通过视觉运动反应和Y迷宫评估糖尿病大鼠的视觉功能和认知功能

摘要

通过在啮齿类动物上进行的行为学测试，可以观察到糖尿病引起的眼睛和大脑的神经退行性病变。Y型迷宫实验用于评估空间认知能力，而视动反应则用于评估视觉功能，这两项检测均可为潜在的诊断和治疗提供重要信息。

摘要

视觉运动反应和Y迷宫是分别用于评估视觉和认知功能的行为学测试。视觉运动反应是一种有价值的工具，可用于追踪多种视网膜疾病模型（包括糖尿病视网膜病变）中空间频率（SF）和对比敏感度（CS）阈值随时间的变化。同样，Y迷宫可用于监测影响中枢神经系统的多种疾病模型中的空间认知能力（通过自发交替行为来衡量）和探索行为（通过进入次数来衡量）。视觉运动反应和Y迷宫的优点包括灵敏度高、检测速度快、利用动物的先天行为反应（无需训练），以及可在清醒（非麻醉）动物上进行。本文描述了视觉运动反应和Y迷宫的实验方案，并展示了其在I型和II型糖尿病模型中的应用实例。方法包括实验动物与设备的准备、视觉运动反应和Y迷宫实验的操作步骤，以及测试后的数据分析。

引言

全球有超过4.63亿人患有糖尿病，使其成为规模最大的全球性疾病流行之一¹。糖尿病引发的严重并发症之一是糖尿病性视网膜病变（DR），这是导致美国劳动年龄成年人失明的主要原因²。在未来30年内，面临DR风险的人口比例预计将会翻倍，因此迫切需要寻找能够在早期阶段诊断DR的新方法，以预防和减缓DR的发展³。传统上，DR被认为是一种血管性疾病^4,5,6。然而，随着视网膜中神经元功能障碍和细胞凋亡的证据被发现，且这些变化早于血管病理改变，目前认为DR具有神经性和血管性双重成分^4,5,6,7,8,9。诊断DR的一种方法是检测视网膜中的神经异常，视网膜作为一种组织，可能比其他神经组织更容易受到糖尿病引起的氧化应激和代谢压力的影响¹⁰。

认知功能和运动功能的下降也与糖尿病相关，且常与视网膜变化相关联。患有2型糖尿病的老年人表现出更差的基础认知水平，并且其认知功能下降程度较对照组参与者更为显著¹¹。此外，视网膜已被确认为中枢神经系统的延伸，神经系统病变可能在视网膜中显现¹²。临床上，视网膜与大脑之间的关系已在阿尔茨海默病及其他疾病背景下得到研究，但在糖尿病中的研究尚不充分^{12,13,14,15,16}。糖尿病进展过程中大脑和视网膜的变化可通过动物模型进行研究，包括STZ大鼠（一种1型糖尿病模型，通过使用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）毒素损伤胰腺β细胞）和Goto-Kakizaki大鼠（一种多基因2型糖尿病模型，动物在约3周龄时自发出现高血糖）。本实验方案提供了用于评估糖尿病啮齿类动物认知功能和视觉变化的Y迷宫实验和视动反应（optomotor response）的操作描述。视动反应（OMR）通过监测动物对视觉刺激产生的特征性反射性头部追踪运动，评估空间频率（类似于视敏度）和对比敏感度，从而测定每只眼的视觉阈值¹⁷。空间频率指条纹的粗细程度，对比敏感度指条纹与背景之间的对比度差异（图1E）。与此同时，Y迷宫用于检测短期空间记忆和探索功能，通过观察动物在迷宫臂之间的自发交替行为和进入次数进行评估。

两种测试均可在清醒、未麻醉的动物中进行，其优势在于利用了动物的先天反应，因此无需训练。这两种方法均具有较高的敏感性，可用于在啮齿类动物糖尿病进展早期检测出功能缺陷；同时具有良好的可靠性，其结果可与其他视觉、视网膜或行为学检测结果相吻合。此外，将视觉运动反应（OMR）和Y迷宫测试与视网膜电图、光学相干断层扫描等检测方法联合使用，可提供疾病模型中视网膜、结构和认知变化发生时间的相对关系信息。这些研究有助于识别由糖尿病引起的神经退行性病变。最终，这可能有助于开发出在糖尿病视网膜病变进展早期即可有效识别的新诊断方法。

用于开发本方案的OMR和Y迷宫系统详见材料表。本方案的开发以Prusky等人¹⁸关于OMR的前期研究以及Maurice等人¹⁹关于Y迷宫的前期研究为基础。

方案

所有程序均经亚特兰大退伍军人事务机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》（NIH Publications, 8^th 第2版，2011年更新

