异源表达与功能分析 埃及伊蚊 人类气味的气味受体 非洲爪蟾 卵母细胞

摘要

本文介绍了一种利用Xenopus卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术，对蚊虫气味受体（ORs）在人体气味刺激下的功能特性进行表征的实验方案，为研究蚊虫气味受体对人类气味暴露的响应提供了一种强大的新技术。

摘要

蚊子Aedes aegypti（Linnaeus）是多种重要人类疾病的传播媒介，包括黄热病、登革热和寨卡热，其在吸血时对人类宿主的偏好明显强于其他温血动物。在探索环境并寻找人类宿主以获取血液的过程中，嗅觉线索对蚊子至关重要，也因此促进了人类疾病的传播。表达于嗅觉感觉神经元中的气味受体（ORs）已被证实介导了蚊媒与人体气味之间的相互作用。为了更深入地理解Ae. aegypti的嗅觉生理机制，并在分子水平上研究其与人类的相互作用，我们采用了一种优化的Xenopus卵母细胞异源表达方案，以功能性分析Ae. aegypti气味受体对人类气味的响应。本文展示了三个示例实验：1）从4至6日龄的Ae. aegypti触角中克隆并合成ORs及气味受体共受体 (Orco)的cRNA；2）将ORs和Orco微注射并在Xenopus卵母细胞中进行表达；3）利用双电极电压钳技术，对表达蚊子ORs/Orco的Xenopus卵母细胞进行全细胞电流记录。这些优化的实验流程为研究人员提供了一种新方法，用于探究Aedes蚊类对人体气味的感知机制，并揭示其在分子层面上调控宿主搜寻行为的内在机理。

引言

黄热病蚊子 Ae. aegypti 可传播多种致命疾病，包括黄热病、登革热和寨卡热，造成巨大的痛苦和生命损失。蚊子利用多种线索（如 CO₂、皮肤气味和体热）来定位宿主¹。鉴于人类和其他恒温动物均会产生 CO₂ 并具有相似的体温，雌性 Ae. aegypti 很可能主要依赖皮肤气味进行宿主识别²。然而，这一过程十分复杂，一项早期研究已从人体皮肤释放物中分离出超过 300 种化合物³。进一步的行为检测表明，其中许多化合物可引发 Ae. aegypti 的行为反应^4,5,6,7，但这些化合物如何被蚊子感知仍 largely 未知。我们课题组最近的研究已鉴定出若干可能参与 Ae. aegypti 寻找宿主行为的人源气味分子，但其具体作用仍有待进一步的行为实验验证⁸。这些关键的人源气味分子在 Ae. aegypti 外周感觉系统中是如何被解码的，目前尚未明确。

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方案

本实验方案《实验动物的护理与使用》已获批准并接受监管（奥本大学机构动物护理与使用委员会：批准方案编号 # 2016-2987）。

注意：对于蚊子的OR基因，定制基因合成是克隆的一种可行替代方案。

1. 蚊虫及嗅觉附器（触角）的采集

1. 在 25 ± 2°C 及 12:12（L:D）h 光照周期（光照开启时间为上午 8 点）条件下饲养埃及伊蚊（Ae. aegypti）（源自美国农业部农业研究局蚊虫与蝇类研究组 James Becnel 博士提供）。
2. 使用 CO₂ 对约 800 只未吸血的 4–6 日龄雌蚊进行麻醉。在显微镜（40 倍）下用剪刀剪下蚊子的触角（嗅觉组织），并收集至置于干冰上的 1.5 mL 离心管中。
   注意：收集的触角可保存在 -80 °C 冰箱中，或立即使用。

2. 从触角中进行OR克隆 埃及伊蚊

1. 使用市售的总RNA试剂盒，按照制造商的说明书从触角中提取总RNA。
2. 使用市售的DNA-free试剂盒对总RNA进行消化，以去除DNase及其他离子，操作步骤遵循制造商的说明书。
3. 以1.5 µg无DNA的RNA为模板，使用Oligo d(T)20引物的SuperScript....

