方法文章

一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

DOI：

10.3791/61824

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2020年12月10日

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1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从转化医学的角度来看，使用可吸收生物材料在体内直接诱导再生是一种极具吸引力的策略。这类材料在植入后会引发炎症反应，而该炎症反应正是材料后续被吸收以及新组织再生的驱动因素。这一策略也被称为原位组织工程，目前正被用于开发心血管替代物，例如组织工程血管移植物。炎症反应和再生过程均受到支架局部生物力学信号（即拉伸和剪切应力）的调控。本文详细描述了一种自主开发的生物反应器的使用方法，该反应器能够独特地将管状支架上的拉伸应力与剪切应力解耦。这使得在精确控制的力学载荷条件下，对管状支架的炎症反应能力和再生能力进行系统化、标准化的评估成为可能。我们通过人源巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养实验，展示了该方法的应用。本文详细讨论了该方法中的关键操作步骤，包括生物反应器的构建与设置、支架的制备与细胞接种、拉伸与剪切流的施加及维持，以及用于分析的样本采集。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管组织工程（TE）正被探索作为当前使用的心血管永久性假体（例如，血管移植物、心脏瓣膜置换物）的一种替代治疗方案，而现有假体对大量患者群体而言效果并不理想1,2,3,4。备受关注的应用包括组织工程血管移植物（TEVGs）5,6和组织工程心脏瓣膜（TEHVs）7,8。通常，心血管组织工程技术采用可吸收生物材料（天然或合成材料），作为引导新组织形成的支架。新组织的形成可通过两种方式实现：一种是完全在体外进行，即将细胞接种于支架上，并在植入前于生物反应器中培养（体外TE）9,10,11；另一种是在体内原位直接实现，即将合成支架未经预培养直接植入体内，以诱导新组织在体内原位形成（原位TE）12,13,14。无论是体外还是原位心血管组织工程技术，功能性的成功再生主要依赖于宿主对植入物的免疫反应以及适当的生物力学负荷。

生物力学负荷对心血管组织工程的重要性已得到广泛认可15。对于心血管植入物而言，定植于支架上的细胞会受到血流动力学环境所引起的周期性拉伸和剪切应力的作用。已有大量研究报道了（周期性）拉伸对多种细胞类型合成基质成分（如胶原蛋白16,17,18,19、糖胺聚糖（GAGs）20和弹性蛋白21,22）的促进作用。例如，Huang 等人利用血管生物反应器证明，双轴拉伸可促进体外组织工程血管中胶原蛋白和弹性蛋白的沉积与有序排列23。尽管通常强调拉伸作为主要负荷的作用，但这些研究常使用由流动驱动的生物反应器，使样品同时暴露于剪切流中。尽管目前关于剪切应力在三维环境中对组织形成和炎症反应的独立影响尚不明确，但仍有一些相关数据。例如，Hinderer 等人和 Eoh 等人证明，在体外模型系统中，除三维支架微结构外，剪切流对人血管平滑肌细胞形成成熟弹性蛋白也具有重要作用24,25。综上所述，这些研究结果表明，周期性拉伸和剪切应力在心血管组织工程中均具有重要意义。

影响组织工程植入物成功与否的另一个重要因素是宿主对植入移植物的免疫反应26。这一点对于材料驱动的原位组织工程技术尤为重要，因为此类技术实际上依赖于支架引发的急性炎症反应，以启动后续的细胞浸润以及内源性组织形成与重塑过程27。巨噬细胞是功能性组织再生的关键启动者，这一点已得到多项研究的证实28,29,30。类似于伤口愈合过程，组织再生由巨噬细胞与成纤维细胞、肌成纤维细胞等组织生成细胞之间的旁分泌信号通路所调控31,32,33。除了协调新组织的沉积外，巨噬细胞还参与对外源性支架材料的主动吸收34,35。因此，体外巨噬细胞对生物材料的反应已被确定为预测植入物体内成功与否的一个关键参数36,37,38。

巨噬细胞对植入支架的反应取决于支架的设计特征，例如材料组成和微观结构35,39,40。除了支架本身的特性外，巨噬细胞对支架的反应及其与肌成纤维细胞之间的相互作用也受到血流动力学负荷的影响。例如，已有研究表明，在三维电纺支架中，周期性拉伸是调节巨噬细胞表型41,42,43,44以及细胞因子分泌43,44,45,46的重要调节因素。Battiston 等人利用巨噬细胞与血管平滑肌细胞的共培养系统，证明了巨噬细胞的存在可提高弹性蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的水平，而中等程度的周期性拉伸（1.07–1.10）可促进I型胶原和弹性蛋白的沉积47。在先前的研究中，我们 已证明剪切应力是单核细胞募集进入三维电纺支架的重要决定因素48,49，且剪切应力与周期性拉伸均会影响人单核细胞与间充质基质细胞之间的旁分泌信号交流50。Fahy 等人证明，剪切流可增加人单核细胞分泌促炎性细胞因子51。

