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一种用于大鼠脑组织的疏水性组织透明化方法

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DOI：

10.3791/61821

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2020年12月23日

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1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

本文内容

摘要

本文介绍了一种疏水性组织透明化方法，可实现将目标分子作为完整脑结构的一部分进行观察。该技术现已在F344/N对照组和HIV-1转基因大鼠（两性）中得到验证。

摘要

疏水性组织透明化方法是一种易于调整、快速且低成本的流程，可用于在未改变的组织样本中研究目标分子。传统的免疫标记方法需要将样本切成薄片，这限制了对完整结构进行标记和观察的能力。然而，如果脑组织在处理过程中能够保持完整，则结构和神经环路也能保持完整，从而便于分析。以往建立的透明化方法需要较长时间才能完全透明组织，且所用的强化学试剂常常会损伤敏感的抗体。iDISCO方法能够快速而彻底地透明组织，适用于多种抗体，且无需特殊实验设备。该技术最初在小鼠组织中得到验证，而本方案将其改进并应用于对照组和转基因大鼠脑半球的成像。此外，本方案还对已有流程进行了多项优化，以获得背景染色更少、图像更清晰的结果。使用本疏水性组织透明化方法，在HIV-1转基因大鼠和F344/N对照大鼠中验证了Iba-1和酪氨酸羟化酶的抗体。脑是一个相互交织的网络，其结构通常协同工作而非独立运作。将脑作为一个整体系统而非多个独立部分的组合来进行分析，是这种全脑透明化方法的最大优势。

引言

多种组织透明化技术已验证可用于脑组织：基于水凝胶的技术、亲水性技术以及疏水性技术。这些技术旨在通过脱脂、脱色和脱钙过程，使用溶剂处理使组织变得透明。当组织样本的折射率与所选成像介质的折射率相匹配时，即可获得清晰的样本图像。基于水凝胶的技术（如CLARITY）通过将生物分子与丙烯酰胺基水凝胶交联，从而在组织中固定这些分子，防止结构损伤和蛋白质丢失1。然而，水凝胶技术使用的化学试剂较为剧烈，可能对更脆弱的组织造成损伤，且致密的组织样本可能不适用于水凝胶方案。某些水凝胶技术可能需要昂贵的设备，或导致组织膨胀。亲水性技术（如CUBIC）通过在组织内部形成氢键来维持三维结构2。在某些亲水性方案中也可能发生组织膨胀。亲水性技术的透明化能力通常不及疏水性技术，而后者对于更致密和更厚的组织尤为重要3。

疏水性技术通常速度快，不需要特殊设备，且产生的样品易于操作和保存。iDISCO 是一种疏水性技术，可消除其他疏水性方案中可能出现的组织收缩。最初，iDISCO 组织透明化技术由 Renier 等人4报道，用于小鼠胚胎及致密的成年器官。该技术在初始脱水步骤中去除组织中的水分，从而减少光散射。在预处理过程中，组织被通透化，以允许抗体深入渗透。免疫标记使用远红光谱的 Alexa Fluor 染料，以避免组织在较低波长下的自发荧光5。经过疏水性透明化处理的组织易于操作，并且由于 Alexa Fluor 染料具有较长的稳定性，可多次成像。若储存得当，组织在初次处理后可提供持续数月到一年的成像结果。

在本实验方案中，酪氨酸羟化酶（TH）抗体、Iba1抗体以及霍乱毒素亚基B（CTB）被用于雄性和雌性对照组及HIV-1转基因（Tg）大鼠脑组织。HIV-1 Tg大鼠携带构成HIV-1病毒基因组九个基因中的七个，从而形成一种长期暴露于HIV-1蛋白的非感染性模型6,7,8。既往研究已证实HIV-1 Tg大鼠存在多巴胺能系统的改变，而HIV-1本身是一种炎性疾病，因此所选抗体与实验设计密切相关9,10,11,12。CTB是一种通过结合神经节苷脂标记神经元的示踪剂，可用于追踪脑内的传入神经投射。此前已有研究利用CTB探索伏隔核至黑质区域的神经投射，这两个脑区均深度参与多巴胺能通路13,14,15。

在本实验方案中，TH 将作为多巴胺生成的标志物，Iba1 将标记活化的小胶质细胞。所用的 TH 抗体可特异性地标记一条分子量约为 62 kDa 的条带，对应于酪氨酸羟化酶。Iba1 抗体则针对 Iba1 的羧基末端序列。这两种抗体均为兔源多克隆抗体。CTB 将用于从伏隔核区域逆行追踪至黑质区域的神经元。本方案还提供了对原始 iDISCO 方案进行调整的两种指导方法：1）通过更换封闭步骤中的血清试剂，整体降低背景染色；2）调整孵育时间，以适用于较大的组织样本。总体而言，本方案进一步证明，疏水性透明技术在大鼠脑组织中是可行的，与 HIV-1 病毒蛋白无明显不良相互作用，并且与 TH 抗体、Iba1 抗体以及 CTB 兼容。

