C 冰箱中冷冻 1 小时，或浸入液氮中进行冷冻。若使用后者，必须持续旋转试管，以避免因液体冷冻时体积膨胀导致试管破裂。
6. 使用冻干机对去脂蛋白样品进行干燥。干燥后的蛋白质可在密封容器中于 4 ˚C 保存数月。

4. Apo-Bla g 1 及载荷货物的 Bla g 1 的重建

1. 确定预期的Bla g 1产量。
   1. 将冻干、去脂质（HPLC后）的测试样品重悬于5 mL复性缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4，100 mM NaCl，2% DMSO）中。
   2. 将混合物置于水浴中（500 mL 烧杯内含 250 mL 水，加磁力搅拌子并置于加热板上）加热至 95 ˚C。间歇涡旋振荡溶液，并在 95 ˚C 下孵育 0.5–1 h。
   3. 移去热源，让水浴缓慢冷却至室温（约1小时）。如有需要，退火后的蛋白质可在4 ˚C条件下以此形式保存过夜。
   4. 将退火后的Bla g 1-脂质混合物通过0.22 µm针头滤器过滤，以去除颗粒物。
   5. 使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置，按照3.1节所述方法，将过滤后的蛋白质在pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中置换缓冲液3次，以去除残留的游离脂肪酸和有机溶剂。
   6. 使用BCA法或其他首选方法（如紫外吸收法）测定蛋白质浓度。利用该浓度确定剩余Bla g 1分装样品的预期产量。
2. 重悬Apo-  或负载货物的Bla g 1
   1. 按照4.1.1节所述，将Bla g 1分装样品重悬于复性缓冲液中。
   2. 为获得所需的产量，重复步骤 4.1.2–4.1.6 以制备 Apo-Bla g 1。
   3. 为使Bla g 1负载脂肪酸，需在甲醇或DMSO中配制所需脂肪酸货物的20 mM储备液。  然后，跳至步骤 4.2.5。
   4. 为使Bla g 1负载磷脂，将所需货物溶于氯仿中，配制成浓度为10 mg/mL的储备液，置于玻璃试管内。
      1. 将氯仿蒸发以形成脂质膜。向试管中加入PBS，使最终磷脂浓度为20 mM。
         警告：氯仿吸入或吞食有害。使用时应在化学通风橱中操作，或在通风不足时佩戴呼吸器。操作时需佩戴腈类手套、实验服和护目镜。使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。
      2. 在脂质货物的相变温度以上加热，使脂质膜水化，并涡旋至溶液变浑浊。注意，某些货物可能需要超声处理才能完全重悬和充分水化。
      3. 若需超声处理，将试管置于水浴超声仪（100 W，42 kHz）中，以最大功率超声至货物完全重悬。或者，可使用探头式超声仪（见2.6节描述），以10–20%的功率和50%占空比进行操作。
         警告：超声处理使用高频声波，可能损伤听力。请使用降噪个人防护装备（耳塞或耳罩）。如有可能，将超声仪置于隔音柜或隔音室内。
   5. 加入所需的脂肪酸或磷脂配体，使其相对于Bla g 1的摩尔浓度达到20倍过量，该比例基于4.1步骤中确定的预期产量计算。此步骤中加入的有机溶剂总体积不应超过2%。涡旋混匀。
      注意：1 L BL21 DE3 细胞通常可获得约 0.25–0.4 nmol 蛋白，相当于每管约 400 µM 配体。
   6. 按照4.1节所述对蛋白质进行退火处理。

5. 通过³¹P-NMR 验证磷脂货物的去除/装载

1. 使用3.1节所述的离心过滤装置，将载脂蛋白或负载配体的Bla g 1样品浓缩至>100 µM。
2. 用PBS缓冲液重悬参考磷脂，终浓度分别为2、1.5、1、0.5和0.25 mM。
3. 用胆酸盐缓冲液（100 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，10% w/v 胆酸）将样品按1:1比例稀释，总体积约为600 µL。
   注：此步骤使用胆酸盐以完全提取并溶解Bla g 1疏水腔中的脂质。这可确保不同样品中磷脂头部基团周围的化学环境一致，从而能够利用³¹P-NMR进行定量分析。胆酸盐的使用可替换为 氯仿/甲醇，方法如前所述¹⁵。
4. 使用宽带探头采集胆酸盐溶解后的Bla g 1样品及参考磷脂标准品的1D ³¹P-NMR谱图。
   注：本研究中的³¹P-NMR谱图采用600 MHz核磁共振仪获得。然而，先前使用类似技术的研究表明，在磁场强度低至150–200 MHz时仍可获得可接受的灵敏度¹⁵。
5. 使用适当的软件处理所得数据¹⁶。
6. 使用首选的NMR分析软件获取峰强度¹⁷。
7. 将Bla g 1的³¹P-NMR谱图与参考磷脂样品的谱图进行比较，根据可见峰的化学位移（或峰的缺失）确认内源性结合配体的去除和/或目标配体的结合。
   1. 通过比较Bla g 1谱图与磷脂参考标准品的峰强度，确认完全结合的化学计量比。

