本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。
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本文内容
摘要
摘要
生物打印正成为一种前景广阔的工具，可用于构建更准确模拟体内组织结构关键特征的三维人类癌症模型。在当前逐层挤出式生物打印技术中，单个细胞与复杂的时空信号一同被包裹在生物墨水中，以促进层次性组织的自组装。然而，这种生物制造技术依赖于细胞、生物墨水以及生化和生物物理信号之间的复杂相互作用。因此，自组装过程可能需要数天甚至数周时间，通常需要特定的生物墨水，且在涉及多种细胞类型时未必总能成功。为此，我们开发了一种新技术，可直接将预先形成的三维乳腺上皮球体在多种生物墨水中进行生物打印。打印后的预形成三维乳腺上皮球体在打印后仍保持其活性和极性结构。此外，我们将这些三维球体打印到血管内皮细胞网络上，构建了一种共培养模型。因此，这种新型生物打印技术相较于传统方法，能够以更低的成本和更高的灵活性快速构建更具生理相关性的三维人类乳腺模型。该多功能生物打印技术可进一步推广应用于其他组织的三维建模，并适用于更多类型的生物墨水。
引言
三维体外血管化肿瘤模型是研究癌症生长和转移机制的重要工具。特别是对于乳腺癌，乳腺上皮细胞在Matrigel中培养时可形成极化的球状结构，更接近体内乳腺腺泡的结构1,2,3,4,5,6,7,8。三维乳腺上皮细胞培养也影响细胞功能，与二维培养相比，三维培养在表皮生长因子（EGF）受体调控8,9、癌基因功能（如ErbB2）10、生长与凋亡信号传导11,12以及化疗耐药性13,14等方面均表现出差异。血管内皮细胞在三....
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方案
1. 乳腺上皮细胞培养与检测培养基
- MCF10A 乳腺上皮细胞
注：该非致瘤性永生化乳腺上皮细胞系来源于患有纤维囊性疾病的患者43。该细胞不表达雌激素受体。- 配制 20 μg/mL 表皮生长因子（EGF）：将 100 μg 冻干 EGF 溶解于 500 µL 无菌 dH2O 中，配制成 200 μg/mL EGF 溶液。取 500 μL 的 200 μg/mL EGF 溶液加入 4.5 mL 无菌 0.1% BSA（溶于 dH2O）中，得到 20 μg/mL EGF 储存液。将配制好的 20 μg/mL EGF 分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 12 个月。
- 配制 500 μg/mL 氢化可的松：将 1 mg 氢化可的松溶解于 1 mL 无水乙醇（200 证明度）中。向此溶液中加入 1 mL 无菌 DMEM F:12 培养基，配制成 500 μg/mL 氢化可的松储存液。将氢化可的松储存液分装后于 -80 °C 保存，最长可保存 12 个月。
- 配制 10 μg/mL 霍乱毒素：将 1 mg 霍乱毒素冻干粉溶解于 1 mL 无菌 dH2O 中，配制成 1 mg/mL 霍乱毒素储存液。将霍乱毒素储存液分装后于 -80 °C 保存，最长可保存 12 个月。
- 配制生长培养基：在 500 mL ....
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结果
乳腺上皮细胞在基质溶液上培养5-8天，并在含有2%基质溶液的培养基中培养后，应能自组织形成三维球状体。非致瘤性MCF10A乳腺上皮细胞球状体应呈圆形，具有中空的中心结构，整合素α6极性分布于球状体外缘（图1，插图显示中空中心）。高侵袭性的MDA-MB-231乳腺癌上皮细胞则形成不规则的球状体。球状体直径在约100–300 µm时可用于实验。当球状体过大并相互靠近时，会融合形成巨大的多细胞球状体（megaspheroids）。此外，若MDA-MB-231乳腺上皮细胞球状体在Matrigel培养体系中维持时间过长，可能出现细胞从球状体向外迁移的现象。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在稀疏、无血清培养条件下培养6-8小时后应自组织形成管状网络。样本将呈现多细胞节点，并由1-3个细胞并列组成的条状结构相互连接。可通过相差显微镜观察HUVEC网络，若使用Cell Tracker和Hoescht标记，则也可通过共聚焦显微镜观察（图2）。可使用ImageJ血管生成分析器对网络的.......