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方案

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准。

1. 储备液的配制

  1. 溶液1（1 L）：向900 mL去离子H2O中加入100 mL 10x磷酸盐缓冲液（PBS）和2 mL Triton X-100。
  2. 溶液2（1 L）：向900 mL去离子H2O中加入100 mL 10x PBS、2 mL Tween-20和1 mL 10 mg/mL肝素储备液。
  3. 溶液3（500 mL）：向400 mL溶液1中加入11.5 g甘氨酸和100 mL二甲基亚砜（DMSO）。
  4. 溶液4（50 mL）：向42 mL溶液1中加入3 mL相应血清和5 mL DMSO。
  5. 一抗溶液（50 mL）：向46 mL溶液2中加入2.5 mL DMSO和1.5 mL相应血清。
  6. 二抗溶液（50 mL）：向48.5 mL溶液2中加入1.5 mL相应血清。
    注意：对于溶液4、一抗溶液和二抗溶液，请使用与二抗来源相对应的血清（例如山羊、马、牛）。

2. 样品制备

注意：由于需限制接触多聚甲醛（PFA），步骤 2.1 至 2.7 应在通风橱内进行。

  1. 使用七氟烷深度麻醉幼年（3-6周龄）大鼠；当大鼠无反应，且对脚趾和尾部夹捏无反应时，进行步骤2.2。
  2. 将大鼠仰卧放置，使用虹膜剪在腹壁上做一切口。
  3. 使用梅奥剪从肋骨底部沿两侧向上剪至锁骨。
  4. 用止血钳将胸骨和肋骨固定，使其远离心脏和肺部。
  5. 用连接灌注泵的23 G针头穿刺左心室，并用虹膜剪剪开右心房。
  6. 经心脏灌注约75 mL的100 mM（1x）PBS缓冲液。
  7. 继续经心脏灌注约100 mL的用1x PBS缓冲的4%多聚甲醛（PFA）。
  8. 使用镊子将脑组织从颅骨中取出。
  9. 将脑组织置于矢状位，使用刀片和大鼠脑切片模具将其切成4个等宽切片（每片宽约3 mm）。
  10. 将每个脑片置于密封的5 mL塑料管中，加入用1x PBS配制的4% PFA，在4 °C摇床上固定过夜。
  11. 继续在室温（RT）摇床上用1x PBS配制的4% PFA固定1小时。
  12. 在室温下用1x PBS洗涤每个脑片，每次30分钟，共洗3次。

3. 脱水与脱色素

  1. 将样品在20%甲醇/80%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  2. 将样品在40%甲醇/60%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  3. 将样品在60%甲醇/40%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  4. 将样品在80%甲醇/20%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  5. 将样品在100%甲醇中室温孵育1小时。更换新的100%甲醇，再次室温孵育1小时。
  6. 将样品在100%甲醇中于4°C冷却约10分钟。
  7. 配制66%二氯甲烷（DCM）/33%甲醇溶液。
  8. 将样品在DCM/甲醇溶液中室温振荡孵育过夜。
  9. 在室温下用甲醇洗涤30分钟，重复2次。
  10. 将样品在100%甲醇中于4°C冷却约10分钟。
  11. 在4°C下，用预冷的新鲜配制的含5%过氧化氢的甲醇溶液漂白过夜。
  12. 将样品在80%甲醇/20%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  13. 将样品在60%甲醇/40%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  14. 将样品在40%甲醇/60%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  15. 将样品在20%甲醇/80%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  16. 将样品在1×PBS中室温孵育1小时。
  17. 在溶液1中室温洗涤1小时，重复2次。

4. 霍乱毒素B亚单位标记

  1. 将1 mL注射器的针尖插入伏隔核部位。
  2. 在20秒内缓慢注入2.5 μL的1%生物素化霍乱毒素亚单位B（biotin-CTB）。
  3. 保持针尖在原位1分钟，然后在10秒内缓慢拔出，以防止液体渗漏。

5. 抗体应用

  1. 将样品置于溶液3中，在37 °C水浴中孵育2天。
  2. 将样品置于溶液4中，在37 °C水浴中孵育2天。
  3. 加入一抗，在37 °C水浴中孵育7天。
  4. 用溶液2洗涤5次，每次孵育1小时；在室温下用溶液2保存过夜。
  5. 加入二抗，在37 °C水浴中孵育7天。
  6. 用溶液2洗涤5次，每次孵育1小时；在室温下用溶液2保存过夜。
    注意：从步骤5.6开始的所有步骤（包括最终保存）均应在低光照条件下进行。样品管可用铝箔包裹避光。本方案中抗体使用浓度分别为：TH为1:100，Iba1为1:200，二抗为1:100。在步骤5.1–5.6中添加足量的溶液2，确保试管完全充满。

6. 组织透明化

  1. 将样品在20%甲醇/80%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  2. 将样品在40%甲醇/60%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  3. 将样品在60%甲醇/40%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  4. 将样品在80%甲醇/20%去离子水溶液中室温孵育1小时。
  5. 将样品在100%甲醇中室温孵育1小时。
  6. 在新鲜的100%甲醇中室温孵育过夜。
  7. 在66%二氯甲烷/33%甲醇溶液中室温振荡孵育3小时。
  8. 在二苄基醚（DBE）中静置孵育（不振荡）。将样品置于DBE中直至组织透明，并继续储存在DBE中直至成像。

