非编码小RNA MicC有助于肠炎 沙门氏菌 外膜蛋白的毒力

摘要

使用λ-Red介导的重组系统创建小的非编码RNA micC的缺失突变体。

摘要

非编码小RNA（sRNA）是在转录后水平调控基因表达的新因子。一种在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中已知的sRNA MicC可以抑制外膜蛋白的表达。为了进一步研究micC在肠炎沙门氏菌中的调控功能，我们在肠炎沙门氏菌菌株50336中克隆了micC基因，然后通过λ Red基重组系统和互补突变体50336Δ micC/p micC携带重组质粒pBR322表达micC构建了突变体50336Δ micC。 qRT-PCR结果表明，50336Δ micC的ompD转录率是野生型菌株的1.3倍，而50336ΔmicC中ompA和ompC的转录量分别是野生型菌株的2.2倍和3倍。这些表明micC抑制了ompA和ompC的表达。在随后的研究中，通过感染6周龄Balb / c小鼠和1日龄鸡来检测50336ΔmicC的致病性。结果表明，野生型50336株的LD₅₀、突变体50336Δ micC和50336Δ micC/pmicC分别为12.59 CFU、5.01 CFU和19.95 CFU。1日龄鸡的LD₅₀品系分别为1.13 x 10⁹ CFU、1.55 x 10 8 CFU和2.54 x 10⁸ CFU。结果表明，micC的缺失增强了S的毒力。 通过调节外膜蛋白的表达在小鼠和鸡中的肠炎。

引言

非编码小RNA（sRNA）的长度为40-400个核苷酸，通常不编码蛋白质，但可以在细菌染色体¹，^2，3中独立转录。大多数sRNA编码在基因编码区之间的基因间区（IGR）中，并通过碱基配对作用与靶mRNA相互作用，并在转录^{后水平调节}靶基因表达4^，5。它们在物质代谢、外膜蛋白合成、群体感应和毒力基因表达中起重要的调节作用⁵。

MicC是存在于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中的109核苷酸小RNA转录本，可调节多种外膜蛋白表达，如OmpC、OmpD、OmpN、Omp35和Omp36⁶，⁷，^8，9。MicC通过在体外抑制核糖体与ompC mRNA领导者的结合来调节OmpC的表达，并且它需要Hfq RNA伴侣才能在大肠杆菌⁶中发挥作用。在鼠伤寒沙门氏菌中，MicC 通过编码序列（密码子 23-26）中的 ≤bp RNA 双链体沉默 ompD mRNA，然后破坏核内裂解 mRNA⁷ 的稳定性。该调节过程由伴侣蛋白Hfq¹⁰辅助。OmpC是一种丰富的外膜蛋白，被认为在营养和毒素浓度高的环境中很重要，例如在肠道^中6。OmpD孔蛋白是鼠伤寒沙门氏菌中含量最高的外膜蛋白，约占总细胞蛋白^的11%。OmpD参与人巨噬细胞和肠上皮细胞的粘附¹²。MicC还抑制OmpC和OmpD孔蛋白的表达。人们认为MicC可以调节毒力。为探索MicC调控的新靶基因，研究micC的毒力调控功能，我们在肠炎沙门氏菌（SE）菌株50336中克隆了micC基因，构建了突变体50336ΔmicC和互补突变体50336ΔmicC/p micC。采用qRT-PCR筛选新型靶基因。50336ΔmicC的毒力由小鼠和鸡感染检测到。

方案

所有实验均按照国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》进行。扬州大学动物护理和使用委员会批准了所有应用于动物的实验和程序（SYXK2016-0020）。

1. 细菌菌株、质粒和培养条件

1. 使用 表1中列出的细菌和质粒。
2. 在LB肉汤或LB琼脂平板上培养细菌，在37°C下，适当时在50μg/ mL氨苄青霉素（Amp）存在下。
3. 含有温度敏感质粒的培养菌株用于30°C的缺失突变体构建。