1. 视动反应（OMR）

1. 设置OMR仪器（仪器和软件的详细信息见材料表）
   1. 为啮齿类动物选择合适尺寸的平台：小鼠、大鼠或大型/行动受限的大鼠（图1A）。
   2. 打开OMR软件，软件界面应显示多个选项卡以及OMR/虚拟鼓内部的实时视频画面（图1B）。根据需要调整摄像头的缩放，确保平台及其周围环境清晰可见。
   3. 注意实时图像左侧的图标（图1C）。点击星号图标和旋转条纹图标，使绿色星号和绿色旋转条纹从实时画面中消失。
   4. 点击指南针图标，使绿色圆圈和两条垂直线出现。拉伸绿色圆圈，使其与平台上的黑色圆圈完全对齐，以确保OMR系统精确对准。
   5. 再次点击指南针图标，因为在测试过程中无需显示该圆圈。点击绿色星号图标和绿色旋转条纹图标，使它们重新显示。注意绿色条纹的旋转方向与鼓内条纹方向一致，便于研究人员判断条纹运动方向。
   6. 点击测试选项卡。在测试下点击心理物理学选项卡。在阈值下选择频率，以测量空间频率。
      注：OMR软件采用阶梯法范式自动计算空间频率（SF）。对比度将保持在100%。
   7. 在测试下点击预设选项卡。选择小鼠¹⁸或大鼠²⁰的默认设置。
   8. 在测试下点击空白选项卡。勾选跟踪时空白选项，这样当鼠标右键点击时，鼓内的条纹/计算机屏幕将暂停或变为空白。
   9. 点击结果选项卡，测试结果将在此处显示。
2. 评估空间频率
   1. 将啮齿类动物放置在虚拟现实舱中央的圆形平台上，该舱由四台计算机显示器组成，显示以12˚/s速度环绕舱体旋转的垂直正弦波光栅（图1D）。
   2. 注意位于舱体顶部的摄像头正将动物行为实时投射到计算机显示器上。
   3. 观察当光栅顺时针或逆时针移动时，动物头部是否出现或缺乏反射性动作。确保程序中显示的条形图可见——这些条形图将指示光栅移动方向。
      1. 观察动物头部是否随光栅同向移动。需等待出现平稳追踪运动，而非不规则的头部抖动，方可计为有效追踪。
      2. 根据实际情况点击是或否。注意空间频率（SF）将从0.042 cyc/deg开始，根据每次“是”或“否”的判断自动调整，使任务变易或变难（图1E）。若因误操作或错误点击“是”或“否”需重置测试，可点击重置。
   4. 在测试过程中，务必保持星号始终对准动物头部。
      注：此操作具有两个作用：1）维持正确的空间频率。例如，若星号位于肩部之间，空间频率将偏低，条纹更易看清，导致结果虚高；2）对于头部轻微移动的动物，星号有助于判断头部是否真正发生运动。
   5. 当系统提示“完成”时，表明已测得该动物的空间频率。注意此时是和否按钮将不可点击。
   6. 点击结果选项卡，将显示左眼、右眼及双眼联合的空间频率值。
      注：有时软件设置会导致结果左右颠倒，即右眼数据被报告为左眼，左眼数据被报告为右眼。此问题在评估青光眼模型中单眼损伤的动物时被发现。
3. 评估对比敏感度
   注：对比敏感度测试可在空间频率测量后立即进行，也可在同日或另一日单独进行，若动物在空间频率测试后表现出疲劳状态（若仅进行对比敏感度测试，请遵循步骤1–2.2）。
   1. 点击测试选项卡，然后点击心理物理学选项卡。在阈值下选择对比度（单次），以测量对比敏感度。
   2. 同样采用阶梯法范式，从对比敏感度（CS）曲线峰值处的空间频率（SF）恒定开始测试。为此，请点击刺激选项卡，再点击光栅选项卡。在空间频率框中，大鼠输入0.064，小鼠输入0.103。
   3. 从100%对比度开始，观察与空间频率测试中相同的反射性头部运动。注意随着测试进行，对比度将逐渐降低，直至动物不再对刺激产生反射性头部运动（图1E）。
   4. 当动物不再对视觉刺激产生反应且达到对比敏感度阈值时，系统将显示“完成”，是和否按钮将不可点击。点击结果选项卡，将列出左眼、右眼及双眼联合的对比敏感度值。
4. 进行测试后分析
   1. 在糖尿病视网膜病变研究中，若预期双眼具有相似的功能缺损，应使用联合评分（左右眼平均值）进行分析。对于导致双眼损伤差异的模型（如爆炸伤或青光眼），应分别保留左眼和右眼的数据。
   2. 对于空间频率，使用原始得分（来自结果选项卡的数据）进行分析，并按组别（如糖尿病组、对照组等）对这些得分取平均值。
   3. 对于对比敏感度，使用原始值结合先前测量的屏幕亮度，通过Michelson对比度公式计算报告的对比敏感度值。