综上所述，上述证据表明，充分理解并控制血流动力学负荷对心血管组织工程至关重要，同时必须考虑炎症反应以实现这一目标。此前已有大量文献报道了用于心血管组织的体外52,53,54,55,56,57,58或离体59,60,61培养的多种生物反应器。然而，这些系统均旨在尽可能模拟生理状态下的血流动力学负荷条件。尽管这对于在体外构建心血管组织或维持离体培养具有重要价值，但此类系统无法对各个独立信号的单独效应进行系统性研究。其原因在于，这些生物反应器中循环拉伸和剪切应力的应用均由同一加压流体驱动，二者本质上相互关联。虽然已有研究报道了可用于2D基底62或3D水凝胶系统63,64的、能够实现精确多信号力学调控的微系统，但这类系统尚不能整合弹性3D生物材料支架。

在此，我们介绍一种管状生物反应器系统的应用，该系统能够独特地实现剪切应力与周期性拉伸的解耦，从而有助于从机制上研究二者各自及联合作用的影响。该系统可用于测试多种组织工程血管移植物（例如，合成或天然来源、不同微观结构、不同孔隙率）。为有效解耦剪切应力与拉伸的施加，该生物反应器所采用的关键设计概念包括：（1）利用独立的泵系统分别控制剪切应力与拉伸；（2）以计算驱动的尺寸参数，采用“由外向内”方式对支架进行刺激。通过流量泵在管状支架的外表面施加流体，而支架的周向拉伸则通过另一个独立的应变泵扩张其固定所用的硅胶管来实现。硅胶管及容纳构建物的玻璃管的尺寸经过精心选择，并通过计算流体动力学模拟进行验证，以确保作用于支架的剪切应力（由流动引起）与周向拉伸（由管体扩张引起）之间不产生显著相互干扰。这种由外向内的设计具有多项实际合理性。若拉伸由管腔内流体压力施加（类似于生理载荷），则 本质上要求样品设计必须无泄漏。此外，拉伸样品所需的压力将完全由样品的刚度决定，而样品间以及同一样品随时间变化的刚度可能存在差异，从而导致拉伸控制困难。该生物反应器将组织工程移植物固定在硅胶管周围，可在移植物外壁施加壁面剪切应力（WSS），并从内部对移植物加压。通过这种方式，可确保样品间及同一样品在时间上的载荷条件一致，同时允许样品存在渗漏，这在多孔血管支架中是常见现象。19这种内翻式生物反应器专门用于系统研究剪切力和/或拉伸力的影响，而非用于体外构建类似天然的血管，后者更适合采用传统的血管生物反应器装置。参见 图1A–B 生物反应器设计图纸及其相应部分 表1 有关生物反应器主要组件的功能描述及其设计原理。

生物反应器的应用基于以下基础 我们课题组近期一系列研究探讨了剪切应力与周期性拉伸对可吸收静电纺支架在原位心血管组织工程中炎症反应及组织形成各自及联合作用19,43,44为此，我们采用人巨噬细胞和肌成纤维细胞，单独培养或共培养，以模拟体内再生级联反应的各个阶段。我们已经 证明了人巨噬细胞的细胞因子分泌受到周期性拉伸和剪切应力的显著影响，进而通过旁分泌信号和直接接触，影响人肌成纤维细胞在这些支架中的基质沉积与排列19,43,44值得注意的是，这些研究发现，在剪切应力与拉伸应变共同作用的情况下，对组织形成和炎症反应的影响要么主要由其中一种载荷主导，要么表现为两种载荷的协同效应。这些结果表明，有必要将这两种载荷解耦，以更深入地理解力学环境对组织工程过程的各自贡献。这种理解可用于在相关血流动力学载荷条件下系统优化支架设计参数。此外，来自此类精确控制环境的力学机制数据可作为数值模型的输入，用于预测原位组织重塑的过程，这在近期关于组织工程血管移植物（TEVGs）的研究中已有报道。65 或TEHVs66，以进一步提高预测能力。

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方案

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在本方案所述的研究中，使用了从外周血血沉棕黄层分离的原代人巨噬细胞，以及从冠状动脉旁路移植术后大隐静脉分离的人肌成纤维细胞44。血沉棕黄层来自健康的匿名志愿者，这些志愿者已签署经Sanquin Research机构医学伦理委员会批准的书面知情同意书。人源大隐静脉细胞（HVSCs）的使用遵循荷兰医学学会联合会（FMWV）制定的《人体组织合理二次使用规范》。

1. 生物反应器设置前的常规准备和必要操作

注意：有关相应的分离和培养方案的详细信息，请参见先前的研究19,43,44。本方案中的所有计算均以单核细胞与肌成纤维细胞共培养实验为例，实验设置为8个承受血流动力学负荷的支架和2个静态对照组（n=10）。

