肥胖是一种日益严重的全球公共卫生问题。既往研究已将其与淋巴功能障碍相关联，提示脂肪组织与淋巴系统之间存在重要的相互作用。本文提出一种简便的方法，可对皮下脂肪组织中的血液和淋巴管系统进行特异性标记。
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本文内容
摘要
摘要
淋巴管和淋巴结不可避免地包埋在脂肪组织中。这一现象的生理学意义至今尚未阐明。然而，肥胖的特征表现为淋巴功能受损和淋巴管通透性增加。相反，淋巴功能障碍可在小鼠中诱发肥胖，提示淋巴管与脂肪组织之间存在重要的相互作用。因此，理解导致淋巴功能障碍的因素可能为预防肥胖及其相关合并症开辟新的治疗窗口。实现这一目标的第一步，需要对健康和炎症状态下脂肪组织中的淋巴网络进行精确而详细的可视化。本文介绍了一种快速、经济且高效的方法，可用于标记和分析淋巴管与血管。该方法利用了位于皮下脂肪组织中的皮肤引流臂淋巴结的解剖位置特点，通过皮下注射荧光素标记的凝集素，可清晰显示该组织内的淋巴分支结构。此外，这种活体标记方法还可用于评估淋巴管的密度和功能。结合血管、脂肪细胞及免疫细胞的染色，该方案可通过三维成像实现对皮下脂肪组织的高分辨率图谱构建。
引言
淋巴循环系统在维持组织稳态以及诱导有效免疫应答中发挥关键作用。淋巴管与血管平行分布，将组织间液、代谢产物和免疫细胞输送至局部引流淋巴结（LN），最终进入静脉循环1。在感染、炎症及代谢性疾病过程中，已观察到淋巴引流功能障碍2,3,4,5。淋巴脉管系统由称为淋巴毛细血管的小型血管组成。淋巴毛细血管由单层扁平的淋巴内皮细胞（LECs）构成，其特征为开放性连接结构（“钮扣样”连接），有利于组织间液、代谢产物以及主要为树突状细胞（DCs）和T细胞的免疫细胞进入淋巴毛细血管腔5。淋巴毛细血管汇合成较大的管道，称为集合淋巴管。集合淋巴管的特点是淋巴内皮细胞层外包裹有肌层，提供自主收缩张力，维持液体流动5。此外，集合淋巴管具有瓣膜结构，可确保淋巴液单向流动。
集合管和毛细淋巴管的淋巴管内皮细胞（LEC）表达一组特定的标志物，可将其与血液内皮细胞（BEC）区分开来。在这些因子中，Prox1 是一种指导 LEC 生成的转录因子，在 LEC 中高表达，而在 BEC 中不表达。通过构建和分析 Prox1 缺陷型小鼠，已证实 Prox1 在 LEC 生物学中的关键作用6。Prox1 杂合型小鼠表现出淋巴管系统发育缺陷，特征为淋巴管密度降低和血管通透性增加6。LEC 高表达 VEGFR3、Podoplanin 和 CCL215。这些标志物在 BEC 上不存在，因此可用于分别分析淋巴管和血管网络。Lyve1 选择性地在毛细淋巴管中表达，而在集合管中不表达5。
根据线粒体含量及其相应的颜色，已描述了三种类型的脂肪组织。富含线粒体的产热型棕色脂肪组织在寒冷暴露期间发挥关键作用，在小鼠中主要位于肩胛间区域7,8。白色和米色脂肪细胞的线粒体密度较低，主要以脂滴形式储存能量。白色和米色脂肪细胞分布于内脏和皮下脂肪库中9。
临床观察已证实肥胖与淋巴功能障碍之间存在关联10。肥胖可诱导脂肪组织中淋巴管系统的形态学改变，并导致淋巴运输功能受损11。在临床前模型中获得的数据表明，高脂饮食（HFD）可诱导淋巴系统重塑，肥胖小鼠的淋巴结体积更小，淋巴管数量也更少12。然而，调控这一表型的具体分子机制仍有待阐明。在淋巴管发育受损的遗传模型中所获得的观察结果进一步支持了淋巴内皮细胞（LEC）在肥胖过程中的参与。如前所述，Prox1 杂合子小鼠（Prox1+/-）存在淋巴系统功能障碍，同时相较于 Prox1 表达正常的小鼠，会伴随出现内脏脂肪组织的过度积聚6。有趣的是，恢复淋巴功能可逆转这一脂肪组织表型13。综上所述，这些研究结果揭示了淋巴管与脂肪组织之间存在密切的相互联系，亟需进一步深入研究。