2. Y迷宫

1. 准备啮齿类动物进行测试
   1. 在测试前将啮齿类动物在测试房间内适应30分钟。
      注意：研究人员可留在开灯的房间内，但在此期间应保持安静。
   2. 使用对动物安全的消毒液清洁Y形迷宫，并用纸巾彻底擦去所有消毒液残留，确保迷宫完全干燥。
2. 进行Y形迷宫实验
   1. 将Y形迷宫的初始臂标记为B，其余两个臂分别标记为A和C（图2A）。将一只啮齿类动物放置在靠近研究人员一侧的迷宫臂（B臂）靠近中心的位置。一旦放置好动物，立即启动计时器（迷宫和计时器的详细信息见材料表）。
      1. 允许每只啮齿类动物在Y形迷宫中自由探索8分钟。在此期间进行记录并注明任何观察结果。研究人员应坐在距离迷宫数英尺远的位置，保持对迷宫的视线，避免发出任何噪音。
      2. 将起始位置记录为A，每当啮齿类动物进入一个新的臂时，记录其新的位置（图2B）。定义“进入”为啮齿类动物的四肢全部进入某一臂内。
      3. 注意观察是否有动物躲藏并在迷宫某一臂内保持静止。如果动物在同一位置停留超过60秒且未表现出探索行为，应将其轻轻移回Y形迷宫的中心，继续实验。
   2. 每只动物测试结束后，清除其排泄物，并用消毒液清洁迷宫。
      1. 确保用纸巾彻底擦净所有消毒液残留，并在放入下一只动物前确保迷宫完全干燥。
3. 计算自发交替行为和探索行为
   1. 将探索行为定义为在8分钟内进入迷宫臂的总次数。
   2. 通过自发交替行为评估空间认知能力：
      成功交替次数 /（总进入次数 - 2）
      1. 定义一次成功的交替为动物连续进入三个不同的臂（例如：ABC、CAB、BCA等）。记录每一次成功的交替行为（图2B）。
      2. 如果记录的运动序列为ACABCABABCABC，在计算自发交替时忽略最初的两个位置（即分母中计为11次移动）。统计准确的交替次数（准确次数 = 8）。计算准确率为：8/(13 - 2) = 72.7%。

结果

如果能够从啮齿类动物获得空间频率和对比度敏感度阈值，则认为视觉运动反应（OMR）实验成功。此处以未经训练的对照组 Brown-Norway 和 Long-Evans 大鼠为例，展示利用 OMR 评估空间频率的方法，这些大鼠包括年轻（3–6 个月）和年老（9–12 个月）个体。Brown-Norway 大鼠通常表现出比 Long-Evans 大鼠更高的基础空间频率。此外，在 Long-Evans 大鼠中观察到空间频率随年龄增长而下降的现象（图 3A）。由于年轻组和年老组的数据来自不同队列，因此采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并以 Holms-Sidak 法进行事后比较分析。

通过STZ诱导的I型糖尿病模型接受运动干预治疗，展示了使用视动反应（OMR）评估对比敏感度的方法。Long-Evans大鼠被分为四组：对照组、对照组+运动组、糖尿病组以及糖尿病+运动组。糖尿病组大鼠通过静脉注射STZ毒素以损伤胰腺β细胞并诱导高血糖。运动组大鼠每周5天、每天接受30分钟的跑步机运动，非运动组大鼠则放置于锁定的跑步机上。在...

讨论

视觉运动反应（OMR）和Y迷宫可用于随时间无创评估啮齿类动物的视觉功能和认知功能缺陷。在本方案中，通过OMR和Y迷宫追踪了糖尿病啮齿类动物模型中的视觉和认知功能缺陷。

方案中的关键步骤

光密度测定法

在进行视觉功能评估的视动反应（OMR）实验时，需考虑若干重要因素，包括所使用的测试参数、实验设计与测试时机，以及执行测量的研究人员经验。该实验方案中一个较为关键的步骤是确保所有参数已正确设置。此外，在实验准备过程中，每次测试前后均应使用消毒液或其他经批准的消毒剂清洁OMR实验舱。执行测量的研究人员必须经过培训并具备相关操作经验，这一点也至关重要。为获得最佳实验结果，应在开始实验前将啮齿类动物置于其笼内静置30分钟，使其保持安静并适应实验环境。每当开始使用新品系动物进行研究时，还应测定其基础空间频率阈值和对比敏感度，并需注意不同品系的基础水平并不相同。例如，Brown-Norway大鼠的基础空间频率高于Long-Evans大鼠。与此同时，某些白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OptoMotry HD	CerebralMechanics 公司		OMR 仪器 &和软件
计时器	托马斯科学公司	810029AR
Y迷宫装置	San Diego Instruments	7001-043	专用于大鼠