异源表达与功能分析 埃及伊蚊 人类气味的气味受体 非洲爪蟾 卵母细胞

摘要

本文介绍了一种利用Xenopus卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术，对蚊虫气味受体（ORs）在人体气味刺激下的功能特性进行表征的实验方案，为研究蚊虫气味受体对人类气味暴露的响应提供了一种强大的新技术。

摘要

蚊子Aedes aegypti（Linnaeus）是多种重要人类疾病的传播媒介，包括黄热病、登革热和寨卡热，其在吸血时对人类宿主的偏好明显强于其他温血动物。在探索环境并寻找人类宿主以获取血液的过程中，嗅觉线索对蚊子至关重要，也因此促进了人类疾病的传播。表达于嗅觉感觉神经元中的气味受体（ORs）已被证实介导了蚊媒与人体气味之间的相互作用。为了更深入地理解Ae. aegypti的嗅觉生理机制，并在分子水平上研究其与人类的相互作用，我们采用了一种优化的Xenopus卵母细胞异源表达方案，以功能性分析Ae. aegypti气味受体对人类气味的响应。本文展示了三个示例实验：1）从4至6日龄的Ae. aegypti触角中克隆并合成ORs及气味受体共受体 (Orco)的cRNA；2）将ORs和Orco微注射并在Xenopus卵母细胞中进行表达；3）利用双电极电压钳技术，对表达蚊子ORs/Orco的Xenopus卵母细胞进行全细胞电流记录。这些优化的实验流程为研究人员提供了一种新方法，用于探究Aedes蚊类对人体气味的感知机制，并揭示其在分子层面上调控宿主搜寻行为的内在机理。

引言

黄热病蚊子 Ae. aegypti 可传播多种致命疾病，包括黄热病、登革热和寨卡热，造成巨大的痛苦和生命损失。蚊子利用多种线索（如 CO₂、皮肤气味和体热）来定位宿主¹。鉴于人类和其他恒温动物均会产生 CO₂ 并具有相似的体温，雌性 Ae. aegypti 很可能主要依赖皮肤气味进行宿主识别²。然而，这一过程十分复杂，一项早期研究已从人体皮肤释放物中分离出超过 300 种化合物³。进一步的行为检测表明，其中许多化合物可引发 Ae. aegypti 的行为反应^4,5,6,7，但这些化合物如何被蚊子感知仍 largely 未知。我们课题组最近的研究已鉴定出若干可能参与 Ae. aegypti 寻找宿主行为的人源气味分子，但其具体作用仍有待进一步的行为实验验证⁸。这些关键的人源气味分子在 Ae. aegypti 外周感觉系统中是如何被解码的，目前尚未明确。

昆虫通过其嗅觉附器上的化学感受器感器检测气味分子。在每个感器内部，不同的嗅觉受体（包括气味受体（ORs）、离子型受体（IRs）和味觉受体（GRs））表达于嗅觉感觉神经元的膜上。⁹这些OR负责感知多种 昆虫接触到的气味物质，尤其是与食物、寄主和交配对象相关的气味^10,11,12,13. 一项先前的研究聚焦于解析嗅觉受体（ORs）功能的去孤儿化 Anopheles gambiae 使用 非洲爪蟾 表达系统结合双电极电压钳技术已发现 按蚊属 ORs 对人类散发物中的主要成分——芳香类物质具有特异性调谐作用¹⁴一项近期的基因组研究鉴定出多达117个 或 基因在 埃及伊蚊¹⁵因此，系统性研究这些功能的方法 伊蚊 对生物或生态学上重要的气味物质（如人体气味或产卵刺激物）产生响应的气味受体（ORs），可为深入理解化学生态学或神经行为学的研究者提供有价值的信息 埃及伊蚊.

