通过视运动反应进行视觉功能的行为评估，通过Y迷宫对糖尿病大鼠的认知功能进行行为评估

Summary

糖尿病导致的眼睛和大脑的神经变性可以通过对啮齿动物进行的行为测试来观察。Y迷宫（空间认知的量度）和光运动反应（视觉功能的度量）都提供了对潜在诊断和治疗的洞察。

Abstract

视运动反应和Y迷宫分别是用于评估视觉和认知功能的行为测试。视神经膜反应是一种有价值的工具，用于跟踪许多视网膜疾病模型（包括糖尿病视网膜病变）中空间频率（SF）和对比度敏感性（CS）阈值随时间的变化。同样，Y迷宫可用于监测影响中枢神经系统的许多疾病模型中的空间认知（通过自发交替测量）和探索性行为（由许多条目测量）。光运动反应和Y迷宫的优点包括灵敏度，测试速度，先天反应的使用（不需要训练），以及在清醒（非麻醉）动物身上进行的能力。在这里，描述了光运动反应和Y迷宫的协议，以及它们在I型和II型糖尿病模型中显示的使用示例。方法包括准备啮齿动物和设备，光运动响应和Y迷宫的性能以及测试后数据分析。

Introduction

超过 4.63 亿人患有糖尿病，使其成为全球最大的疾病流行之一¹。糖尿病引起的严重并发症之一是糖尿病视网膜病变（DR），这是美国工作年龄成年人失明的主要原因²。在未来 30 年内，面临 DR 风险的人口比例预计将翻一番，因此在早期阶段找到诊断 DR 的新方法以预防和缓解 DR 发展至关重要³。DR通常被认为是一种血管疾病^4，5，6。然而，现在有证据表明在血管病理学之前视网膜中存在神经元功能障碍和细胞凋亡，DR被定义为具有神经元和血管成分^{4，5，6，7，8，9}。诊断DR的一种方法是检查视网膜中的神经异常，视网膜组织可能比其他神经组织更容易受到糖尿病的氧化应激和代谢应变^的影响10。

认知和运动功能的下降也发生在糖尿病中，并且通常与视网膜变化有关。与对照组参与者相比，II型糖尿病患者的基线认知表现较差，认知能力下降程度更高¹¹。此外，视网膜已被确定为中枢神经系统的延伸，病理可以表现在视网膜¹²中。临床上，视网膜与大脑之间的关系已经在阿尔茨海默氏症和其他疾病的背景下进行了研究，但糖尿病并不常见^{12，13，14，15，16}。糖尿病进展过程中大脑和视网膜的变化可以使用动物模型进行探索，包括STZ大鼠（I型糖尿病的模型，其中毒素，链脲佐菌素或STZ用于损害胰腺β细胞）和Goto-Kakizaki大鼠（II型糖尿病的多基因模型，其中动物在3周龄左右自发地发展高血糖）。在该协议中，提供了Y迷宫和视运动反应的描述，以分别评估糖尿病啮齿动物的认知和视觉变化。视运动反应 （OMR） 通过监测特征反射性头部跟踪运动来评估空间频率（类似于视敏度）和对比度灵敏度，以测量每只眼睛的视觉阈值¹⁷。空间频率是指条形的厚度或细度，对比度灵敏度是指条形和背景之间的对比度（图1E）。同时，Y迷宫测试短期空间记忆和探索功能，通过自发的交替和通过迷宫的手臂进入观察到。

这两种测试都可以在清醒的非麻醉动物中进行，并且具有利用动物先天反应的优点，这意味着它们不需要训练。两者都是相对敏感的，因为它们可以用来检测啮齿动物糖尿病进展的早期缺陷，并且是可靠的，因为它们产生的结果与其他视觉，视网膜或行为测试相关。此外，将OMR和Y迷宫与视网膜电图和光学相干断层扫描等测试结合使用，可以提供关于视网膜，结构和认知变化何时在疾病模型中相对发展的信息。这些检查可能有助于识别由糖尿病引起的神经变性。最终，这可能导致新的诊断方法，在进展的早期阶段有效地识别DR。

用于开发该协议的OMR和Y迷宫系统在 材料表中进行了描述。Prusky等人^先前对OMR的研究和Maurice等人对Y迷宫^的研究被用作开发该协议的起点。

Protocol

所有程序均由亚特兰大退伍军人事务机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南（NIH出版物，^第 8版，2011年更新）。