  1. 开始细胞分离与细胞培养。共培养样品中单核细胞与肌成纤维细胞的接种密度（接种比例为2:1）分别为30 × 106 个单核细胞/cm3 和15 × 106 个肌成纤维细胞/cm3。
    注：电纺材料具有高孔隙率（>90%）。为估算每段移植物所需的细胞数量，使用空心圆柱体体积公式计算支架体积：π*(厚度)2*长度 ≈ 0.04 cm3。每段移植物所需的总细胞数为1.2 × 106 个单核细胞和0.6 × 106 个肌成纤维细胞。对于10个样品，至少需要12 × 106 个单核细胞和6 × 106 个肌成纤维细胞；建议起始细胞数量增加约10–15%，以补偿可能的移液误差。
  2. 对将用于生物反应器实验的细胞培养基进行脱气处理。
    1. 配制共培养用培养基，成分为RPMI-1640与aDMEM（1:1），添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.5% L-谷氨酰胺。
    2. 将培养基置于带滤膜盖的细胞培养瓶中，于培养箱内过夜（O/N）以完成脱气。
    3. 将滤膜盖更换为密封盖，并在4 °C下保存。
    4. 使用前立即向培养基中加入0.25 mg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸盐（维生素C）。
      注：根据计算，每个灌流培养室所需培养基为50 mL。每周更换培养基三次，每次用25 mL新鲜培养基替换25 mL旧培养基。对于10个样品，在接种后共需500 mL新鲜培养基；每次后续换液需使用250 mL新鲜培养基。培养基应现配现用，尤其是维生素C应在换液前立即加入。
  3. 按照Van Haaften等19所述方法制备各向同性电纺支架（管腔直径3 mm，壁厚200 µm）（图1G–I）。简言之，通过电纺从15%（w/w）氯仿-聚合物溶液中制备管状聚己内酯双脲（PCL-BU）支架。电纺过程在室温及30%相对湿度条件下进行，聚合物溶液流速为40 µL/min，喷丝头与旋转圆柱形接收器之间的距离为16 cm（接收器直径3 mm，转速500 rpm），喷丝头施加电压为16 kV，接收器为-1 kV。
    注：尽管本实验使用PCL-BU移植物，但多种不同来源（如合成或天然材料）、不同微观结构及不同孔隙率的弹性组织工程移植物均可安装于该生物反应器中。
    1. 从芯轴上取下电纺支架。
      1. 在15 mL离心管盖上打一个小孔，用于将芯轴固定在管中心，防止其接触管壁。
      2. 将带有电纺支架的芯轴放入离心管中，并加入去离子水至充满。
      3. 于-20 °C冷冻过夜（O/N）。
      4. 将离心管置于室温（RT），数分钟后将芯轴拔出，使电纺移植物留在冰中。
      5. 待冰完全融化后，从融化的水中取出电纺管，并垂直悬挂干燥数小时。确保支架不会因自重而塌陷。
    2. 在真空条件下干燥支架过夜（O/N）。
    3. 使用扫描电子显微镜（SEM）对少量电纺移植物样品成像，以评估其微观结构（如纤维形态、纤维直径）。示例研究中的移植物具有各向同性纤维取向，纤维直径为5 µm（图1H–I）。
  4. 实验开始前一天，将装有去离子水的液压储液罐放入培养箱。用白色鲁尔帽封闭全部八个灌流培养室连接口。连接压缩空气系统并插入压力传感器。运行应变泵（见步骤5.6）过夜（O/N），以允许特氟龙波纹管发生轻微膨胀。
    注：确保所有必要材料和设备均已按照制造商说明或步骤7.3–7.6所述方法进行清洁和/或高压灭菌（参见材料表中的“备注/描述”列，了解哪些材料可高压灭菌）。
  5. 确保后续操作均在无菌条件下进行。
    1. 在无菌超净工作台内执行步骤2–5.3（系统设置）、步骤6.3（更换培养基）以及步骤7.1–7.2（血管构建体收获）。
    2. 将后续步骤中暂不需要的材料置于密闭的培养皿中，以尽可能保持清洁。
    3. 定期用浸有70%乙醇的纸巾清洁或擦拭生物反应器组件及超净工作台表面。

