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方法文章

在轨道摇床中于6孔板内分割培养内皮细胞以用于力学生物学研究

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DOI：

10.3791/61817

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2021年6月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Singapore, 4Singapore Eye Research Institute, The Academia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种包被方法，用于在6孔板的特定区域限制内皮细胞生长，以便利用轨道摇床模型施加剪切应力。

摘要

血流对动脉壁施加的剪切应力会影响内皮细胞的形态和功能。已有假说认为，低强度、振荡性和多向性的剪切应力均可刺激内皮细胞呈现促动脉粥样硬化表型，而高强度、单向或单轴剪切应力则被认为有助于维持内皮细胞稳态。这些假说仍需进一步研究验证，但传统的体外实验技术存在局限性，尤其难以在细胞上施加多向性剪切应力。

一种日益广泛应用的方法是在轨道摇床平台上，于标准多孔板中培养内皮细胞；在这种简单、低成本、高通量且适用于慢性刺激的实验方法中，旋转的培养液在孔板的不同区域产生不同模式和强度的剪切力，包括多向剪切力。然而，该方法存在一个显著局限性：暴露于某一类型流体剪切力区域的细胞可能向培养基中释放介质分子，从而影响孔板其他区域暴露于不同流体条件下的细胞，导致流场特征与细胞表型之间的表观关联关系发生扭曲。

本文介绍了一种简便且经济的方法改进，可使细胞仅暴露于特定的剪切应力特性下。通过在培养孔的特定区域包被纤连蛋白，并随后使用封闭液进行封闭，从而将细胞接种限制在该定义区域内。随后，可将培养板在摇床上旋转，使细胞暴露于明确定义的剪切应力模式下，例如低强度多向剪切或高强度单向剪切，具体取决于其所在位置。与之前方法相同，该方法仍使用标准细胞培养塑料器皿，便于后续对细胞进行直接分析。该改进方法已成功用于证明在特定剪切应力条件下内皮细胞释放的可溶性介质能够影响培养孔中其他位置的细胞。

引言

血管细胞对其力学环境的响应在血管的正常功能及疾病发生过程中具有重要意义1。覆盖所有血管内表面的内皮细胞（ECs）的力学生物学特性一直是力学生物学研究的重点，因为ECs直接承受血流在其表面产生的剪切应力。多种表型变化，如炎症反应、刚度和形态的改变、血管活性物质的释放以及连接蛋白的定位与表达，均依赖于ECs对剪切应力的暴露2,3,4。依赖剪切力的内皮细胞特性也可能解释动脉粥样硬化等疾病呈斑片状分布的原因5,6,7。

在培养条件下研究剪切力对内皮细胞（ECs）的影响非常有意义，因为在这种环境中可以精确控制应力，并将ECs与其他细胞类型分离。常用的体外施加剪切应力的装置包括平行板流动腔和锥板黏度计，但这些装置只能施加单向稳态、振荡或脉动流8,9。尽管已有研究开发出具有锥形或分叉结构的改良流动腔以及模拟狭窄血管几何结构的微流控芯片，但其通量较低，且可维持的培养时间相对较短，仍存在挑战10, 11。

用于研究内皮细胞力传导的轨道摇床（或称涡旋孔板）方法正受到越来越多的关注，该方法将细胞培养在标准细胞培养塑料器皿中，并将器皿置于轨道摇床平台上，能够以高通量的方式长期施加复杂且空间上变化的剪切应力模式于内皮细胞（ECs）上（参见 Warboys 等人的综述12）。已有研究采用计算流体动力学（CFD）模拟来表征涡旋孔板中剪切应力的空间和时间变化。当培养板放置在轨道摇床平台上并随其做轨道运动时，培养基产生的涡旋流动导致在6孔板孔的中心区域形成低幅多向流（LMMF，推测为促动脉粥样硬化性血流），而在孔的边缘区域则形成高幅单向流（HMUF，推测为抗动脉粥样硬化性血流）。例如，在转速为150 rpm、轨道半径为5 mm的条件下，6孔板中心区域的时间平均壁面剪切应力（TAWSS）约为0.3 Pa，边缘区域约为0.7 Pa13。该方法仅需使用 commercially available 塑料器皿和轨道摇床本身。