在肥胖症的炎症背景下，淋巴内皮细胞（LEC）和血管内皮细胞（BEC）标志物的表达发生改变，这会干扰通过经典抗体染色方法对这些细胞的分析14,15。目前已开发出可特异性标记LEC和BEC的遗传模型，能够在一定程度上弥补这一问题16,17,18,19。然而，使用遗传报告基因小鼠品系需要多代繁育，显著增加了研究项目的周期和成本。因此，我们建议采用荧光染料偶联凝集素注射的方法来研究皮下脂肪组织中的血液和淋巴循环系统，这是一种简便且相对经济的策略。目前已有多种荧光染料标记的凝集素商品化供应，可通过静脉注射标记血管，或通过皮下注射标记嵌于皮下脂肪组织中的皮肤引流淋巴管。该方法依赖于每次注射使用不同的荧光染料-凝集素偶联物，从而实现对不同脉管系统的独立标记。此技术也可与用于标记淋巴或血液脉管网络的遗传模型联合使用。重要的是，该方法可提供多种读出指标，用于评估皮下脂肪组织的整体健康状况及其灌注的血液和淋巴脉管系统。该方案可便捷地应用于银屑病和感染等急性和慢性皮肤病过程中淋巴和血液脉管网络的分析。
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方案
所有动物实验均按照当地伦理委员会的规定进行。
注意：Prox1-cre-ERT2（Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J，Jax #022075）和Rosa26-LSL-tdTomato（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J，Ai9，Jax #007914）购自杰克逊实验室，通过杂交获得可诱导的淋巴示踪小鼠品系Prox1-cre-ERT2::tdTomato。小鼠回交至C57BL/6背景10代。6周龄的Prox1-cre-ERT2::tdTomato雄性小鼠接受含他莫昔芬的饲料喂养3周。他莫昔芬饲料购自Envigo Teklad（饲料编号TD.130857；500 mg/kg）。实验在12至14周龄小鼠中进行。本方案适用于任何年龄、性别或品系的小鼠。
1. 材料准备
- 使用70%乙醇对剪刀、镊子和解剖针进行灭菌。
- 准备两支1 mL注射器，配备25至27号针头。对于皮下注射，建议使用微量注射器向足垫上部注射10 μL。
- 在塑料1.5 mL离心管中，将DyLight 488标记的凝集素用无菌PBS稀释至终浓度为100 μg/mL，配制体积为200 µL。
- 在另一个塑料1.5 mL离心管中，将DyLight 649标记的凝集素用无菌PBS稀释至终浓度为100 μg/mL，配制体积为100 µL。
- 准备一个含有PBS的6孔板，并置于冰上保存。
- 配制4%多聚甲醛和30%蔗糖的溶液。
2. 皮下脂肪组织血管和淋巴管的标记。
- 通过吸入5%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过用力捏压动物的足爪来评估麻醉深度，以确保动物在操作过程中不受伤害。麻醉应持续维持至凝集素注射步骤结束或实施安乐死为止。
- 通过尾静脉静脉注射100 µL DyLight 488标记的凝集素，以标记血管系统。注射后等待15分钟，再进行组织取材。
- 使用另一支注射器，将10 µL DyLight 649标记的凝集素注射至动物足垫上部皮下，以标记引流淋巴管。注射后等待15分钟，再进行组织取材。