2. 生物反应器的设置

注意：步骤 2 需在层流柜中进行。

  1. 将静电纺丝支架切割成约 25 mm 长的管状，并在使用前进行记录（例如，拍摄长度照片，用天平称量初始质量）。
  2. 对静电纺丝支架进行去污处理。
    1. 将静电纺丝支架倾斜放置于孔板或培养皿中，使一端开口朝向紫外（UV）光源，以便波长为 253.7 nm 的紫外光能够照射到支架内部。
    2. 将静电纺丝支架暴露于紫外光下 5 分钟。
    3. 翻转所有支架，对另一端开口重复紫外照射。
      注意：此步骤之后，仅在必要时才触碰静电纺丝支架。始终使用洁净的镊子或洁净的手套。
    4. 取出保存在 70% 乙醇中的流动培养室玻璃管，用超纯水清洗玻璃管，干燥后放入一个大而密闭的培养皿中。
      注意：以下步骤，尤其是步骤 2.3–2.5，建议由两名实验人员协作完成。
  3. 将静电纺丝支架安装到硅胶管上。
    1. 将 5-0 Prolene 缝合线穿过硅胶管一端，从管壁一侧穿入，另一侧穿出，形成两条方向相对、横跨管横截面的张紧缝合线。在管子两侧打小结，打结时压紧管壁，并在每个结上保留约 10 cm 的线头。将两个 10 cm 的剩余线头末端打第三个结。
      1. 剪除缝合针及所有可能突出并损伤静电纺丝支架内壁的松散线头。将硅胶管边缘修剪成三角形，以利于将其穿过静电纺丝支架。
    2. 将静电纺丝支架浸入 30% 乙醇中（此步骤作为额外的去污步骤，并有助于将支架顺利滑过硅胶管），然后将支架套在 10 cm 的自由线头上。实验员 A 轻轻拉伸硅胶管及其两端的 10 cm 缝合线结以拉长管体，同时实验员 B 使用内尖光滑的镊子轻轻将静电纺丝支架沿硅胶管滑动，避免损伤支架。
    3. 缓慢释放硅胶管的拉伸力，同时用镊子抚平静电纺丝支架。将带有支架的硅胶管浸入超纯水中两次。
      注意：静电纺丝支架可能出现轻微褶皱。这些褶皱将在步骤 2.5.3 固定支架至压力导管前施加预拉伸时消失。
    4. 对其他静电纺丝支架重复步骤 2.3.2 和 2.3.3。根据硅胶管长度，可在同一根硅胶管上安装多个静电纺丝支架。
    5. 当所有静电纺丝支架均安装到硅胶管上后，围绕支架处切割硅胶管，使其长度一致（5.5 cm）；一端靠近静电纺丝支架末端，另一端保留约 2–3 cm 的自由硅胶管。
  4. 构建流动培养室的底部组件（图 1A–B）。
    1. 取底部组件的上部（含流出口），用雄性鲁尔塞封闭流出口。
    2. 将带孔的压力导管穿过底部组件，在压力导管下端套上硅胶 O 形圈以防止泄漏。将底部组件的下部拧紧至其上部，以固定压力导管。确保压力导管下部的刻槽位于底部组件适配衬套边缘上方约 3–5 mm 处；该位置将用于“固定”缝合线的紧结，从而将带支架的硅胶管牢固固定在压力导管上。
      注意：若压力导管可轻易上下移动，表明底部组件未固定牢固。请重复步骤 2.4.2 以防止后续阶段发生泄漏（图 2D）。
  5. 将带静电纺丝支架的硅胶管固定至压力导管。
    1. 将带支架的硅胶管套在压力导管上。
    2. 在静电纺丝支架下端、压力导管刻槽位置处，用缝合线打结。在对侧再打一个结，以牢固固定带支架的硅胶管。
      警告：此步骤至关重要。必须确保结准确“落入”压力导管的刻槽内，以防止液压储液器中的水泄漏至流动培养室。若不确定，可在预期刻槽位置上下方多次尝试收紧缝合线，确保最终结的位置恰好位于刻槽处（图 2A）。
    3. 在硅胶管上端安装剪式夹具，并向上拉伸硅胶管（此操作可直接测试第一个结的牢固性；若硅胶管可沿压力导管滑动，则表明结未充分收紧）。在拉力作用下，硅胶管被预拉伸。为确保不同样品间硅胶管拉伸状态一致，将标尺固定于剪式夹具上。向上拉动夹具，直至标尺下端与支架下端齐平。
      注意：保持各样品预拉伸程度大致相同（约 5%）至关重要，原因如下：（1）预拉伸硅胶管在加压时可实现沿样品长度方向更均匀的扩张；（2）预拉伸会影响硅胶的力学性能，因此所有样品应保持一致，以确保各组间拉伸条件相同。
    4. 用镊子轻轻拉伸静电纺丝支架以消除褶皱。再次在支架上端、压力导管上部刻槽位置两侧，用缝合线打两个结。
    5. 松开剪式夹具，用刀具切除多余的硅胶管，保留 20–30% 的螺纹被硅胶管覆盖，以防止安装锥形头时发生泄漏。
      注意：对所有动态样品重复步骤 2.4 和 2.5。
    6. 对于静态对照样品，将安装在硅胶管上的静电纺丝支架固定在无孔压力导管上。这些导管可单独存放于 15 mL 管中，直至接种细胞（步骤 4），无需安装至流动培养室组件中。
  6. 将部分组装的、带有静电纺丝支架的流动培养室暴露于紫外光下 10 分钟进行去污。翻转流动培养室，使支架朝向另一侧，再次进行 10 分钟紫外照射。
  7. 将锥形头拧紧至动态样品带孔压力导管的螺纹上。
    1. 确保硅胶管上端完全嵌入锥形头内，以防止后续阶段泄漏。若硅胶管过长，用刀具切除多余部分。
    2. 将部分组装的流动培养室放入大培养皿中，使锥形头朝向紫外光源，进行 5 分钟紫外照射。
  8. 使用玻璃管及流动培养室的上部组件完成流动培养室的组装（图 1A–B）。
    1. 通过将带硅胶管和静电纺丝支架的压力导管浸入 30% 乙醇，随后两次浸入超纯水中，对支架进行预润湿。
    2. 将玻璃管套在压力导管上，轻轻推入底部组件并稳妥固定。
    3. 取含流入口的上部组件，按正确顺序放置硅胶 O 形圈、流道整流器和适配衬套（图 1A–B），套在玻璃管开口端并轻轻固定。
    4. 在上部组件的流入口处拧紧白色鲁尔帽。
    5. 从底部组件的流出口取下雄性鲁尔塞，用浸有乙醇的纸巾清洁其周围表面。
    6. 将装有 10 mL 超纯水的注射器插入流出口，打开上部组件的白色鲁尔帽，向腔室内注满超纯水。再次关闭白色鲁尔帽，取下注射器，用乙醇清洁，最后用雄性鲁尔塞封闭流出口。
      注意：对所有流动培养室重复步骤 2.6–2.8。
    7. 对于静态对照组，向装有固定在无孔压力导管上样品的 15 mL 管中加入 10 mL 超纯水。
  9. 将所有流动培养室放入培养箱中。在细胞接种前一天，按照步骤 2.8.5 和 2.8.6 所述方法，用培养基替换超纯水（务必使用直接放置在流出口处的浸乙醇纸巾收集“旧”超纯水）。