2. 克隆S的micC基因。肠炎菌株 50336

1. 基于S的 micC 基因上下游序列 。 鼠伤寒菌株SL1344，设计引物vmicC-F和vmicC-R，以SE50336基因组DNA为模板，通过PCR扩增含有 micC 基因的片段。
2. 将 5 μL 10x PCR 反应缓冲液、2 μL dNTP 混合物 （2.5 mM）、1 μL vmicC-F 和 vmicC-R 引物、5 μL 模板、1 μL Taq DNA 聚合酶和 35 μL ddH₂O 混合在一起进行 PCR。
3. 使用以下PCR反应条件:在94°C下预变性4分钟;94°C30秒，53°C1分钟，72°C1分钟25个循环，并在72°C下延伸10分钟。
4. 对PCR产物进行测序以获得 micC 基因序列。

3. micC 缺失突变体的构建

注意:肠炎沙门氏菌菌株 50336 的 micC 阴性突变体是使用 λ-Red 介导的重组构建的，如前^{所述 13，14}。使用的引物列于表2中。

1. 扩增含有 micC 基因同源片段的氯霉素盒。
   1. 设计micC-F和micC-R引物以扩增来自质粒pKD3的氯霉素（Cm）盒，包括来自 micC 基因5'和3'的50 bp同源性延伸。
   2. 提取pKD3质粒作为PCR模板。
   3. 将 5 μL 10x PCR 反应缓冲液、2 μL dNTP 混合物 （2.5 mM）、1 μL micC-F 和 micC-R 引物、5 μL 模板、1 μL Taq DNA 聚合酶和 35 μL ddH₂O 混合在一起作为 PCR 反应混合物
   4. 使用以下PCR反应条件扩增Cm盒:在94°C下预变性4分钟;94°C1分钟，52°C1分钟，72°C1分钟10个循环;94°C1分钟，63°C1分钟，72°C1分钟25个循环，并在72°C下延伸10分钟。
   5. 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。使用DNA凝胶回收试剂盒纯化和回收PCR产物，并通过分光光度计测定DNA的浓度。
      注意:PCR必须进行两次。将第一个PCR产物以1:200的比例稀释，并用作二级PCR的模板，以消除pKD3质粒进一步重组的干扰。
2. 构建 1^st 重组菌株 50336ΔmicC::cat
   1. 将 100 μL SE50336 感受态细胞与 5 μL pKD46 质粒均匀混合，并在冰上孵育 30 分钟。将上述混合物在42°C下热震90秒，并将混合物快速转移到冰上2分钟，将pKD46质粒转化为SE50336。通过在 Amp （50 μg/mL） 抗性平板上于 30 °C 培养过夜来筛选阳性菌落。
   2. 向SE50336 / pKD46液体培养物中加入30mM L-阿拉伯糖，并通过30°C振荡培养物诱导重组酶表达1小时。然后制备感受态细胞。
   3. 将 100 ng 纯化的 PCR 产物（步骤 3.1）和 40 μL SE50336/pKD46 感受态细胞混合到电击杯（例如 Bio-Rad）中。使用电压1.8 kV，脉冲25μF和电阻200 Ω的参数进行电击转换。
   4. 电转化后，将混合物转移到1mL SOC培养基中，并在150rpm和30°C下振荡培养物1小时。然后将混合物涂抹在Cm（34μg/ mL）抗LB板上，并在37°C下培养过夜以筛选阳性菌落。
   5. 将上述阳性菌落在42°C下培养2小时。在 37 °C 下筛选对 Amp （50 μg/mL） 敏感但对 Cm （34 μg/mL） 耐药的菌落过夜，以获得不含 pKD46 的第 1 个重组菌株。
3. 鉴定第1个重组菌株50336ΔmicC::Cat。
   1. 提取50336ΔmicC::猫基因组DNA作为PCR模板。使用与步骤2.1中相同的PCR反应组分。在与步骤2.1相同的条件下进行PCR反应。
   2. 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小并对PCR产物进行测序。
4. 构建缺失突变体 50336ΔmicC。
   1. 将 100 ng 质粒 pCP20 电穿孔到 40 μL 的 50336ΔmicC::Cat 感受态细胞中，参数为 1.8 kV、脉冲 25 μF 和电阻 200 Ω，在 30 °C 下筛选 Amp （50 μg/mL） 和 Cm （34 μg/mL） 抗平板上的正转化体。
   2. 将上述阳性转化体转移到非抗性LB中，并在42°C下培养过夜，然后在37°C下在LB板上分离单个菌落。 选择对 Amp 和 Cm 都敏感的菌落。这个突变体是 micC 缺失突变体SE50336ΔmicC。
   3. 通过 PCR 验证 50336Δ麦克风 。
      1. 提取50336ΔmicC 基因组DNA作为PCR模板。将 5 μL 10x PCR 反应缓冲液、2 μL dNTP 混合物 （2.5 mM）、1 μL 引物 vmicC-F、1 μL 引物 vmicC-R、5 μL 模板、1 μL Taq DNA 聚合酶和 35 μL ddH₂O 混合在一起进行 PCR。
      2. 使用以下PCR反应条件:在94°C下预变性4分钟;94°C30秒，53°C1分钟，72°C1分钟25个循环，并在72°C下延伸10分钟。