1. 光运动响应 （OMR）

1. 设置 OMR 设备（材料表中有关设备和软件的详细信息）
   1. 为啮齿动物选择适当大小的平台:小鼠，大鼠或大型/受损大鼠（图1A）。
   2. 打开OMR软件，该软件应打开一个窗口，其中包含多个选项选项卡和OMR/虚拟鼓内部的实时视频源（图1B）。根据需要使用摄像机放大或缩小，以便平台及其周围环境可见。
   3. 请注意实时图像左侧的图标（图1C）。单击星号图标和旋转条纹图标，以便绿色星号和绿色旋转条纹从实时源中消失。
   4. 单击 指南针图标 ，以便显示一个绿色圆圈和两条垂直线。拉伸绿色圆圈，使其与平台上的黑色圆圈完美对齐，这将确保OMR完全对齐。
   5. 单击 指南针图标 ，因为在测试期间不必看到圆圈。单击 绿色星号图标 和 绿色旋转条纹图标 以使它们重新出现。请注意，绿色条纹的旋转方向与鼓中的条纹相同，使研究人员能够知道条纹的方向。
   6. 单击" 测试 "选项卡。在" 测试"下，单击" 心理物理学 "选项卡。在 阈值下，选择 频率 以测量空间频率。
      注意:OMR 软件使用楼梯范例自动计算空间频率 （SF）。对比度将保持在100%。
   7. 在" 测试"下，单击" 预设 "选项卡。选择鼠标 ^{18 或 Rat20} 的默认设置。
   8. 在" 测试"下，单击" 消隐 "选项卡。选中 "跟踪时空白 "框，每当鼠标右键单击时，它将暂停鼓中的条纹/空白计算机屏幕。
   9. 单击" 结果 "选项卡，这是显示测试结果的位置。
2. 评估空间频率
   1. 将啮齿动物放在虚拟现实室中心的圆形平台上，该室由四个计算机监视器组成，显示垂直正弦波光栅以12°/s的速度环绕腔室（图1D）。
   2. 请注意，位于腔室顶部的摄像机正在将啮齿动物的行为实时投影到计算机监视器上。
   3. 寻找啮齿动物头部在光栅顺时针或逆时针方向移动时是否存在反射动作。确保图示条在程序中可见 - 这些条形图将显示光栅运动的方向。
      1. 注意啮齿动物的头部与光栅相同的方向移动。等到有一个平稳的追逐，而不是不稳定的头部运动爆发，才算作跟踪。
      2. 根据需要单击" 是" 或" 否 "。请注意，SF 将从 0.042 cyc/deg 开始，并按"是"和"否"进行调整，以变得更容易或更困难（图 1E）。如果由于意外或错误地单击"是"和"否"而需要重置测试，请单击" 重置 "。
   4. 在对啮齿动物进行测试时，请确保将星号放在啮齿动物的头部上方。
      注意:这有两个效果:1）它保持正确的空间频率。例如，如果星号位于肩膀之间，则空间频率将较低，条形将更容易看到，从而导致错误的高分。2）对于头部有轻微运动的啮齿动物，星号可以更容易地判断头部是否实际在移动。
   5. 注意系统在达到啮齿动物的空间频率时说"完成"。请注意，" 是" 和" 否 "按钮将不再可单击。
   6. 单击" 结果 "选项卡，这将显示左眼、右眼和组合眼的空间频率。
      注意:有时软件的设置是翻转结果，即右眼报告为左眼，左眼报告为右眼。这是在评估青光眼模型中只有一只眼睛病变的啮齿动物时发现的。
3. 评估对比度灵敏度
   注意:对比度灵敏度测试可以在空间频率测量步骤后立即进行，或者如果啮齿动物在空间频率测试后出现疲劳，则可以在同一天或另一天单独进行（如果仅测试对比度灵敏度，请遵循步骤1-2.2）。
   1. 单击" 测试 "选项卡，然后单击" 心理物理学 "选项卡。在 "阈值"下，选择" 对比度 （单）"以测量对比度灵敏度。
   2. 同样使用楼梯范例，在对比度灵敏度（CS）曲线的峰值处开始SF常数的光栅。为此，请单击" 刺激 "选项卡，然后单击" 光栅 "选项卡。在 "空间频率 "框中，为大鼠键入 0.064 ，为小鼠键入 0.103 。
   3. 从100%开始对比度，并寻找与空间频率测试期间相同的反射性头部运动。请注意，随着测试的进展，对比度会降低，直到啮齿动物不再对刺激有反射性的头部运动（图1E）。
   4. 注意系统是否显示"完成"，一旦啮齿动物不再对视觉刺激做出反应并且达到对比度灵敏度阈值， " 是"和" 否 "按钮将不再可点击。单击" 结果 "选项卡，其中将列出左眼、右眼和组合眼的对比度灵敏度。
4. 执行测试后分析
   1. 对于糖尿病视网膜病变研究，其中两只眼睛预计具有相似的缺陷，请使用综合评分（左右眼的平均值）进行分析。对于对眼睛造成差异性损伤（即原始细胞损伤或青光眼）的模型，请保持左眼和右眼数据分开。
   2. 对于"空间频率"，请使用原始分数（" 结果 "选项卡中的数据）进行分析，并按组（即糖尿病患者、对照组等）对这些分数一起平均。
   3. 对于"对比度敏感度"，请使用原始值通过迈克尔逊对比度计算报告的对比度灵敏度，该对比度来自之前对屏幕亮度的测量值。