[此处可暂停实验方案]

3. 流泵装置的准备工作

注意：步骤 3 需在层流柜中进行。

  1. 收集所有泵的组装材料并准备使用。
    注意：实验人员可参考制造商的操作说明，了解如何设置泵、流体单元以及通过流体单元阀门的培养基管路的详细步骤。
    1. 将泵的压力设置为 200 mbar 容量。
    2. 将 60 mL 储液瓶的固定架拧紧至流体单元上。
    3. 用浸有乙醇的纸巾清洁可重复使用的橡胶空气过滤器，确保空气过滤器保持干燥。
  2. 将 60 mL 储液瓶放入储液瓶固定架中，并将标准培养基管路穿过流体单元的阀门。使用内径较大的培养基管路，通过雌性鲁尔锁接头连接成一个封闭回路。
  3. 在储液瓶正下方位置，用软管夹夹紧培养基管路。
  4. 每个 60 mL 储液瓶中加入 25 mL 培养基。松开软管夹，使培养基流入管路中。
  5. 用橡胶空气过滤器封闭培养基储液瓶，并将流泵装置放入培养箱中，直至步骤 4。

4. 使用纤维蛋白作为细胞载体进行细胞接种

注意：第 4 步需在层流柜中进行。

  1. 准备用于细胞接种步骤的纤维蛋白凝胶。具体细节请参见 Mol 等人67。纤维蛋白凝胶中，纤维蛋白原溶液的终浓度应为 10 mg/mL（根据蛋白储备液的纯度进行校正），凝血酶溶液的终浓度应为 10 U/mL。
    1. 将纤维蛋白原解冻至室温，然后在带红色盖子的塑料容器中称取约 50 mg（足够用于 10 个样品）。
    2. 加入细胞培养基配制纤维蛋白原溶液（浓度为 10 mg/mL，根据蛋白储备液的纯度进行校正）。充分混匀后，使用 0.2 µm 注射器滤器过滤，将纤维蛋白原溶液无菌过滤至无菌的 15 mL 管中。将过滤后的纤维蛋白原溶液置于冰上保存。
      注意：避免过早配制纤维蛋白原溶液，否则纤维蛋白原可能发生自发凝集。
    3. 解冻凝血酶，并用细胞培养基配制凝血酶溶液（浓度为 10 U/mL），置于冰上。每份样品准备 20 µL 凝血酶+细胞混合液。对于 n=10 个样品，共需 200 µL；因此，为避免移液误差，建议配制 250 µL 凝血酶溶液。
  2. 从培养瓶中收集细胞并计数。按所需比例和数量混合细胞（每支架含 1.2 × 106 个单核细胞和 0.6 × 106 个肌成纤维细胞）。确保细胞数量足够用于 n+1 个样品，以校正移液误差。在室温下以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  3. 制备细胞悬液与凝血酶的混合液。
    1. 每个样品使用 20 µL 凝血酶溶液。对于 n=10 个样品，将 200 µL 凝血酶加入细胞沉淀中并混匀。测量细胞悬液（细胞+凝血酶）的体积，并计算如何平均分配至全部 10 个支架（例如，若凝血酶+细胞悬液总体积为 260 µL，则每个静电纺丝支架将分配到 260 µL / 10 个样品 = 26 µL 凝血酶+细胞悬液）。
    2. 由于支架接种分两步进行，准备两个 1.5 mL 微量离心管，每管盛放每个支架所需细胞悬液的一半（以上一步示例计算为例：准备两个分别含有 13 µL 凝血酶+细胞悬液的管子）。置于冰上。
      注意：以下步骤，尤其是步骤 4.4，最好由两名实验人员共同完成。
  4. 使用真空干燥预湿的静电纺丝支架，为细胞接种做准备。
    1. 将玻璃巴斯德吸管连接至超净台的真空系统，并将其放入空的 50 mL 管中，用于无菌临时存放。
    2. 从培养箱中取出灌注培养室，移除流出口的雄性鲁尔塞，打开白色鲁尔帽，并在流出口前方放置一块经乙醇浸泡的纸巾，然后移除培养基。
    3. 取下上部腔室和玻璃管，放入无菌培养皿中临时存放。
    4. 将真空巴斯德吸管置于静电纺丝支架上，尽可能吸除培养基。
      注意：对静电纺丝支架进行真空干燥时务必轻柔操作。不要在支架表面来回直线移动，而应在多个位置分别放置真空吸管。建议用手指夹住巴斯德吸管上方的真空管，以获得更好的控制。
    5. 将纤维蛋白原溶液与凝血酶+细胞悬液按 1:1 比例混合（例如，将 13 µL 纤维蛋白原与 13 µL 凝血酶+细胞悬液混合）。为确保纤维蛋白在支架内聚合而非在微量离心管中聚合，应先吸取纤维蛋白原，再将移液器旋钮调至凝血酶+细胞悬液的“额外体积”档位，然后在含有细胞悬液的微量离心管中上下吹打一次以混匀。
    6. 将混合液均匀地滴加至静电纺丝支架的整个长度上。建议由实验人员 A 滴加纤维蛋白混合液，实验人员 B 手持安装在压力导管上的下部腔室。
    7. 在将含细胞的纤维蛋白液滴加至静电纺丝支架后，实验人员 B 缓慢地左右和上下移动支架，使细胞在支架上进一步均匀分布。
    8. 在静电纺丝支架的另一侧重复步骤 4.4.5–4.4.7。
    9. 重新安装灌注培养室：小心放置玻璃管（防止纤维蛋白粘附并凝结在玻璃管内壁），然后推回灌注培养室的上部腔室。立即将接种后的构建物（不加任何培养基或磷酸盐缓冲液（PBS））放入培养箱中的灌注培养室内。
    10. 对所有动态样品重复步骤 4.4.1–4.4.9。对于安装在无孔压力导管上的静态样品，按步骤 4.4.1–4.4.8 进行接种，之后将其放入 15 mL 管中。
    11. 在培养箱中静置 60 分钟，使纤维蛋白完成聚合。