7. 封片

  1. 使用Visijet M3 Crystal树脂3D打印一个成像 chamber（模板可在idisco.info网站获取）。
  2. 使用环氧树脂将 chamber 固定在显微镜载玻片上。
  3. 将样本放置在 chamber 中央的方形空间内。
  4. 用DBE完全充满 chamber。
  5. 在 chamber 上方覆盖一片厚度为0.17 mm的盖玻片，并施加压力，直至盖玻片与 chamber 壁完全接触。
  6. 使用环氧树脂将盖玻片边缘与 chamber 密封。
  7. 旋转 chamber，使气泡从注液口逸出。
  8. 向 chamber 中补充DBE。
  9. 用环氧树脂密封注液口，并静置使其固化。
    注意：安装过程中多余的DBE会溢出。

8. 成像

  1. 使用共聚焦显微镜系统在 4 倍放大倍数下进行 z 轴扫描（参见附带的 3D 视频）。
  2. 使用激光器对样品进行荧光激发，激光器的发射波长应与二抗说明书指定的波长相近。本实验中，采用波长为 632 nm 的 HeNe 激光器实现 TH 的激发。
  3. 将检测器设置为接近激光发射波长的波长。在本实验方案中，TH 的检测器设置为 650 nm。
  4. 逐步提高检测器增益，直至出现可见信号。本实验中图像的 650LP 增益设置为 7.50 B。
  5. 在共聚焦成像软件中使用 扫描 功能，移动显微镜载物台，使样品进入焦点。
  6. 在所有平面上移动观察组织，使用共聚焦成像软件获取单张图像或 z 轴层扫图像。
  7. 成像完成后，将样品从成像腔室中取出，重新放入完全充满 DBE 的离心管中，并在室温下避光保存，建议用铝箔包裹。
    注意：只要荧光信号仍然较强，样品可重复安装并再次成像。

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结果

采用这种改良的疏水性组织透明化方案，成功实现了F344/N和HIV-1大鼠脑组织大范围区域的完全透明化。图1展示了黑质区域酪氨酸羟化酶（TH）的典型共聚焦图像。图1A显示密集的阳性染色，此类密集区域可通过在“Z”轴平面上逐层聚焦，以确认阳性染色信号及细胞形态的正确性。图1B显示稀疏的阳性染色，可通过TH神经元特有的形态特征进行识别。图1C显示未出现阳性染色但因背景信号而呈现深蓝至浅蓝色的组织区域。图像中完全黑色的区域表示该位置无组织存在，可能由于处于样本边缘、样本中存在孔洞，或组织处于失焦状态所致。

图2A显示了在20倍放大下酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的典型形态。染色和共聚焦成像聚焦正确时，理想情况下应在暗背景上呈现出明亮而清晰的荧光信号。TH阳性神经元具有较大的胞体（细胞本体）和多...

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讨论

组织透明化技术为传统免疫组化（IHC）方案的局限性提供了解决方案。透明的样本可最大限度地减少光的散射和吸收，从而实现对完整组织的细胞水平光学观察18,19。组织透明化技术通过使用溶剂进行脱脂、脱色和脱钙，使组织变得透明。当组织样本的折射率与所选成像介质的折射率相匹配时，样本将完全透明，从而可进行高质量成像3。本实验所采用的疏水性方案在初始脱水步骤中去除组织中的水分，从而减少光散射。在预处理过程中，组织被通透化以促进抗体深入渗透。经过该方案处理的组织易于操作，并可多次成像。若保存得当，组织在初次处理后仍可在长达一年的时间内提供清晰图像。

在本实验方案中，我们采用一种疏水性组织透明化技术，对F344/N和HIV-1 Tg大鼠脑组织样本进行TH、Iba1和CTB染色。透明化处理后，使用共聚焦显微镜对组织样本进行成像。本方案相较于其他疏水性方法（如iDISCO4）具有多项优势：第...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为：NS100624、DA013137、HD043680、MH106392。 &；由 T32 培训基金 5T32GM081740 资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
霍乱毒素B亚基（重组），Alexa Fluor 488InvitrogenC34775
DBESigma-Aldrich108014-1KG
DCMSigma-Aldrich270997-100mL
DMSOSigma-Aldrich472301-1L
甘氨酸Fisher ChemicalG46-500
山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 647InvitrogenA32733
山羊血清Sigma Life ScienceG9023-10mL
肝素Acros Organics41121-0010
Iba1 一抗FUJIFILM Wako019-19741
Kwik-sil 环氧树脂VWR70730-062
甲醇Sigma-Aldrich34860-1l-R
PBSFisher BioreagentsBP2944-100
灌注仪VWR70730-062微型泵可调流速
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich158127-3KG
TH 一抗Millipore SigmaAB152
吐温X-100Fisher BioreagentsBP151-500
吐温-20Fisher BioreagentsBP337-500

参考文献

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404(2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152(2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

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