然而，该方法（以及其他在体外施加流体的方法）存在一个缺点：内皮细胞（ECs）会以依赖剪切力的方式释放可溶性介质和微颗粒14,15,16，由于培养液的涡旋混合，这些分泌物可能影响培养孔中非其释放区域的其他内皮细胞，从而掩盖剪切应力对内皮细胞表型的真实影响。例如，Ghim 等人推测，这可以解释不同剪切力分布对大颗粒跨细胞转运表现出看似相同影响的原因17。

本文介绍一种利用纤连蛋白包被在6孔板的特定区域促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附的方法，同时使用Pluronic F-127钝化表面以阻止其他区域的细胞生长。该方法克服了上述局限性，因为通过分割细胞生长区域，内皮细胞仅暴露于单一类型的剪切力环境，不会受到孔板其他区域暴露于不同剪切力条件下的内皮细胞所分泌的分泌组的影响。

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方案

1. 装置的制备与试剂的配制

  1. 不锈钢模块的制备
    1. 根据提供的工程图纸（图1），使用数控铣床（CNC）将316级不锈钢加工成不锈钢模块。
  2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具的3D打印
    1. 根据提供的工程图纸，使用SolidWorks软件建立PDMS模具的三维计算机辅助设计（CAD）模型（图2）。
    2. 将CAD模型导出为STL文件，并将该STL文件导入Cura 2.6.2软件中。
    3. 对模型进行切片处理，设置打印速度为50 mm/s，填充密度为60%。
    4. 将文件导出为G代码，并上传至Ultimaker2 3D打印机进行打印，使用聚乳酸（PLA）作为打印材料。
  3. PDMS环的浇铸
    1. 将PDMS基础液和固化剂（均来自硅橡胶试剂盒）按90.9%基础液和9.1%固化剂的比例混合。
    2. 将约2.6 mL充分混合的溶液倒入3D打印的模具中。
    3. 在真空脱泡室中去除气泡。
    4. 在80 °C的烘箱中固化1小时。
    5. 让PDMS环冷却至室温，然后小心地从模具中取出固化后的PDMS环。PDMS环的工程图纸见图3。
  4. 1% Pluronic F-127溶液的配制
    1. 称取5 g Pluronic F-127，倒入玻璃瓶中，再向瓶中加入100 mL无菌水，得到5% Pluronic F-127溶液。
    2. 确保所有Pluronic F-127粉末完全浸入水中，盖紧瓶盖，使用液体灭菌程序进行高压灭菌。
    3. 高压灭菌后，待溶液冷却至室温后再使用。
    4. 取10 mL 5% Pluronic F-127溶液加入40 mL经高压灭菌的无菌水中，配制成1% Pluronic F-127溶液。稀释操作应在生物安全柜（BSC）中进行。
    5. 将1%和5%的Pluronic F-127溶液均于室温下储存。
  5. 4%多聚甲醛（PFA）溶液的配制
    1. 向玻璃烧杯中加入800 mL磷酸盐缓冲液（PBS），加热至60 °C并持续搅拌（从步骤1.5.1至1.5.5保持搅拌）。
    2. 称取40 g PFA粉末，加入温热的PBS溶液中。
      注意：PFA具有危害性，步骤1.5.2至1.5.6应在通风橱中操作。
    3. 缓慢逐滴加入1 M氢氧化钠（NaOH）溶液，直至溶液变澄清。
    4. 用1 M盐酸（HCl）调节PFA溶液的pH值至约7.4。
    5. 用1×PBS定容至1 L，得到1 L的4% PFA溶液。
    6. 使用0.2 µm滤膜过滤PFA溶液以去除颗粒物，分装后于-20 °C冰箱中冷冻保存。
  6. 0.1% Triton-X溶液的配制
    1. 将50 µL纯Triton-X加入50 mL PBS中，配制成0.1% Triton-X溶液。
  7. 1%牛血清白蛋白（BSA）溶液的配制
    1. 称取0.5 g BSA，倒入50 mL离心管中，再向管中加入50 mL PBS。
    2. 在室温下使用滚轴混合仪滚动1小时，使其充分溶解。
    3. 将1% BSA溶液于4 °C保存，可保存最多两周。