- 在注射后15分钟，通过颈椎脱位或暴露于CO2对小鼠实施安乐死。
3. 皮下脂肪组织的采集
- 将小鼠仰卧位固定于解剖板上。
- 用70%乙醇对小鼠体表毛发进行消毒。
- 用镊子提起侧腹部皮肤，做横向切口以暴露臂部脂肪垫。
- 轻柔牵拉皮肤，使其与臂部脂肪组织分离，从而完整暴露包含淋巴结及淋巴收集管的皮下臂部脂肪组织。
- 使用镊子和剪刀，小心剥离皮下脂肪组织，并将其转移至含有冷PBS的培养皿中。为获得最佳效果，建议将脂肪组织完整取出，保持为单一块状。
- 此后操作中，需避免组织暴露于光照下。
4. 组织固定
- 将收获的组织浸入含有4%多聚甲醛和30%蔗糖的溶液中。
- 在制备成像样品前，将组织在此溶液中孵育至少过夜。
5. 染色与成像
- 为获得最佳结果，按照 Gilleron 及其同事20所述方法进行组织透明化和三维共聚焦成像。我们建议使用光片显微镜分析大块组织。在透明化过程中可进行额外染色。
- 为实现最佳组织定位，建议使用以下抗体：
脂肪细胞：Perilipin
巨噬细胞：CD68 和 CD11b 染色
树突状细胞：MHC II 和 CD11b
B 细胞：B220（CD45R）染色
T 细胞：CD3 染色
注意：该方法可与遗传模型联用以标记免疫细胞。 - 通过活体双光子显微镜分析淋巴引流管时，将凝集素注射至足底皮肤下，并观察腘窝部淋巴引流管。
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结果
为了对臂部脂肪组织中的血管和淋巴管网络进行拓扑分析，我们皮下注射了 Alexa Fluor 649 标记的凝集素，并通过静脉注射了 Alexa Fluor 488 标记的凝集素。随后小心地切除臂部脂肪组织，固定后进行透明化处理，并通过整体染色法进行分析。该实验流程的示意图见图1A。血管以绿色标记，淋巴管以红色标记。臂部脂肪组织中包含一条进入臂淋巴结的单一淋巴引流管。我们此前已发表过采用该方法获得的结果16。此外，我们还利用遗传性淋巴系统标记（Prox1creERT2 × TdTomatofl/fl 小鼠）获得了类似的数据16（图1B）。静脉注射凝集素后，血管系统被有效标记（蓝色）。值得注意的是，皮下注射的凝集素特异性地标记了淋巴引流管（红色）（图1B）。为确认淋巴管和血管标记的特异性，我们采用了 Prox1cre...
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讨论
该方法可高效且稳健地标记皮下脂肪组织中的血液和淋巴管血管系统。分别分析血液和淋巴内皮网络，有助于揭示在肥胖或其他病理状态下影响一个或两个循环系统的致病机制。本方案旨在分析血管系统的结构、其与基质细胞和免疫细胞的相互作用，以及在健康与疾病状态下的功能特性。
该方法得益于存在引流前臂皮肤的淋巴结，该淋巴结嵌于皮下脂肪组织中。如图1所示，该方法可获得与遗传报告基因标记或抗体染色相似的结果，同时避免了前文讨论的诸多局限性。该方法不仅提供了一种简便的手段，可分别标记血管和淋巴管系统，还能对后者功能以及组织整体健康状况进行多种评估。值得注意的是，染料出现在间质组织空间可能提示血管通透性增加。此外，可通过时间序列分析引流淋巴结中染料的出现情况，作为淋巴流动速率的相对衡量指标。
另一个需要考虑的参数是白细胞与血管和淋巴管的关联。已知免疫细胞，特别是巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，在肥胖中发挥关键作用21。值得注意的是，我们此前已报道过树突...