[此处可暂停实验方案 30–60 分钟。]

  1. 聚合完成后，向流体培养室（动态样本）或15 mL离心管（静态样本）中加入培养基。

5. 实验开始前将生物反应器与蠕动泵系统连接

注意：步骤 5.1–5.3 需在层流柜中进行。

  1. 将装有灌注培养室和已填充培养基并连接好培养基管路的流体单元的托盘移至超净工作台内。
  2. 将灌注培养室放置于生物反应器底座上，用于施加周期性拉伸以及联合血流动力学负荷的实验组（图1E）。
    1. 将灌注培养室倒置，使用带有细管的注射器从下方往压力导管中注入超纯水（细管类型不限，只要柔韧且细即可；本实验中，针头连接了一根长10 cm、内径0.15 mm的细丝）。
    2. 将细管插入压力导管中，在通过缓慢推动注射器使压力导管充满超纯水的同时，同步将细丝从压力导管中抽出，以确保压力导管内无气泡残留。
    3. 将灌注培养室安装在生物反应器底座的八个螺纹接口之一上。在生物反应器底座与白色鲁尔接头之间放置一个硅胶O型圈，以防可能的泄漏，并从底部腔室拧紧白色鲁尔接头。
    4. 对所有施加周期性拉伸的样品重复步骤5.2.2和5.2.3。
  3. 将除静态对照组外的所有实验组的灌注培养室连接至流体泵系统。
    1. 在培养基管路上安装一个软管夹。取下覆盖灌注培养室上腔流体入口的白色鲁尔帽。断开培养基管路的雌性鲁尔接头，将管路一端连接至培养室上腔的流体入口，另一端连接至下腔的流体出口。
    2. 对所有灌注培养室重复步骤5.3.1。此时，生物反应器和灌注培养室均已充满培养基，并与流体系统连接。
    3. 对于静态对照组样品，使用剪刀形夹具将样品垂直固定于带滤膜盖的细胞培养瓶中。向培养瓶中加入培养基后置于培养箱中。
  4. 将整套装置从超净工作台转移至培养箱，并将流体单元连接至气压管路和电源线。
  5. 启动软件，初始化流体泵，逐个启动样品的培养基流动。
    1. 检查流体单元的阀门是否发出咔嗒声。
    2. 取下培养基管路上的软管夹。
    3. 以100 mbar压力和10 s切换时间启动流体泵。
    4. 仔细检查流动方向，观察是否存在泄漏或气泡。任何滞留的气泡可通过将灌注培养室倒置的方式去除。
      注：确保培养基储液罐中的液面保持平衡，以防止空气被吸入系统或在灌注培养室中形成气泡，同时避免储液罐干涸（图2C）。
    5. 逐一对所有流体单元重复步骤5.5。
  6. 初始化应变泵。
    1. 通过气动气缸上的进气口将气动驱动泵连接至压缩空气源。将下方的出气口通过蓝色管路连接至排气端（图1F）。
    2. 打开LabVIEW软件，运行LabVIEW脚本及压缩空气压力控制系统（方法参照Van Kelle等人的描述68），输入位移和频率参数（初始频率可设为较低的0.2 Hz）。当特氟龙波纹管处于最低位置时暂停泵运行。
    3. 将压力传感器插入液压储液罐的压力传感器接口中。
  7. 将泵的参数调整至所需设置（例如，1.5 Pa时使用150 mbar压力和10 s切换时间）。
  8. 启动应变泵，并应用所需的参数设置（例如，0.5 Hz频率，1.05倍拉伸）。

