本文介绍了一种疏水性组织透明化方法，可实现将目标分子作为完整脑结构的一部分进行观察。该技术现已在F344/N对照组和HIV-1转基因大鼠（两性）中得到验证。
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本文内容
摘要
摘要
疏水性组织透明化方法是一种易于调整、快速且低成本的流程，可用于在未改变的组织样本中研究目标分子。传统的免疫标记方法需要将样本切成薄片，这限制了对完整结构进行标记和观察的能力。然而，如果脑组织在处理过程中能够保持完整，则结构和神经环路也能保持完整，从而便于分析。以往建立的透明化方法需要较长时间才能完全透明组织，且所用的强化学试剂常常会损伤敏感的抗体。iDISCO方法能够快速而彻底地透明组织，适用于多种抗体，且无需特殊实验设备。该技术最初在小鼠组织中得到验证，而本方案将其改进并应用于对照组和转基因大鼠脑半球的成像。此外，本方案还对已有流程进行了多项优化，以获得背景染色更少、图像更清晰的结果。使用本疏水性组织透明化方法，在HIV-1转基因大鼠和F344/N对照大鼠中验证了Iba-1和酪氨酸羟化酶的抗体。脑是一个相互交织的网络，其结构通常协同工作而非独立运作。将脑作为一个整体系统而非多个独立部分的组合来进行分析，是这种全脑透明化方法的最大优势。
引言
多种组织透明化技术已验证可用于脑组织：基于水凝胶的技术、亲水性技术以及疏水性技术。这些技术旨在通过脱脂、脱色和脱钙过程，使用溶剂处理使组织变得透明。当组织样本的折射率与所选成像介质的折射率相匹配时，即可获得清晰的样本图像。基于水凝胶的技术（如CLARITY）通过将生物分子与丙烯酰胺基水凝胶交联，从而在组织中固定这些分子，防止结构损伤和蛋白质丢失1。然而，水凝胶技术使用的化学试剂较为剧烈，可能对更脆弱的组织造成损伤，且致密的组织样本可能不适用于水凝胶方案。某些水凝胶技术可能需要昂贵的设备，或导致组织膨胀。亲水性技术（如CUBIC）通过在组织内部形成氢键来维持三维结构2。在某些亲水性方案中也可能发生组织膨胀。亲水性技术的透明化能力通常不及疏水性技术，而后者对于更致密和更厚的组织尤为重要3。
疏水性技术通常速度快，不需要特殊设备，且产生的样品易于操作和保存。iDISCO 是一种疏水性技术，可消除其他疏水性方案中可能出现的组织收缩。最初，iDISCO 组织透明化技术由 Renier 等人4报道，用于小鼠胚胎及致密的成年器官。该技术在初始脱水步骤中去除组织中的水分，从而减少光散射。在预处理过程中，组织被通透化，以允许抗体深入渗透。免疫标记使用远红光谱的 Alexa Fluor 染料，以避免组织在较....
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方案
所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准。
1. 储备液的配制
- 溶液1（1 L）：向900 mL去离子H2O中加入100 mL 10x磷酸盐缓冲液（PBS）和2 mL Triton X-100。
- 溶液2（1 L）：向900 mL去离子H2O中加入100 mL 10x PBS、2 mL Tween-20和1 mL 10 mg/mL肝素储备液。
- 溶液3（500 mL）：向400 mL溶液1中加入11.5 g甘氨酸和100 mL二甲基亚砜（DMSO）。
- 溶液4（50 mL）：向42 mL溶液1中加入3 mL相应血清和5 mL DMSO。
- 一抗溶液（50 mL）：向46 mL溶液2中加入2.5 mL DMSO和1.5 mL相应血清。
- 二抗溶液（50 mL）：向48.5 mL溶液2中加入1.5 mL相应血清。
注意：对于溶液4、一抗溶液和二抗溶液，请使用与二抗来源相对应的血清（例如山羊、马、牛）。
2. 样品制备
注意：由于需限制接触多聚甲醛（PFA），步骤 2.1 至 2.7 应在通风橱内进行。
- 使用七氟烷深度麻醉幼年（3-6周龄）大....
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结果
采用这种改良的疏水性组织透明化方案，成功实现了F344/N和HIV-1大鼠脑组织大范围样本的完全透明化。图1展示了黑质区域酪氨酸羟化酶（TH）的典型共聚焦图像。图1A显示密集的阳性染色，此类密集区域可通过在“Z”轴平面上逐层聚焦，以确认阳性染色信号及细胞形态的正确性。图1B显示稀疏的阳性染色，可通过TH神经元特有的形态特征进行识别。图1C显示未出现阳性染色的组织区域，但由于背景信号的存在，仍呈现深蓝至浅蓝色。图像中完全黑色的区域表示该位置无组织存在，可能由于处于样本边缘、样本中存在孔洞，或组织处于失焦状态所致。
图2A显示了在20倍放大下TH阳性神经元的典型形态。经过适当染色并正确聚焦的共聚焦图像理想情况下应在暗背景上呈现出明亮而清晰的荧光信号。TH阳性神经元具有较大的胞体（细胞本体）以.......
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讨论
组织透明化技术为传统免疫组化（IHC）方案的局限性提供了解决方案。透明的样本可最大限度地减少光的散射和吸收，从而实现对完整组织的细胞水平光学观察18,19。组织透明化技术通过使用溶剂进行脱脂、脱色和脱钙，使组织变得透明。当组织样本的折射率与所选成像介质的折射率相匹配时，样本将完全透明，从而可进行高质量成像3。本实验所采用的疏水性方案在初始脱水步骤中去除组织中的水分，从而减少光散射。在预处理过程中，组织被通透化以促进抗体深入渗透。经过该方案处理的组织易于操作，并可多次成像。若保存得当，组织在初次处理后仍可在长达一年的时间内提供清晰图像。
在本实验方案中，我们采用一种疏水性组织透明化技术，对F344/N和HIV-1 Tg大鼠脑组织样本进行TH、Iba1和CTB染色。透明化处理后，使用共聚焦显微镜对组织样本进行成像。本方案相较于其他疏水性方法（如iDISCO4）具有多项优势：第.......
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披露
所有作者均无利益冲突需要声明。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为：NS100624、DA013137、HD043680、MH106392。 &；由 T32 培训基金 5T32GM081740 资助
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 霍乱毒素B亚基（重组），Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| 甘氨酸 | Fisher Chemical | G46-500 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| 山羊血清 | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| 肝素 | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 一抗 | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil 环氧树脂 | VWR | 70730-062 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| 灌注仪 | VWR | 70730-062 | 微型泵可调流速 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH 一抗 | Millipore Sigma | AB152 | |
| 吐温X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| 吐温-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
参考文献
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.
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重印与许可