4. micC 补体应变的构造

1. 设计具有NheI和SalI限制性位点的引物pBR-micC-F和pBR-micC-R。
   1. 使用含有 5 μL SE50336 基因组 DNA 作为模板的 PCR 反应混合物、1 μL pBR-micC-F 和 1 μL pBR-micC-R 引物、5 μL 10x PCR 反应缓冲液、2 μL dNTP 混合物 （2.5 mM）、2 μL dNTP 混合物 （2.5 mM） 和 35 μL ddH₂O 的 PCR 反应混合物扩增具有侧翼序列的全长 micC 基因。
   2. 使用以下PCR反应条件:在94°C下预变性4分钟;94°C30秒，52°C50秒，72°C1分钟25个循环，并在72°C下延伸10分钟。纯化并回收PCR产物。
2. 分别使用限制性内切酶 NheI 和 SalI消化PCR产物和质粒pBR322，并使用T4连接酶在16°C下连接过夜，得到质粒pBR322-micC。
3. 将 pBR322-micC 转化为 SE50336ΔmicC 感受态细胞，并筛选阳性转化体以获得互补菌株 SE50336ΔmicC/pmicC。从互补菌株中提取质粒pBR322-micC，并通过限制性内切酶酶切和测序进行验证。

5. RNA分离与实时荧光定量PCR检测

1. 在LB培养基中以180rpm振荡培养物培养SE50336，50336ΔmicC / pmicC 在LB培养基中过夜，摇匀培养至OD₆₀₀ 为2.0。通过以13000rpm离心2分钟收集细菌培养物。
2. 使用TRIzol试剂提取总RNA。将 50 μL 分离的 RNA 与 2 μL DNaseI 和 6 μL 10x 缓冲液在 37 °C 下孵育 30 分钟以去除 DNA。通过将 1 μL RNA 样品移液到显微分光光度计中来确定 RNA 数量。
3. cDNA的合成
   1. 在 20 μL 逆转录反应系统（4 μL 5x 缓冲液、1 μL RT 酶混合物、1 μL RT 引物混合物、1 μL 总 RNA 和 4 μL ddH₂O）中使用 1 μg 总 RNA 进行 cDNA 合成。在37°C下孵育上述反应系统15分钟，然后在85°C下孵育5秒。
4. 根据靶基因ompA、ompC和ompD的序列设计引物。使用 RT 试剂盒进行逆转录-PCR。PCR 反应组分包含 2.5 μL 10x PCR 反应缓冲液、1 μL dNTP 混合物 （2.5 mM）、1 μL 靶基因（ompA、ompC 或 ompD）引物、2.5 μL 模板、0.5 μL Taq DNA 聚合酶和 17.5 μL ddH₂O。
   1. 使用以下PCR反应条件:在94°C下预变性4分钟;94°C30秒，60°C1分钟，72°C1分钟25个循环，并在72°C下延伸10分钟。
5. 在RT-PCT仪器中使用SYBR绿色RT-PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，一式三份。
   1. 使用以下 PCR 反应组分:分别为 10 μL 2x SYBR 缓冲液、0.4 μL 正向引物和反向引物、0.4 μL RoxDye II、2 μL cDNA 和 6.8 μL 游离 RNase H₂O。
   2. 使用以下PCR反应条件:在95°C下预变性1分钟，持续一个循环;95°C持续5秒，60°C持续34秒，持续40个周期。
   3. 将所有数据标准化为内源性参考基因 gyrA。使用^2-ΔΔCT 方法进行数据量化¹⁵.