2. Y迷宫

1. 准备啮齿动物进行测试
   1. 在测试之前，使啮齿动物适应房间30分钟。
      注意:研究人员可以留在房间里开着灯，但在此期间应保持沉默。
   2. 用消毒液清洁Y迷宫，对动物安全，并用纸巾擦去所有消毒液。确保迷宫是干燥的。
2. 进行Y迷宫
   1. 将Y迷宫的初始臂标记为B，将其他2个臂标记为A和C（图2A）。将一只啮齿动物放在靠近Y迷宫中心的最靠近研究人员（手臂B）的手臂上。放置啮齿动物后，启动计时器（ 材料表中有关迷宫和计时器的详细信息）。
      1. 让每只啮齿动物探索Y迷宫8分钟。在此期间进行录音并记下任何观察结果。坐在离迷宫几英尺远的地方，同时让它保持在视线范围内，避免发出任何噪音。
      2. 将起始位置记录为A，每次啮齿动物进入新手臂时，记录啮齿动物的新位置（图2B）。将条目定义为啮齿动物的所有四肢都在其中一个手臂中。
      3. 注意啮齿动物隐藏并保持静止在迷宫的一只手臂上。如果啮齿动物在同一位置停留超过60秒，并且似乎没有表现出探索行为，请将啮齿动物向Y迷宫的中心移动，然后继续试验。
   2. 每只啮齿动物后，取出所有粪便并用消毒液清洁迷宫。
      1. 确保用纸巾擦去所有消毒溶液，并且迷宫完全干燥，然后再将下一只啮齿动物放入迷宫中。
3. 计算自发替和探索性行为
   1. 将探索性行为计算为 8 分钟内所做的条目总数。
   2. 计算通过自发交替测量的空间认知:
      成功交替的次数/（参赛作品总数 - 2）
      1. 当啮齿动物依次移动到三个不同的位置时，定义成功的交替（例如:ABC，CAB，BCA等）。记下每个成功的交替（图2B）。
      2. 如果运动被记录为ACABCABABCABC，则在计算自发交替时忽略两个初始起始位置（使得分母中有11个运动）。计算准确运动的数量（准确运动 = 8）。准确率的计算公式为:8/（13 - 2） = 72.7%。

Results

如果可以从啮齿动物获得空间频率和对比度灵敏度阈值，则OMR被认为是成功的。在这里，使用OMR评估空间频率在幼稚对照Brown-Norway和Long-Evans大鼠中得到了说明，它们都是年轻（3-6个月）和老年（9-12个月）。褐-挪威大鼠通常比长埃文斯大鼠表现出更高的基线空间频率。此外，在Long-Evans大鼠中观察到对空间频率的老化影响（图3A）。使用单因素方差分析分析数据，然后进行Holms-Sidak事后比较，因为年轻和老年结果来自不同的队列。

使用OMR评估对比敏感性在接受运动干预治疗的I型糖尿病的STZ模型中得到了说明。Long-Evans大鼠被分配到四组之一:对照组，对照组+活性组，糖尿病组和糖尿病组+活性组。给予糖尿病大鼠静脉注射毒素STZ以损害胰腺β细胞并诱导高血糖。活跃的大鼠每周接受5天30分钟的跑步机运动。不活跃的老鼠有一个锁定的跑步机。在糖尿病大鼠中观察到对比敏感性的显着缺陷（图3B）。运动治疗减少了这些缺陷（

Discussion

OMR和Y迷宫允许随着时间的推移对啮齿动物的视觉功能和认知功能缺陷进行非侵入性评估。在该协议中，OMR和Y迷宫被证明可以跟踪糖尿病啮齿动物模型中的视觉和认知缺陷。

协议中的关键步骤

奥姆雷

在执行OMR以评估视觉功能时要考虑的一些重要要点是使用的测试参数，实验设计和测试时间以及执行测量的研究人员的经验。协议中更关键的步骤之一是确保正确设置参数。此外，作为设置的一部分，OMR室应在每种啮齿动物之前和之后用消毒液或其他批准的消毒剂进行清洁。同样重要的是，执行这些措施的研究人员已经过培训，并且在执行这些措施方面经验丰富。当啮齿动物平静并适应房间时，在开始实验之前将它们留在笼子里30分钟，可以看到最好的结果。同样重要的是，每当开始使用新菌株时，都要确定基线空间频率和对比度灵敏度，并注意并非所有菌株都会表现出相同的基线水平。褐-挪威大鼠的基线空间频率高于长埃文斯大鼠。同时，一些白化大鼠菌株似乎损害了空间频率^24<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics 公司		OMR 仪器 & 软件
计时器	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze 仪器	San Diego Instruments	7001-043	专门用于大鼠