2. 6孔板的包被

  1. 使用前将不锈钢模块、PDMS环和镊子进行高压灭菌。所有后续操作均须在生物安全柜中进行，并遵循无菌技术以确保无菌状态。
  2. 用镊子将PDMS环放入6孔板中。利用PDMS环的外缘将其与孔板同心对齐。
    注意：仅可使用未经组织培养处理的孔板。
  3. 用镊子将不锈钢模块放置在PDMS环上方。
  4. 将内卡环钳的尖端插入卡环的握持孔中，挤压钳子以缩小卡环直径。将卡环装入6孔板中，将其牢固压在不锈钢模块上，然后松开钳子，以固定PDMS环于孔内。
  5. 通过PDMS环和不锈钢模块的开口处，向孔的中心或边缘（根据感兴趣区域而定）加入1 mL浓度为5 µg/mL的纤连蛋白溶液。
  6. 轻轻摇动孔板，确保纤连蛋白溶液覆盖整个目标区域。
  7. 在37 °C、95%空气/5% CO2的湿化培养箱中孵育30分钟。
  8. 从孔中移除纤连蛋白溶液，并用PBS洗涤两次。彻底清除孔中的PBS。
  9. 从孔中移除卡环、不锈钢模块和PDMS环。
  10. 向孔的中心或边缘（未包被表面）加入1.5 mL的1% Pluronic F-127溶液，在室温下孵育1小时，以钝化未包被表面。
  11. 从孔中移除Pluronic F-127溶液，并用PBS洗涤三次。
  12. 立即使用包被好的孔，或在包被的孔中加入一层PBS后，于4 °C保存最多两周。

3. HUVEC 的接种

  1. 实验中使用传代次数低于5代的HUVECs。
  2. 移除所有培养基，并用PBS洗涤细胞一次。
  3. 加入3 mL 0.05%胰蛋白酶，于37 °C、95%空气/5% CO2的湿化培养箱中孵育3分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。
    注意：本方案已使用HUVECs进行测试，其他类型内皮细胞的胰蛋白酶浓度和孵育时间可能有所不同。
  4. 将溶液转移至15 mL离心管中，加入6 mL预热至37 °C的培养基（例如Lonza EGM-2）以中和胰蛋白酶。
  5. 以200 × g离心5分钟。弃去中和后的胰蛋白酶溶液，用1 mL预热的培养基重悬细胞。
  6. 使用血细胞计数板计数细胞，并将18万个细胞接种至包被的6孔板中，每孔加入1.5 mL预热的培养基。
  7. 水平轻轻摇动培养板，确保细胞在孔内均匀分布。
  8. 置于37 °C、95%空气/5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
  9. 移除未贴壁的细胞和培养基，更换为2 mL预热的培养基。
    ​注意：培养基中可观察到大量未贴壁的漂浮细胞。

4. 使用轨道摇床施加剪切应力

  1. HUVEC 在培养 3 天后应达到汇合状态。更换为 1.9 mL 预热的培养基（以达到 2 mm 的液面高度）。
  2. 将培养板置于恒温振荡摇床的平台上，在含 95% 空气和 5% CO2 的湿润培养箱中，以 150 rpm 振荡培养 3 天。
    注意：将摇床放入培养箱前，需用 70% 乙醇擦拭其外表面。
  3. （可选）在施加剪切力 2 天后，可向培养基中添加细胞因子，以研究细胞因子与剪切应力之间的相互作用。处理后，继续对细胞施加 1 天剪切力。本研究中使用 TNF-α 激活细胞。
  4. 在施加剪切应力 3 天后进行各项分析。

5. 细胞染色与成像

  1. 剪切作用3天后，从培养箱中取出培养板，用PBS洗涤细胞两次。
  2. 向孔中加入1.5 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温下孵育10分钟。
  3. 移除孔中的4% PFA，并用PBS洗涤两次。
  4. 向孔中加入0.1% Triton-X进行细胞通透处理，在室温下孵育5分钟。
  5. 移除0.1% Triton-X溶液，向孔中加入1.5 mL 1% BSA进行封闭。在室温下用1% BSA孵育细胞1小时。
  6. 用1% BSA将兔抗人ZO-1抗体按1:200比例稀释。向孔中加入1.5 mL稀释后的抗体，在4 °C下与细胞孵育过夜。
  7. 过夜孵育后，移除稀释的抗体，并用PBS洗涤细胞三次。
  8. 用PBS将Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗按1:300比例稀释。向孔中加入1.5 mL稀释后的二抗，在室温下与细胞孵育1小时。
  9. 移除稀释的二抗，并用PBS洗涤细胞两次。
  10. 用PBS将DRAQ5按1:1000比例稀释。向孔中加入1.5 mL稀释后的DRAQ5，在室温下孵育15分钟以染色细胞核。
  11. 移除稀释的DRAQ5，并用PBS洗涤三次。
  12. 使用共聚焦显微镜对孔从边缘到中心进行拼接扫描。