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讨论
本方案首次实现了在三维结构中对类球体进行生物打印，以与同样具有三维结构的内皮细胞共培养。关键实验步骤包括乳腺上皮类球体和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）网络的初始形成。在对乳腺上皮类球体进行换液时必须格外小心，因为它们容易从基质溶液中被破坏。同样，在将乳腺上皮类球体通过移液从基质溶液中转移并混入网络结构时，也必须谨慎操作。HUVEC网络的接种密度不宜过高，培养时间不应超过16小时，否则将分别形成单层细胞或发生细胞死亡。最后，所有生物打印操作均应在37 °C的无菌环境中进行，以最大程度地维持细胞活性。
除了Matrigel外，乳腺上皮类球体还可使用多种生物墨水进行生物打印，包括海藻酸盐以及海藻酸盐-胶原蛋白混合物。我们已证明，在基于海藻酸盐的生物墨水中打印的类球体具有活性，并能维持其形态结构41。因此，尽管本文介绍的是基于基质溶液型生物墨水的生物打印方法，但其他成本更低、操作更简便的生物墨水同样可行。我们还成功使用了其他乳腺癌细胞系，包括MCF-7和基因修饰的MCF10A-NeuN细胞38<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：1R01HL140239-01，授予AMC）。我们感谢德雷塞尔大学细胞成像中心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37°C 培养箱，5% CO2 和 95% 湿度 | Sanyo | MCO-20AIC | 细胞培养 |
| 3D 生物打印机 | 定制 | 无 | 用于生物打印 |
| 8 孔培养板 | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | 用于接种球状体 |
| 25 号针头 | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | 生物打印用注射器针头 |
| 无水乙醇（200 证明） | Sigma, St. Louis, MO | E7023-500ML | 培养基成分的重悬 |
| Affinipure F(ab′)2 片段山羊抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | 免疫荧光二级封闭抗体 |
| Alexa Fluor 488（1:200） | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | 免疫荧光二级抗体 |
| 牛胰岛素 | Sigma, St. Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A 培养基添加剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma, St. Louis, MO | A2153-500G | 免疫荧光封闭剂 |
| Falcon 70 µm 细胞滤筛 | Corning, Corning, NY | 352350 | 去除大块或聚集的球状体 |
| CellTracker™ Red CMTPX 染料 | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | HUVEC 管预染色 |
| 小型离心机 | Hermle- Labnet, Edison, NJ | Z206A | 用于细胞离心 |
| 霍乱毒素 | Sigma, St. Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A 培养基添加剂 |
| 15 mL 锥形管 | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | 收集和重悬细胞 |
| Countess II-FL 细胞计数仪 | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | 细胞计数 |
| 玻璃移液管（10 mL） | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | 细胞重悬 |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A 基础培养基 |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 基础培养基 |
| 内皮基础培养基-2（EBM-2） | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC 基础培养基 |
| 内皮生长培养基-2（EGM-2） | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | 配套 Bulletkit（含生长因子） |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 标记 MDA-MB-231 球状体 | |
| 胎牛血清 | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 培养基添加剂 |
| 羊血清 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | 免疫荧光标记组分 |
| 甘氨酸 | Sigma, St. Louis, MO | G8898-500G | 免疫荧光缓冲液组分 |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | 细胞核染色（免疫荧光） |
| 马血清 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A 培养基添加剂 |
| 氢化可的松 | Sigma, St. Louis, MO | H0888-5G | MCF10A 培养基添加剂 |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | Cell applications, San Diego, CA | 200-05f | 内皮细胞系 |
| 整合素 α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | 免疫荧光球状体标记组分 |
| 活/死细胞检测试剂盒 | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | 细胞活力检测（活/死细胞染色） |
| LSM 700 共聚焦显微镜 | Zeiss, Thornwood, NY | 用于细胞成像 | |
| Matrigel — 生长因子减少型，10 mg/mL | VWR, Radnor, PA | 354230 | 球状体形成 |
| MCF10A 细胞 | ATCC | CRL-10317 | 乳腺细胞系 |
| MDA-MB-231 细胞 | ATCC | HTB-26 | 乳腺细胞系 |
| 多聚甲醛 | Sigma, St. Louis, MO | 158127-500G | 细胞固定剂 |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC 培养基添加剂 |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | 胰酶消化前细胞洗涤缓冲液 |
| 10× 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | 免疫荧光缓冲液组分 |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | 免疫荧光封片介质 |
| 重组人表皮生长因子（EGF） | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A / 检测培养基组分 |
| 叠氮化钠 | Sigma, St. Louis, MO | S2002-25G | 免疫荧光缓冲液组分 |
| 无菌注射器（10 mL） | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | 生物打印过程 |
| 组织培养皿（10 cm） | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | 单层细胞培养 |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO | T8787-250ML | 免疫荧光缓冲液组分 |
| 台盼蓝 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | 细胞计数添加剂 |
| 胰酶-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | 细胞解离 |
| Tween-20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | 免疫荧光缓冲液组分 |
| 血管内皮生长因子（VEGF165） | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC 管形成添加剂 |
| Volocity 6.3 细胞成像软件 | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z 轴图像压缩工具 |
参考文献
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S.
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