双电极电压钳（TEVC）技术最初于20世纪90年代中期开发，用于研究膜离子通道的功能^16,17。自那时以来，TEVC已被用于研究多种不同昆虫物种的嗅觉受体（ORs）^{14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}。对嗅觉受体（ORs）的这种功能研究极大地推动了昆虫生态学中若干重要问题的解答，包括：1）昆虫如何定位食物来源？2）它们如何被交配对象释放的挥发性性信息素所吸引？3）它们如何为其后代找到理想的产卵场所？以及4）是否存在某些化合物——无论是植物来源还是人工合成的——能够有效保护人类免受吸血昆虫叮咬？对这些问题的回答对于控制蚊子等重要疾病传播媒介至关重要。

其他多种方法也已被用于嗅觉受体功能研究，包括基于人胚肾293细胞系（HEK293）、果蝇（Drosophila）空神经元系统、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9基因编辑系统的方法^{12,20,35,36,37}。然而，这些技术均需要经验丰富的分子生物学操作技能，并涉及多个可能产生干扰的因素。双电极电压钳（TEVC）结合卵母细胞表达系统能够直接测量气味诱导的受体电流和离子电导，且具有利用cRNA快速表达受体所需的准备时间短等优势。因此，在本研究中，我们采用TEVC技术检测了埃及伊蚊（Ae. aegypti）OR55（AaegOR55）对若干具有潜在生物学意义的气味分子的响应，结果表明，表达AaegOR55•AaegOrco的卵母细胞对人源气味分子苯甲醛呈现出剂量依赖性反应。

方案

本实验方案《实验动物的护理与使用》已获批准并接受监管（奥本大学机构动物护理与使用委员会：批准方案编号 # 2016-2987）。

注意：对于蚊子的OR基因，定制基因合成是克隆的一种可行替代方案。

1. 蚊虫及嗅觉附器（触角）的采集

1. 在 25 ± 2°C 及 12:12（L:D）h 光照周期（光照开启时间为上午 8 点）条件下饲养埃及伊蚊（Ae. aegypti）（源自美国农业部农业研究局蚊虫与蝇类研究组 James Becnel 博士提供）。
2. 使用 CO₂ 对约 800 只未吸血的 4–6 日龄雌蚊进行麻醉。在显微镜（40 倍）下用剪刀剪下蚊子的触角（嗅觉组织），并收集至置于干冰上的 1.5 mL 离心管中。
   注意：收集的触角可保存在 -80 °C 冰箱中，或立即使用。

2. 从触角中进行OR克隆 埃及伊蚊

1. 使用市售的总RNA试剂盒，按照制造商的说明书从触角中提取总RNA。
2. 使用市售的DNA-free试剂盒对总RNA进行消化，以去除DNase及其他离子，操作步骤遵循制造商的说明书。
3. 以1.5 µg无DNA的RNA为模板，使用Oligo d(T)20引物的SuperScript IV第一链cDNA合成系统合成cDNA^13,30。
4. 根据VectorBase数据库（https://www.vectorbase.org/）提供的序列信息以及酶切位点的特殊要求，设计OR基因的PCR引物。在每个上游引物中，于酶切位点与起始密码子之间加入Kozak序列（GCCACC），该序列可在大多数真核生物中启动翻译³⁰。
5. 使用含有限制性内切酶位点和Kozak序列的基因特异性引物，通过PCR克隆OR基因的编码序列，操作遵循制造商的说明书。
6. 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用市售的凝胶回收试剂盒进行纯化，操作步骤遵循制造商的说明书。
7. 将PCR产物经限制性内切酶消化后，克隆至pT7Ts载体中，构建重组质粒，操作遵循制造商的说明书。
8. 通过Sanger测序验证重组质粒，并利用VectorBase数据库进行确认。

3. cRNA 合成

1. 用特定的限制性内切酶将构建好的质粒线性化。
   注意：质粒DNA必须在待转录基因的下游使用限制性内切酶进行线性化。
2. 使用线性化质粒，按照先前描述的方法^13,30，利用商业化的T7试剂盒合成cRNA。
3. 在离心管中预先混合OR和Orco的cRNA （1:1），并将混合后的cRNA分装至每管2 μL（各250 ng/µL）用于后续PCR管使用。分装后的cRNA于-80 °C保存，待用。