结果

利用单感器记录（SSR）技术，我们近期确定了被认为对人类具有重要意义的气味物质 埃及伊蚊 宿主搜寻行为⁸然而，驱动人类气味分子在外周感觉系统中感知过程的分子机制 埃及伊蚊 尚不明确。嗅觉受体（ORs）在大多数昆虫的气味配体检测中发挥着重要作用^10,11,12. 为了发挥功能，每种气味受体（OR）都需要与Orco共表达，以形成异源多聚配体门控离子通道（图4)。一旦与特异性配体结合，细胞膜上表达的异源离子通道即被激活并开放，允许 Ca 等阳离子内流²⁺ 进入细胞^20,35 (图 4）。这会产生一个向内的电流，或偶尔产生.......

讨论

双电极电压钳（TEVC）是一种经典技术，广泛用于研究膜受体的功能。尽管已有详细方案发表⁴³，其步骤与本文所述方法具有较大相似性，但本文提出的方法引入了一些重要改进。例如，本文中，气味受体（OR）和共受体（Orco） 的cRNA在合成后立即预先混合，并分装成小体积样品，于-80 °C保存备用，而不是在注射前立即于石蜡膜上分别混合⁴³。此外，在采集卵母细胞后，我们选择使用可吸收缝合线关闭肌肉和皮肤的切口，这种方法尤其适用于肌肉缝合，因为缝合线可被青蛙自行吸收，无需后续拆除。另外，每次从青蛙体内采集的卵巢组织量可根据具体实验需求灵活调整。Nakagawa和Touhara（2013）的方案明确指出应切除三分之一的卵巢，这通常会造成较大浪费。根据我们的经验，每次实验取卵巢的五分之一即可满足需求。

昆虫的气味受体（ORs）是负责气味感知的三类嗅觉受体之一，已利用双电极电压钳（TEVC）技术对多种化合物进行了广泛测试^14,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	CytoOne	CC7682-7524	用于卵母细胞培养
非洲爪蟾	Nasco	LM00535	用于采集非洲爪蟾卵母细胞
Ag/AgCl导线电极	Warner Instruments	64-1282	用于制作微电极
Clampex 10.3	Axon	N.A.	用于信号记录
Clampfit 10.3	Axon Instruments Inc.	N.A.	用于数据分析
胶原酶B	Sigma	11088815001	用于卵母细胞消化
Digidata数模转换器	Axon CNS	Digidata 1440A	用于数据采集
E.Z.N.A. 质粒DNA小量提取试剂盒	Omega	D6942-01	用于质粒制备
甲磺酸乙酯间氨基苯甲酸盐	Sigma	886-86-2	用于麻醉青蛙
玻璃毛细管	FHC	30-30-1	用于显微注射
玻璃毛细管	Warner Instruments	64-0801	用于制备微电极
GyroMini旋转混合仪	Labnet	S0500	用于卵母细胞消化
昆虫培养箱	Caron Products	model 6025	用于卵母细胞孵育
Leica显微镜	Leica	S6 D	用于切割蚊子触角
光源	Schott	A20500	为观察提供光源
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定参比电极
显微操作器	Leica	115378	用于微调电极位置
微电极拉制仪	Sutter	model P-97	用于拉制毛细管
微电极磨削仪	Sutter	model BV-10	用于 sharpen 毛细管尖端
mMESSAGE mMACHINE T7体外转录试剂盒	Invitrogen	AM1344	用于合成cRNA
Nanoject II自动纳升级注射仪	Drummond	3-000-204	用于显微注射
oligo d(T)20引物SuperScript IV第一链cDNA合成系统	Invitrogen	18091050	用于合成cDNA
Olympus显微镜	Olympus	SZ61	用于显微注射
One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌细胞	Invitrogen	C404003	用于转化实验
卵母细胞电压钳放大器	Warner Instruments	model OC-725C	用于双电极电压钳记录
QIAquick凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704	用于凝胶纯化
TMC振动隔离台	TMC	63-500	用于隔离设备振动
TURBO DNA-free试剂盒	Invitrogen	AM1907	用于去除RNA中的DNase及其他离子