6. 确认美洲大蠊原肌球蛋白（Bla g 1）的折叠

1. 在CD缓冲液（100 mM KH₂PO₄，缓冲液pH 7.5）中配制0.5 µM的Bla g 1样品。将2 mL样品加入带有磁力搅拌子的10 mm CD比色皿中。
2. 测定Bla g 1的圆二色（CD）光谱，以确认其二级结构已正确复性。确保光电倍增管（PMT）电压 不超过制造商推荐值（通常为1 kV）。
   1. 在25 ˚C下，以0.2 nm的数据间距、20 nm/s的扫描速度和1 s的数据积分时间，测定260–200 nm范围内的CD信号。
3. 以0.5 ˚C/min的升温速率，将CD样品池的温度从25 ˚C升至95 ˚C。启动磁力搅拌子，确保样品温度均匀。
4. 在222 nm处监测CD信号，每升高2 ˚C记录一次读数。
5. 将所得数据拟合为两态Boltzmann曲线，以确定蛋白的熔解温度。由于Bla g 1具有高度稳定性，其熔解温度（MT₂₅）定义为蛋白在222 nm处的CD信号值较初始值下降25%时所对应的温度。

结果

通过亲和层析，可轻松将重组的 GST-Bla g 1 纯化至较高纯度（图 1A），每升细胞培养物可获得约 2–4 mg 的产量。在 4 °C 下用 TEV 蛋白酶过夜孵育，足以去除 GST 标签，最终产物大小约为 24 kDa。需要注意的是，此实验中流出组分和洗涤组分中含有较大量的 GST-Bla g 1，表明谷胱甘肽树脂的结合能力已超载。增加树脂用量或采用多次上样与洗脱循环可解决此问题。

将Bla g 1上样至反相C18色谱柱可得到特征性的洗脱图谱（图1B），在约50%缓冲液B处出现两个较大的峰，另有一个较大的峰出现在约75%缓冲液B处。对所得组分进行SDS-PAGE分析表明，前者对应于被切割的GST标签，而后者对应于Bla g 1。偶尔在中间位置会出现第三个较小的峰，对应于残留的未切割GST-Bla g 1。通过增加切割反应中使用的TEV蛋白酶用量或延长孵育时间，可消除这种未切割产物的存在。尽管切割不完全会降低产率，但C18柱上的分离效果足以确保最终Bla g 1产物的纯度不受影响。反相HPLC的一个结果是，最...

讨论

本研究中描述的方案已成功应用于系统研究美洲大蠊过敏原Bla g 1的脂质结合特性。该研究揭示了货物分子结合、热稳定性与内体加工过程之间的相关性，其中内体加工过程与一种已知T细胞表位的生成减少相关，这可能对免疫原性具有重要意义^9,18。除Bla g 1外，其他过敏原如Pru p 3和Bet v 1在使用标准的亲和层析和尺寸排阻层析方法纯化时，也被证实能够保留其内源性结合的货物分子^{13,19,20,21,22}。这些非预期结合的分子可能以类似方式改变这些蛋白质的生物物理和免疫学特性，凸显了开发确保完全去脂化技术的必要性，例如本文所介绍的方法。

尽管已...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bla g 1 基因	Genescript	N/a	定制基因合成服务。GenBank 登录号 AF072219，残基 34-216
亲和纯化天然 Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor Biotechnologies	N/a	定制订购
Agilent 1100 系列高效液相色谱系统	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	紫外检测器、泵和脱气装置
Agilent DD2 600 MHz 核磁共振波谱仪	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Amicon	UFC-1008
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
苯甲酸酶	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
宽带 5 mm Z 梯度探头	Varian	N/a
ChemStation for LC（软件）	Agilent	N/a
cOmplete Mini 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
二硬脂酰基磷脂酰胆碱（18:0 PC）	Avanti Polar Lipids	850365C
大肠杆菌 BL21 DE3 细胞	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 冷冻干燥系统	Labconco	7750000
谷胱甘肽树脂	Genescript	L00206
还原型谷胱甘肽	Fisher Scientific	BP25211
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD 圆二色光谱仪	Jasco	J-815
Millex 注射器滤器装置	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe（软件）	Delaglio 等	N/a	Delaglio, F. 等. Nmrpipe - 基于 Unix 管道的多维谱图处理系统. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995)。
NMRViewJ（软件）	Johnson 等	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View：用于核磁共振数据可视化与分析的计算机程序. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994)。
油酸	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA 蛋白定量测定试剂盒	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm 高效液相色谱柱	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 真空泵	Varian	VP-195
胆酸钠水合物	Sigma-Aldrich	C6445
棕榈酸钠	Sigma-Aldrich	P9767
硬脂酸钠	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ（软件）	Varian	N/a