4. Xenopus 卵母细胞采集

注意：本实验步骤遵循 Schneider 等人³⁸ 的说明。

1. 麻醉 非洲爪蟾 在1升超纯水中加入1克间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，处理20-30分钟图1A用手指捏压青蛙的一只脚趾；若无反应，则表明青蛙已充分麻醉，可进行手术。将已麻醉的青蛙转移至冰床上。
2. 手术
   1. 用10%聚维酮碘溶液擦拭青蛙腹部区域，再用干净的棉球擦去溶液。重复此步骤2次。
   2. 做一个小的腹部切口（10-15 mm， 图1B使用一次性手术刀进行切口。分别切开皮肤和筋膜-肌肉层。切口位于腹部下部，中线外侧。
      注意：切勿损伤内脏器官。
   3. 用镊子夹住卵巢叶的部分，轻柔地向外牵拉。提起卵巢，用剪刀在体壁水平处剪下。重复数次，直至获得足够的卵巢组织（约200枚卵）。 图1C）。将卵巢材料转移至洗涤缓冲液（96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl₂）中₂•6H₂O，5 mM HEPES 钠盐，10 µg/mL 庆大霉素，pH 7.6。
   4. 使用可吸收缝线缝合手术切口（包括肌肉和皮肤），缝线通常在10至14天内降解并自然脱落。
   5. 每次手术后，将青蛙放入1升恢复液中（含有3.4 g罐装） & 腌渍盐和 2 g 即用型海洋盐）直至其苏醒，然后将其送回蛙类饲养设施。
      注意：每只青蛙最多可进行4次手术，每次手术之间的时间间隔应超过2个月。
3. 酶解去卵泡消化及卵母细胞培养
   1. 分离卵母细胞（约200个卵子， 图1C) 切成小块。
   2. 将所有卵母细胞转移至消化液中，消化液包含10 mL洗涤缓冲液（第4.2.3节）和2 mg/mL胶原酶B，在室温下消化40–60分钟，以去除卵泡细胞层。在显微镜下观察样本，判断是否有80%的卵母细胞已完成去卵丘处理；若未达到，每10分钟检查一次，直至大部分卵母细胞达到所需状态。
   3. 用1×林格溶液（96 mM NaCl，2 mM KCl，5 mM MgCl₂，5 mM HEPES，pH 7.6）冲洗卵母细胞₂·6H₂O，5 mM HEPES 钠盐，pH 7.6），洗涤缓冲液（第 4.2.3 节），改良 Barth 生理盐水（78 mM NaCl，1 mM KCl，0.33 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.41 mM CaCl₂·2H₂O，0.82 mM MgSO₄₄·7H₂O₂，2.4 mM NaHCO₃₃，10 mM HEPES 钠盐，1.8 mM 丙酮酸钠，10 µg/mL 庆大霉素，10 µg/mL 链霉素，pH 7.6）中依次冲洗（每种缓冲液冲洗5次，每次使用10 mL）。用缓冲液充分冲洗卵母细胞以去除 未成熟且质量较差的卵母细胞。
   4. 根据Dumont分期法采集V-VI期卵母细胞。选择V-VI期、具有清晰的白色/深色分界且无明显可见损伤的健康/高质量卵母细胞图1D) 转移至一个 100 mm × 15 mm 佩特里皿，内含改良巴特氏生理盐水（第 4.3.3 节）。弃去质量不佳的卵母细胞（图1E将消化后的卵母细胞置于昆虫培养箱中，在18 °C下孵育约24小时，然后进行显微注射。