6. 形状指数与细胞数量的定量分析

  1. 使用 MATLAB R2016a 对图像进行后处理。
  2. 将共聚焦显微镜的 LIF 文件读入 MATLAB，并将合并的拼接扫描图像转换为二值图像，然后根据面积和强度对图像进行阈值处理，以区分细胞核与背景。
  3. 将二值化的拼接扫描图像划分为 1 mm 的径向片段。
  4. 对每个单独的细胞核拟合椭圆。
  5. 统计每个径向片段内椭圆的数量，以获得细胞数量。
  6. 定义形状指数 SI = 4π × 面积 / 周长2。计算每个椭圆的形状指数18。

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结果

通过Pluronic F-127封闭后，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在未包被纤连蛋白的培养板区域上的黏附被完全抑制；无论是否施加剪切应力，在培养72小时后，细胞生长均局限于纤连蛋白包被的区域（图4A，图4C）。若未使用Pluronic F-127进行封闭，HUVECs则会黏附在无纤连蛋白的表面，并在培养72小时后进一步增殖（图4B，图4D）。

在具有高剪切流体力（HMUF）的漩涡状孔板边缘，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）呈现出明显的排列与伸长；而在孔板中心区域，由于处于低剪切流体力（LMMF）环境，细胞表现为鹅卵石样形态，无明显排列图 5A,

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讨论

涡旋孔法能够在单个孔中产生复杂的流动模式——孔中心为低强度多向流动（LMMF），孔边缘为高强度单向流动（HMUF）。然而，由剪切应力介导的可溶性介质分泌物会在涡旋液体中混合，从而影响整个孔内的细胞，可能掩盖特定剪切应力模式对细胞的真实效应。

本实验所展示的包被方法通过将细胞生长限制在孔板的特定区域，解决了这一问题。细胞通常倾向于附着在亲水性表面，而非疏水性表面。因此，聚苯乙烯培养器皿需预先经过等离子体氧化处理以增强亲水性。或者，也可在疏水性表面包被细胞外基质蛋白（如本方案中所示的纤连蛋白）；未包被纤连蛋白的区域则用Pluronic F-127进行钝化处理，以防止细胞在疏水表面发生任何残留性黏附。

该实验方案依赖于打印模具的精确性。根据不同的3D打印机，模具的实际尺寸可能存在差异。这将影响最终的PDMS结构，导致细胞在孔内错误的位置上黏附。因此，细胞所经历的剪切应力分布将不同于CFD模拟的结果。使用3D打印机的另一个缺点是，由于打印过程中可能发生翘曲，模具表面可能不平整。这会导致最终的PDMS结构无法有效阻止Pluronic F...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢英国心脏基金会项目资助（资助对象：PDW）、新加坡国家医学研究委员会TAAP和DYNAMO资助（资助对象：XW，NMRC/OFLCG/004/2018，NMRC/OFLCG/001/2017）、新加坡科技研究局研究生奖学金（资助对象：KTP）以及英国心脏基金会研究中心卓越中心博士生奖学金（资助对象：MA）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞与培养基
内皮细胞生长培养基（EGM-2）Lonzacc-3162
人脐静脉内皮细胞NANA取自哈默史密斯医院无并发症分娩供者的脐带
<强>试剂与材料
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG赛默飞世尔科技A11008
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418-50G
Falcon 6 孔透明平底未处理板 科学实验室用品有限公司 351146
牛血浆纤维连接蛋白Sigma-AldrichF1141-5MG
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127-500G
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8537-6X500ML
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
重组人TNF-αPeprotech300-01A
RS PRO 2.85 mm 黑色 PLA 3D 打印机耗材，1 kgRS832-0264
不锈钢316金属超市NA
Sylgard184 硅弹性体试剂盒法内尔101697
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma-AldrichT4049-100ML
闭锁小带蛋白-1（ZO-1）抗体Cell Signaling Technology13663
DRAQ5 (5 mM)生物状态DR50200
<强>设备
Grant轨道摇床 PSU-10i科学实验室用品有限公司 SHA7930
Leica TCS SP5 共聚焦显微镜LeicaNA
挡圈钳MisumiRTWP32-58
卡环/内装式/C型MisumiRTWS35
Ultimaker 2+ 3D 打印机UltimakerNA
<强>软件
Cura 2.6.2UltimakerNA
MATLABThe MathWorksNA
Solidworks 2016达索系统NA

参考文献

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