脂结合蛋白和过敏原中内源性配体的去除与替换

摘要

本方案描述了通过反相高效液相色谱结合热退火技术，从过敏原中去除内源性脂质，并用用户指定的配体进行替换的方法。³¹P-核磁共振和圆二色光谱可用于快速确认配体的去除与加载，以及过敏原天然结构的恢复。

摘要

许多主要过敏原能够结合疏水性类脂分子，包括 Mus m 1、Bet v 1、Der p 2 和 Fel d 1。这些配体被强烈保留，并可能通过直接刺激免疫系统或改变过敏原蛋白的生物物理特性，影响致敏过程。为了控制这些变量，需要采用技术手段去除内源性结合的配体，并在必要时替换为成分明确的脂质。蟑螂过敏原 Bla g 1 具有一个大的疏水性空腔，使用传统方法纯化时，该空腔会结合多种内源性脂质的混合物。本文介绍一种方法，通过反相高效液相色谱（HPLC）去除这些脂质，随后进行热退火处理，从而获得无配体（Apo-form）的 Bla g 1，或重新加载用户定义的脂肪酸或磷脂货物。将该方案与生化检测相结合发现，脂肪酸货物显著改变了 Bla g 1 的热稳定性和蛋白酶抗性，进而影响 T 细胞表位的生成速率及过敏原性。这些结果强调了在研究来自重组或天然来源的过敏原时，采用此类脂质去除/重加载方案的重要性。该方案可推广至其他过敏原家族，包括脂质结合蛋白（lipocalins，如 Mus m 1）、PR-10 蛋白（如 Bet v 1）、MD-2 样蛋白（如 Der p 2）和 uteroglobin（如 Fel d 1），为研究脂质在过敏反应中的作用提供了有力工具。

引言

对过敏原数据库的调查显示，过敏原仅存在于所有已知蛋白质家族的2%中，这表明共同的功能和生物物理特性可能有助于致敏性¹。在这些特性中，结合脂质货物的能力在过敏原中显著富集，提示这些脂质货物可能影响致敏过程¹。事实上，已有研究显示，巴西坚果过敏原Ber e 1需要与其内源性脂质共同施用才能发挥其完全的致敏潜力²。这些脂质可能直接刺激免疫系统，例如尘螨过敏原Der p 2和Der p 7，二者在结构上均与脂多糖（LPS）结合蛋白具有高度同源性^3,4,5。基于这一观察结果，有研究提出Der p 2和Der p 7可能结合细菌脂质，并通过TLR4介导的信号通路直接激活宿主免疫系统，从而促进致敏过程^5,6。此外，内源性结合的脂质也可能改变过敏原 蛋白自身的生物物理特性。例如，芥菜过敏原Sin a 2和花生过敏原Ara h 1与磷脂囊泡相互作用的能力显著增强了它们对胃和内体降解的抵抗能力⁷；而桦树花粉主要过敏原Bet v 1与配体结合后，则改变了....

方案

1. Bla g 1 克隆

1. 获取代表MA结构域单个重复序列的蟑螂过敏原Bla g 1.0101（第34-216位氨基酸）的基因。为简便起见，本研究中将使用Bla g 1表示该单个重复序列，而非完整的Bla g 1.0101转录本。
2. 将Bla g 1基因亚克隆至目标载体中。本研究中，将含有N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签并连接烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点的基因插入pGEX载体中进行表达，具体方法如前所述¹¹。
3. 将Bla g 1 pGEX载体转化至BL21 DE3 E. coli细胞中。
   1. 制备浓度为10 ng/µL的目标载体储备液。
   2. 取1 µL浓度为10 ng/µL的DNA储备液与50 µL BL21 DE3细胞（按制造商提供）混合。
   3. 将BL21 DE3与DNA的混合物置于冰上孵育30分钟，随后转移至42 ˚C水浴中1分钟，立即再次放回冰上继续孵育1分钟。
   4. 向细胞中加入200 µL LB培养基，并在37 ˚C下额外孵育1小时。
   5. 将转化后的细胞涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 ˚C过夜培养。

2. 初步表达与纯化

结果

通过亲和层析，可轻松将重组的 GST-Bla g 1 纯化至较高纯度（图 1A），每升细胞培养物可获得约 2–4 mg 的产量。在 4 °C 下用 TEV 蛋白酶过夜孵育，足以去除 GST 标签，最终产物大小约为 24 kDa。需要注意的是，此实验中流出组分和洗涤组分中含有较大量的 GST-Bla g 1，表明谷胱甘肽树脂的结合能力已超载。增加树脂用量或采用多次上样与洗脱循环可解决此问题。

将Bla g 1上样至反相C18色谱柱可得到特征性的洗脱图谱（图1B），在约50%缓冲液B处出现两个较大的峰，另有一个较大的峰出现在约75%缓冲液B处。对所得组分进行SDS-PAGE分析表明，前者对应于被切割的GST标签，而后者对应于Bla g 1。偶尔在中间位置会出现第三个较小的峰，对应于残留的未切割GST-Bla g 1。通过增加切割反应中使用的TEV蛋白酶用量或延长孵育时间，可消除这种未切割产物的存在。尽管切割不完全会降低产率，但C18柱上的分离效果足以确保最终Bla g 1产物的纯度不受影响。反相HPLC的一个结果是，最.......

讨论

本研究中描述的方案已成功应用于系统研究美洲大蠊过敏原Bla g 1的脂质结合特性。该研究揭示了货物分子结合、热稳定性与内体加工过程之间的相关性，其中内体加工过程与一种已知T细胞表位的生成减少相关，这可能对免疫原性具有重要意义^9,18。除Bla g 1外，其他过敏原如Pru p 3和Bet v 1在使用标准的亲和层析和尺寸排阻层析方法纯化时，也被证实能够保留其内源性结合的货物分子^{13,19,20,21,22}。这些非预期结合的分子可能以类似方式改变这些蛋白质的生物物理和免疫学特性，凸显了开发确保完全去脂化技术的必要性，例如本文所介绍的方法。

尽管已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bla g 1 基因	Genescript	N/a	定制基因合成服务。GenBank 登录号 AF072219，残基 34-216
亲和纯化天然 Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor Biotechnologies	N/a	定制订购
Agilent 1100 系列高效液相色谱系统	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	紫外检测器、泵和脱气装置
Agilent DD2 600 MHz 核磁共振波谱仪	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Amicon	UFC-1008
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
苯甲酸酶	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
宽带 5 mm Z 梯度探头	Varian	N/a
ChemStation for LC（软件）	Agilent	N/a
cOmplete Mini 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
二硬脂酰基磷脂酰胆碱（18:0 PC）	Avanti Polar Lipids	850365C
大肠杆菌 BL21 DE3 细胞	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 冷冻干燥系统	Labconco	7750000
谷胱甘肽树脂	Genescript	L00206
还原型谷胱甘肽	Fisher Scientific	BP25211
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD 圆二色光谱仪	Jasco	J-815
Millex 注射器滤器装置	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe（软件）	Delaglio 等	N/a	Delaglio, F. 等. Nmrpipe - 基于 Unix 管道的多维谱图处理系统. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995)。
NMRViewJ（软件）	Johnson 等	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View：用于核磁共振数据可视化与分析的计算机程序. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994)。
油酸	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA 蛋白定量测定试剂盒	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm 高效液相色谱柱	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 真空泵	Varian	VP-195
胆酸钠水合物	Sigma-Aldrich	C6445
棕榈酸钠	Sigma-Aldrich	P9767
硬脂酸钠	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ（软件）	Varian	N/a