5. cRNA 显微注射及气味受体（ORs）与 OR 共受体（Orco）在 非洲爪蟾 卵母细胞

1. 将金属网架放入100 mm × 15 mm的培养皿中，加入改良Barth溶液（第4.3.3节），直至完全浸没网架。将卵母细胞转移至网架上，剔除不符合大小要求的卵母细胞。调整卵母细胞方向，使其植物极朝上 侧图1F).
2. 为每个样本使用显微拉管仪（加热温度 = 525，拉力 = 50，速度 = 50，时间 = 250）拉制新的玻璃毛细管（外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm，长度 = 100 mm），并用显微毛细管斜面仪以 25° 角度进行打磨。将毛细管安装至纳升注射仪上。
3. 注射前，从冷冻保存中取出一管预混的OR与Orco cRNA（第3.3节），置于冰上直至完全溶解。通过按压将OR/Orco混合物吸入毛细管中 填充 纳米注射器的按钮。
4. 在无RNA酶环境中，使用纳升注射仪向每个卵母细胞注射10 ng（5 ng OR + 5 ng Orco；约20 nL）预混cRNA。图1F).
   注意：注射前，我们按压 空 按下按钮释放少量混合液，以确保毛细管未被堵塞。等待约5秒，使cRNA完全进入卵母细胞。
5. 注射后，将卵母细胞置于含有改良巴氏生理盐水的无菌24孔细胞培养板中，在18°C下孵育3至7天，再进行全细胞记录。

6. 使用双电极电压钳系统进行全细胞电流记录（图2）

1. 在进行双电极电压钳记录之前，将单一气味化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成一系列储备液（100 μg/μL）。再用1×ND96缓冲液（91 mM NaCl，2 mM KCl，1.8 mM CaCl₂·2H₂O，2 mM MgCl₂·6H₂O，5 mM HEPES钠盐，pH 7.6）将这些储备液稀释1000倍，得到一系列工作液（0.1 μg/μL）。
2. 确保TMC隔振台上所有设备，包括金属屏蔽罩、显微镜、光源和废液泵，均已仔细接地，以减少外部电噪声对全细胞信号记录的影响。
3. 使用微电极拉制仪（加热值=525，拉力=50，速度=50，时间=250）将玻璃毛细管（外径1.20 mm，内径0.94 mm，长度=750 mm）拉制成微电极。用3 M KCl溶液填充毛细管。将Ag/AgCl导线置于10%次氯酸钠溶液中氯化2–5分钟，直至其变为深灰色（浅灰色的Ag/AgCl导线需重新氯化）。
4. 打开Oocyte Clamp和Digidata Digitizer的电源开关（图3A）。启动软件（例如Clampex 10.3），点击Record按钮。打开1×ND96缓冲液（第6.1节）的开关以及废液泵的电源。
5. 进行预测试：将微电极插入流动的缓冲液中，然后依次点击V_m Electrode Test按钮和V_e Electrode Test按钮，检测微电极的电阻。V_m应< 40 mV，V_e应< 40 μA。预测试完成后，关闭1×ND96缓冲液（第6.1节）的流动和废液泵。
6. 将每个卵母细胞置于充满1×ND96缓冲液（第6.1节）的灌流室（图2）中，并用玻璃毛毛虫轻轻调整卵母细胞位置，使其植物极朝上。缓慢将电极插入卵母细胞（图3B）。将V_m参数调节至0，再将V_e参数调节至0。将Clamp按钮从OFF 切换至FAST。将Gain按钮调节至约-80 mV。
7. 检查V_e的数值，其值应保持稳定。若不稳定，则表明至少一根微电极存在泄漏。此时应更换有故障的部件，并使用新的毛细管重新制备电极。
8. 在钳制电位约为−80 mV的条件下，使用卵母细胞电压钳记录注射后的卵母细胞全细胞电流（图2）。
9. 进行数据采集与分析。
   1. 恢复1×ND96缓冲液（第6.1节）的流动，并开启废液泵。
   2. 通过灌流系统施加气味溶液：关闭1×ND96缓冲液（第6.1节），开始灌注气味溶液持续10秒，随后记录峰值。为获得OR 对测试气味的响应值，需从峰值中减去基线值。
   3. 停止气味溶液的灌流，切换回1×ND96缓冲液（第6.1节）。用缓冲液冲洗卵母细胞，直至电流曲线恢复至前一次气味刺激前的水平。此后卵母细胞即可用于下一种气味溶液的刺激。通常，一个卵母细胞可用于检测20–30次化学刺激。
      注意：在测试浓度依赖性反应时，应始终先施加最低浓度，再逐步提高浓度。

