在轨道摇床中于6孔板内分割培养内皮细胞以用于力学生物学研究

摘要

本方案描述了一种包被方法，用于在6孔板的特定区域限制内皮细胞生长，以便利用轨道摇床模型施加剪切应力。

摘要

血流对动脉壁施加的剪切应力会影响内皮细胞的形态和功能。已有假说认为，低强度、振荡性和多向性的剪切应力均可刺激内皮细胞呈现促动脉粥样硬化表型，而高强度、单向或单轴剪切应力则被认为有助于维持内皮细胞稳态。这些假说仍需进一步研究验证，但传统的体外实验技术存在局限性，尤其难以在细胞上施加多向性剪切应力。

一种日益广泛应用的方法是在轨道摇床平台上，于标准多孔板中培养内皮细胞；在这种简单、低成本、高通量且适用于慢性刺激的实验方法中，旋转的培养液在孔板的不同区域产生不同模式和强度的剪切力，包括多向剪切力。然而，该方法存在一个显著局限性：暴露于某一类型流体剪切力区域的细胞可能向培养基中释放介质分子，从而影响孔板其他区域暴露于不同流体条件下的细胞，导致流场特征与细胞表型之间的表观关联关系发生扭曲。

本文介绍了一种简便且经济的方法改进，可使细胞仅暴露于特定的剪切应力特性下。通过在培养孔的特定区域包被纤连蛋白，并随后使用封闭液进行封闭，从而将细胞接种限制在该定义区域内。随后，可将培养板在摇床上旋转，使细胞暴露于明确定义的剪切应力模式下，例如低强度多向剪切或高强度单向剪切，具体取决于其所在位置。与之前方法相同，该方法仍使用标准细胞培养塑料器皿，便于后续对细胞进行直接分析。该改进方法已成功用于证明在特定剪切应力条件下内皮细胞释放的可溶性介质能够影响培养孔中其他位置的细胞。

引言

血管细胞对其力学环境的响应在血管的正常功能及疾病发生过程中具有重要意义¹。覆盖所有血管内表面的内皮细胞（ECs）的力学生物学特性一直是力学生物学研究的重点，因为ECs直接承受血流在其表面产生的剪切应力。多种表型变化，如炎症反应、刚度和形态的改变、血管活性物质的释放以及连接蛋白的定位与表达，均依赖于ECs对剪切应力的暴露^2,3,4。依赖剪切力的内皮细胞特性也可能解释动脉粥样硬化等疾病呈斑片状分布的原因^5,6,7。

在培养条件下研究剪切力对内皮细胞（ECs）的影响非常有意义，因为在这种环境中可以精确控制应力，并将ECs与其他细胞类型分离。常用的体外施加剪切应力的装置包括平行板流动腔和锥板黏度计，但这些装置只能施加单向稳态、振荡或脉动流^8,9。尽管已有研究开发出具有锥形或分叉结构的改良流动腔以及模拟狭窄血管几何结构的微流控芯片，但其通量较低，且可维持....

方案

1. 装置的制备与试剂的配制

1. 不锈钢模块的制备
   1. 根据提供的工程图纸（图1），使用数控铣床（CNC）将316级不锈钢加工成不锈钢模块。
2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具的3D打印
   1. 根据提供的工程图纸，使用SolidWorks软件建立PDMS模具的三维计算机辅助设计（CAD）模型（图2）。
   2. 将CAD模型导出为STL文件，并将该STL文件导入Cura 2.6.2软件中。
   3. 对模型进行切片处理，设置打印速度为50 mm/s，填充密度为60%。
   4. 将文件导出为G代码，并上传至Ultimaker² 3D打印机进行打印，使用聚乳酸（PLA）作为打印材料。
3. PDMS环的浇铸
   1. 将PDMS基础液和固化剂（均来自硅橡胶试剂盒）按90.9%基础液和9.1%固化剂的比例混合。
   2. 将约2.6 mL充分混合的溶液倒入3D打印的模具中。
   3. 在真空脱泡室中去除气泡。
   4. 在80 °C的烘箱中固化1小时。
   5. 让PDMS环冷却至室温，然后小心地从模具中取出固化后的PDMS环。PD....

结果

通过Pluronic F-127封闭后，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在未包被纤连蛋白的培养板区域上的黏附被完全抑制；无论是否施加剪切应力，在培养72小时后，细胞生长均局限于纤连蛋白包被的区域（图4A，图4C）。若未使用Pluronic F-127进行封闭，HUVECs则会黏附在无纤连蛋白的表面，并在培养72小时后进一步增殖（图4B，图4D）。

在具有高剪切流体力（HMUF）的漩涡状孔板边缘，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）呈现出明显的排列与伸长；而在孔板中心区域，由于处于低剪切流体力（LMMF）环境，细胞表现为鹅卵石样形态，无明显排列图 5A,

讨论

涡旋孔法能够在单个孔中产生复杂的流动模式——孔中心为低强度多向流动（LMMF），孔边缘为高强度单向流动（HMUF）。然而，由剪切应力介导的可溶性介质分泌物会在涡旋液体中混合，从而影响整个孔内的细胞，可能掩盖特定剪切应力模式对细胞的真实效应。

本实验所展示的包被方法通过将细胞生长限制在孔板的特定区域，解决了这一问题。细胞通常倾向于附着在亲水性表面，而非疏水性表面。因此，聚苯乙烯培养器皿需预先经过等离子体氧化处理以增强亲水性。或者，也可在疏水性表面包被细胞外基质蛋白（如本方案中所示的纤连蛋白）；未包被纤连蛋白的区域则用Pluronic F-127进行钝化处理，以防止细胞在疏水表面发生任何残留性黏附。

该实验方案依赖于打印模具的精确性。根据不同的3D打印机，模具的实际尺寸可能存在差异。这将影响最终的PDMS结构，导致细胞在孔内错误的位置上黏附。因此，细胞所经历的剪切应力分布将不同于CFD模拟的结果。使用3D打印机的另一个缺点是，由于打印过程中可能发生翘曲，模具表面可能不平整。这会导致最终的PDMS结构无法有效阻止Pluronic F.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞与培养基
内皮细胞生长培养基（EGM-2）	Lonza	cc-3162
人脐静脉内皮细胞	NA	NA	取自哈默史密斯医院无并发症分娩供者的脐带
<强>试剂与材料
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG	赛默飞世尔科技	A11008
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418-50G
Falcon 6 孔透明平底未处理板	科学实验室用品有限公司	351146
牛血浆纤维连接蛋白	Sigma-Aldrich	F1141-5MG
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127-500G
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537-6X500ML
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
重组人TNF-α	Peprotech	300-01A
RS PRO 2.85 mm 黑色 PLA 3D 打印机耗材，1 kg	RS	832-0264
不锈钢316	金属超市	NA
Sylgard184 硅弹性体试剂盒	法内尔	101697
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
闭锁小带蛋白-1（ZO-1）抗体	Cell Signaling Technology	13663
DRAQ5 (5 mM)	生物状态	DR50200
<强>设备
Grant轨道摇床 PSU-10i	科学实验室用品有限公司	SHA7930
Leica TCS SP5 共聚焦显微镜	Leica	NA
挡圈钳	Misumi	RTWP32-58
卡环/内装式/C型	Misumi	RTWS35
Ultimaker 2+ 3D 打印机	Ultimaker	NA
<强>软件
Cura 2.6.2	Ultimaker	NA
MATLAB	The MathWorks	NA
Solidworks 2016	达索系统	NA