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披露
作者声明无披露事项及利益冲突。
致谢
SI 受法国国家健康与医学研究院（Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale，INSERM）和法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche，ANR-17-CE14-0017-01 和 ANR-19-ECVD-0005-01）资助。AG 受法国政府通过国家科研署（ANR）管理的“未来投资计划”中 UCAJedi 项目（参考编号 ANR-15-IDEX-01）资助。RSC 受 Lawrence C. Pakula 医学博士炎症性肠病教育与创新基金（Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund）项目 FA-2020-01-IBD-1 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 凝集素 DyLight 649 | Vector Labs | DL-1178-1 | 见实验方案描述 |
| 凝集素 DyLight 488 | Vector Labs | DL-1174 | 见实验方案描述 |
| 多聚甲醛 | VWR Chemicals | 9713.1000 | |
| 蔗糖 | Euromedex | CAS 编号 57-50-1 | |
| 抗 Podoplanin 抗体 | AngioBio | 11-033 | 稀释比例：1/50 |
| 凝集素 DyLight 594 | Vector Labs | DL-1177 | 见实验方案描述 |
| 抗 MHCII 抗体（克隆号 M5/114.15.2） | Biolegend | 107618 | 稀释比例：1/100 |
| 抗 CD11b 抗体（克隆号 M1/70） | Biolegend | 101218 | 稀释比例：1/100 |
| 抗 CD68 抗体（克隆号 FA.11） | Biolegend | 137004 | 稀释比例：1/100 |
| 抗 B220 抗体（克隆号 RA3-6B2） | Biolegend | 103225 | 稀释比例：1/100 |
| 抗 Perilipin 抗体（克隆号 PERI 112.17） | Progen | 651156 | 稀释比例：1/50 |
| 抗 CD3 抗体（克隆号 17A2） | Biolegend | 100210 | 稀释比例：1/100 |
参考文献
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acute Infection Compromise Tissue-Specific Immunity. Cell. 163 (2), 354-366 (2015).
- Thomas, S. N., et al. Impaired humoral immunity and tolerance in K14-VEGFR-3-Ig mice that lack dermal lymphatic drainage. The Journal of Immunology. 189 (5), 2181-2190 (2012).
- Kuan, E. L., et al. Collecting lymphatic vessel permeability facilitates adipose tissue inflammation and distribution of antigen to lymph node-homing adipose tissue dendritic cells. The Journal of Immunology. 194 (11), 5200-5210 (2015).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2017).
- Harvey, N. L., et al. Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nature Genetics. 37 (10), 1072-1081 (2005).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Wu, J., Cohen, P., Spiegelman, B. M. Adaptive thermogenesis in adipocytes: is beige the new brown. Genes and Development. 27 (3), 234-250 (2013).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
- Kataru, R. P., et al. Regulation of Lymphatic Function in Obesity. Frontiers in Physiology. 11, 459(2020).
- Escobedo, N., Oliver, G. The Lymphatic Vasculature: Its Role in Adipose Metabolism and Obesity. Cell Metabolism. 26 (4), 598-609 (2017).
- Weitman, E. S., et al. Obesity impairs lymphatic fluid transport and dendritic cell migration to lymph nodes. PLoS One. 8 (8), 70703(2013).
- Escobedo, N., et al. Restoration of lymphatic function rescues obesity in Prox1-haploinsufficient mice. JCI Insight. 1 (2), (2016).
- Commerford, C. D., et al. Mechanisms of Tumor-Induced Lymphovascular Niche Formation in Draining Lymph Nodes. Cell Reports. 25 (13), 3554-3563 (2018).
- Gregory, J. L., et al. Infection Programs Sustained Lymphoid Stromal Cell Responses and Shapes Lymph Node Remodeling upon Secondary Challenge. Cell Reports. 18 (2), 406-418 (2017).
- Ivanov, S., et al. CCR7 and IRF4-dependent dendritic cells regulate lymphatic collecting vessel permeability. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1581-1591 (2016).
- Zhong, W., et al. Prox1-GFP/Flt1-DsRed transgenic mice: an animal model for simultaneous live imaging of angiogenesis and lymphangiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 581-598 (2017).
- Choi, I., et al. Visualization of lymphatic vessels by Prox1-promoter directed GFP reporter in a bacterial artificial chromosome-based transgenic mouse. Blood. 117 (1), 362-365 (2011).
- Pham, T. H., et al. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 17-27 (2010).
- Gilleron, J., et al. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
- Ivanov, S., Merlin, J., Lee, M. K. S., Murphy, A. J., Guinamard, R. R. Biology and function of adipose tissue macrophages, dendritic cells and B cells. Atherosclerosis. 271, 102-110 (2018).
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