6. 多天实验运行；培养过程中剪切力和拉伸力的监测及培养基更换

  1. 计算支架壁面上的壁面剪切应力（WSS）。
    1. 每隔一天记录一次流速大小（具体操作详见流泵制造商的手册）。简而言之，在切换流体单元储液罐时，观察10秒内培养基储液罐中液面变化（以mL计）。至少进行五次测量，计算平均值，并乘以6，得到以mL/min为单位的流速 Q。
    2. 流动可由环形通道中的泊肃叶流（Poiseuille flow）描述。假设培养基为牛顿流体，根据公式1计算支架壁面 r1 处的壁面剪切应力（WSS）。
      流体剪切应力τ_w的公式，涉及压力梯度、半径项和数学符号。 （1）
      其中，支架壁面（r1；此处 r1 = 1.7 mm）处的壁面剪切应力 τw 由施加的压力 p 和玻璃管内半径 r2（此处 r2 = 2.3 mm）决定，该值对应于稳态流动条件下的结果。轴向压力梯度在流体入口与出口之间被视为均匀分布，其表达式见公式2（图1J）。
      柱坐标系下流体动力学中的压力梯度方程。 （2）
      其中 µ 为动力黏度（此处假设培养基黏度恒定，µ = 0.7 × 10-3 Pa∙s，37 °C），Q 为施加的流速。
  2. 每隔一天监测一次施加于支架上的拉伸程度。
    1. 在流动培养室后方放置深色背景，以增强支架与背景之间的对比度。将LED灯朝向支架方向照射，以帮助清晰观察支架。
    2. 使用高速相机以30 Hz的频率对支架进行6秒的时间序列摄影（即3个拉伸周期）。
      注：若相机允许，较低的录制频率亦可接受。但最低所需频率尚未确定。
    3. 从图像中手动确定支架的最小和最大直径。
    4. 根据电纺支架的最小和最大外径，利用公式3计算最大拉伸率。
      用于光谱分析的光学路径长度方程 λθ=d1/d0 示意图。 （3）
      其中，周向拉伸率（λθ）由支架外径 d1 与其初始直径 d0 的比值给出。
  3. 校正培养基蒸发损失，并每周更换三次培养基。
    1. 停止并断开流体系统和应变泵的电缆连接。
    2. 在培养基管路上夹上软管夹。
    3. 根据培养基储液罐上的体积刻度标记，确定蒸发的培养基体积。
    4. 将装有生物反应器和流体单元的托盘转移至超净工作台。
    5. 取下培养基储液罐的橡胶空气滤膜；加入经高压灭菌的超纯水，以补偿蒸发掉的培养基体积。再次封闭储液罐，并重新连接至泵，使超纯水与培养基充分混合。
    6. 重复步骤6.3.1–6.3.5。再次取下橡胶空气滤膜，取出25 mL培养基，在室温下以300 × g 离心5分钟。
      1. 收集1.5 mL上清液，于-30 °C保存，用于分泌谱分析（如酶联免疫吸附测定（ELISA））。
      2. 根据旁分泌信号研究需要，取适量上清液作为条件培养基使用43。
    7. 向培养基储液罐中加入25 mL新鲜培养基。
    8. 将橡胶空气滤膜重新安装至培养基储液罐上。
    9. 将整个装置放回培养箱；重新连接所有电缆和气路管至泵和应变泵。松开软管夹，并重复步骤5.4–5.8。
  4. 检查连接至泵的干燥瓶中的硅胶干燥珠是否潮湿（呈白色），如已受潮（呈橙色），则更换为干燥的硅胶珠。