6. 毒力测定

1. 在24°C的LB培养基至早期固定相（OD₆₀₀的2-3）中培养SE50336，50336ΔmicC和50336ΔmicC / pmicC，通过离心收获，并在无菌PBS中稀释至适当的CFU ^mL-1。
2. 对于小鼠感染，将培养的菌株稀释至10 CFU / 200μL，10^{2 CFU} / 200μL和10³ CFU / 200μL梯度重悬液。通过皮下注射感染每个菌株五只6-8周龄Balb / c小鼠的组。向对照组注射 200 μL 生理盐水。
3. 对于鸡感染，将上述三种菌株稀释至 10⁷ CFU/200 μL、10⁸ CFU/200 μL 和 10⁹ CFU/200 μL 梯度重悬液。通过皮下注射感染每个品系 20 只 1 天大的鸡。
4. 每天监测实验动物的疾病和死亡迹象。如前所述，计算感染后14天的LD₅₀ （中位致死剂量）¹⁶。使用数据分析软件处理数据。
5. 在感染组中，收集刚死的雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。分别称取上述组织0.5g，并用无菌操作研磨。逐渐稀释研磨样品，将它们散布在LB板上并在37°C下培养8-10小时。记录在雏鸡组织中定植的 沙门氏菌菌 株的数量。

结果

突变体50336Δ micC和互补菌株50336Δ micC /pmicC的构建
micC基因克隆结果表明，该基因由109 bp组成，与S基因100%相同。 鼠伤寒。基于序列数据，成功构建缺失突变体50336ΔmicC和互补突变体50336ΔmicC/pmicC。详细地，测序结果表明，扩增1.1 kb Cm电阻盒并用于构建^第1个重组体。使用引物vmicC-F和vmicC-R通过PCR验证了第1^个重组50336ΔmicC::cat，预期带大小约为1200 bp的PCR产物，而野生型菌株的PCR产物为279 bp（图1）。在第二次重组中，C...

讨论

S. 肠炎是一种重要的兼性细胞内病原体，可感染幼鸡并产生从肠炎到全身感染和死亡的症状^17，18。此外，肠炎链球菌在成年鸡中引起潜伏感染，慢性携带者污染家禽产品，导致人类食源性感染¹⁹。肠炎链球菌的致病机制仍有待进一步探讨。迄今为止，已经发现一些sRNA，如IsrJ，SroA和IsrM会影响沙门氏菌的毒力^20，21，^22，23。在许多肠杆菌中鉴定出非编码小RNA micC基因，例如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，邦戈里沙门氏菌和福氏志贺氏菌

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡萄糖	Sangon Biotech	A610219	用于肉汤制备
DNA 纯化试剂盒	DNA 纯化	TIANGEN	DP214
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	国药化学试剂	10017608	肉汤制备
K2HPO4	国药化学	20032116	肉汤制备
L-阿拉伯糖	Sangon Biotech	A610071	λ-红色重组
迷你质粒试剂盒	TIANGEN	DP106	质粒提取
NaCl	国药化学试剂	10019308	肉汤制备
（NH4）2SO4	国药化学试剂	10002917	肉汤制备
PrimeScriptRRT试剂盒含gDNA擦除器	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR 预混液 Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202	连接
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA 分离
胰蛋白胨	肉汤制备	Oxoid	LP0042
酵母提取物	肉汤制备	Oxoid	LP0021
离心机	Eppendorf	5418	离心
电泳仪	Bio-Rad	164-5050	电泳
用于	细菌转化	Bio-Rad	165-2100
光光度计	BioTek	Epoch	吸光度检测
实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	7500 系统	qRT-PCR