结果

利用单感器记录（SSR）技术，我们近期精确定位了被认为对人类具有重要意义的气味物质 埃及伊蚊 宿主寻找行为⁸。然而，驱动人类气味分子在外周感觉系统中被感知的分子机制仍不明确 埃及伊蚊 尚不明确。嗅觉受体（ORs）在大多数昆虫的气味配体检测中发挥重要作用^10,11,12为了发挥功能，每种OR都需要与Orco共表达，以形成异源寡聚配体门控离子通道（图4)。一旦与特异性配体结合，细胞膜上表达的异源离子通道即被激活并打开，允许 Ca 等阳离子内流²⁺ 进入细胞^20,35 (图4。这会产生一个内向电流，或偶尔产生外向电流

讨论

双电极电压钳（TEVC）是一种经典技术，广泛用于研究膜受体的功能。尽管已有详细方案发表⁴³，其步骤与本文所述方法具有较大相似性，但本文提出的方法引入了一些重要改进。例如，本文中，气味受体（OR）和共受体（Orco） 的cRNA在合成后立即预先混合，并分装成小体积样品，于-80 °C保存备用，而不是在注射前立即于石蜡膜上分别混合⁴³。此外，在采集卵母细胞后，我们选择使用可吸收缝合线关闭肌肉和皮肤的切口，这种方法尤其适用于肌肉缝合，因为缝合线可被青蛙自行吸收，无需后续拆除。另外，每次从青蛙体内采集的卵巢组织量可根据具体实验需求灵活调整。Nakagawa和Touhara（2013）的方案明确指出应切除三分之一的卵巢，这通常会造成较大浪费。根据我们的经验，每次实验取卵巢的五分之一即可满足需求。

昆虫的气味受体（ORs）是负责气味感知的三类嗅觉受体之一，已利用双电极电压钳（TEVC）技术对多种化合物进行了广泛测试^14,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	CytoOne	CC7682-7524	用于卵母细胞培养
非洲爪蟾	Nasco	LM00535	用于采集非洲爪蟾卵母细胞
Ag/AgCl导线电极	Warner Instruments	64-1282	用于制作微电极
Clampex 10.3	Axon	N.A.	用于信号记录
Clampfit 10.3	Axon Instruments Inc.	N.A.	用于数据分析
胶原酶B	Sigma	11088815001	用于卵母细胞消化
Digidata数模转换器	Axon CNS	Digidata 1440A	用于数据采集
E.Z.N.A. 质粒DNA小量提取试剂盒	Omega	D6942-01	用于质粒制备
甲磺酸乙酯间氨基苯甲酸盐	Sigma	886-86-2	用于麻醉青蛙
玻璃毛细管	FHC	30-30-1	用于显微注射
玻璃毛细管	Warner Instruments	64-0801	用于制备微电极
GyroMini旋转混合仪	Labnet	S0500	用于卵母细胞消化
昆虫培养箱	Caron Products	model 6025	用于卵母细胞孵育
Leica显微镜	Leica	S6 D	用于切割蚊子触角
光源	Schott	A20500	为观察提供光源
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定参比电极
显微操作器	Leica	115378	用于微调电极位置
微电极拉制仪	Sutter	model P-97	用于拉制毛细管
微电极磨削仪	Sutter	model BV-10	用于 sharpen 毛细管尖端
mMESSAGE mMACHINE T7体外转录试剂盒	Invitrogen	AM1344	用于合成cRNA
Nanoject II自动纳升级注射仪	Drummond	3-000-204	用于显微注射
oligo d(T)20引物SuperScript IV第一链cDNA合成系统	Invitrogen	18091050	用于合成cDNA
Olympus显微镜	Olympus	SZ61	用于显微注射
One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌细胞	Invitrogen	C404003	用于转化实验
卵母细胞电压钳放大器	Warner Instruments	model OC-725C	用于双电极电压钳记录
QIAquick凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704	用于凝胶纯化
TMC振动隔离台	TMC	63-500	用于隔离设备振动
TURBO DNA-free试剂盒	Invitrogen	AM1907	用于去除RNA中的DNase及其他离子