7. 实验结束、样品采集及仪器清洁与保存

  1. 在实验的最后一天，按照步骤 6.3.1–6.3.5 所述校正培养基蒸发，并逐一收获样品。
    1. 为逐一收获样品，需多次暂停流泵和应变泵。在培养基管路上夹上软管夹，暂时停止流泵和应变泵。将一个流式培养室从生物反应器底座上断开，并用白色鲁尔帽封闭生物反应器底座。将该流式培养室和流体单元转移至超净工作台。重新启动流泵和应变泵，继续对其他样品施加血流动力学负荷，直至完成收获。
    2. 从培养基储液罐中收集培养基，用于通过 ELISA 分析旁分泌细胞因子的产生。
  2. 拆下流体单元并收获管状构建物。根据所需的切割方案进行分段。构建物的部分样品可在 4 °C 下保存（经 3.7% 甲醛固定 15 分钟，再用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟），或在 -30 °C 下保存（经液氮速冻后），以待进一步分析。
  3. 清洁生物反应器和泵组件。此外，每种物品建议的清洁方法见材料表。
    1. 用 70% 乙醇清洁橡胶空气过滤器。注意切勿润湿滤芯内部！
    2. 收集所有独立组件：培养基管路、培养基储液罐、玻璃管、雄性鲁尔塞、雌性鲁尔锁、白色鲁尔帽、压力导管、鼻锥、硅胶 O 型圈、接头衬套、整流器（不包括泵、流体单元、橡胶空气过滤器和生物反应器底座），并在流动的自来水下冲洗。
    3. 在去离子水中浸泡过夜，加入 0.1% 十二烷基硫酸钠。
      注意：请勿使用超纯水，否则部件可能发生锈蚀。
    4. 用自来水和洗洁精冲洗。
    5. 依次浸入去离子水中，然后用 70% 乙醇浸泡两次，再用去离子水冲洗。
    6. 将所有材料分别置于纸巾上晾干。使用加压空气干燥管路。
    7. 用浸有 70% 乙醇的纸巾清洁所有不可高压灭菌的材料。包括橡胶空气过滤器（注意保持过滤器干燥）和生物反应器底座（特氟龙波纹管和气动缸）。
    8. 对流体室组件（包括硅胶 O 型圈）、培养基管路、培养基储液罐（不含橡胶空气过滤器）、雄性鲁尔塞和雌性鲁尔接头、白色鲁尔帽、软管夹以及常规设备（如镊子、止血剪）进行高压灭菌。
    9. 为便于下次实验使用，将一套完整流体室的所有组件放入一个可高压灭菌的盒子中保存。
  4. 从液压储液罐中排出水分，用 70% 乙醇清洁，再用去离子水冲洗，晾干后重新注入去离子水并加入数滴水浴防腐消毒剂。
  5. 将流式培养室用的玻璃管保存在 70% 乙醇中。
  6. 将吸湿后呈白色的硅胶干燥珠置于烘箱中，在 120 °C 下过夜干燥至呈橙色，然后储存在密闭容器中。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该生物反应器旨在研究剪切应力和周期性拉伸对三维生物材料支架中血管组织生长和重塑的单独及联合作用。生物反应器的设计可支持在多种加载条件下同时培养多达八个血管结构（图1A）。血管结构被置于流动培养室中（图1B），其中环向拉伸和壁面剪切应力（WSS）均可独立控制。流动培养室的上部腔室容纳一个整流装置，可在相对较短的稳定段长度内稳定流体流动（图1C）。在整流装置的正下游，导流锥体将流体均匀分布至环形通道中（图1D）。当本方案的所有步骤均正确执行时，流动培养室中的血管支架可在支架与玻璃壁之间的环形通道内承受持续的单向流动，并由气动泵施加环向拉伸（图1E–F）。在安装支架前，应将静电纺丝管材切割为25 mm长的管段（图1G），并可通过扫描电镜（SEM）检查其微观...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述的生物反应器可用于系统评估剪切应力和周期性拉伸对管状可吸收支架中炎症反应和组织再生的单独及联合作用。该方法还可对血管构建物进行多种分析，如代表性结果部分所示。这些结果展示了不同血流动力学加载模式（即剪切与拉伸的不同组合）对组织工程血管构建物生长和重塑的独特影响。通过该体外平台获得的这些见解，有助于优化新型原位组织工程血管支架的设计参数。为确保实验流程的正确进行，理解本方案中的关键步骤及其局限性至关重要。

该实验方案中最关键的步骤与对样品施加拉伸力有关。在施加拉伸力时，确保整个系统无泄漏至关重要。系统中存在两个薄弱环节：一是将静电纺丝移植物固定到压力导管上的结，二是生物反应器底座与流动培养室之间的连接处。如步骤2.5.2和2.5.4所述，必须将多个牢固的结准确地固定在刻蚀凹槽处。如果结不够紧，或位置略高于或低于凹槽，则可能导致液压液轻微渗入流动培养室。这种泄漏可能表现为液压储液罐中的压力下降，以及为达到设定压力值而需要应变泵持续升高电压。此外，这还会导致流动培养室内的流体流动紊乱、细胞培养污染风险增加以及培养基被稀释。一旦发生此类情况，必须将该流动培养室从实验中移除，并使用白...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由ZonMw资助，属于LSH 2Treat项目（436001003）以及荷兰肾脏基金会（14a2d507）支持的一部分。N.A.K. 感谢欧洲研究理事会（851960）提供的资助。我们衷心感谢由荷兰科学研究组织资助的“材料驱动再生”重力计划（024.003.013）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级 Dulbecco's 改良 EagleMedium （aDMEM）Gibco12491-015细胞培养基，用于成纤维细胞
Aqua StabilJulabo8940012防止微生物在生物反应器-液压储液器中生长
纤维蛋白原SigmaF8630制备纤维蛋白原凝胶，将细胞接种在静电纺丝支架上
凝血酶SigmaT4648制备纤维蛋白原凝胶以将细胞接种在静电纺丝支架上
离心Eppendorf5804以旋转细胞和条件培养基
夹剪刀 - "凯利镊子"AlmedicP-422夹住硅胶管并在支架上进行预拉伸，以便将支架缝合到雕刻槽中（在步骤 1、步骤 7 处高压灭菌）
CO2 细胞培养箱Sanyo用于细胞培养的 MCO-170AIC-PE
压缩空气储液器FestoCRVZS-5平滑气压波动并为压力积聚创建时间延迟
自定义 Matlab 脚本，用于计算最大拉伸MatlabR2017。Mathworks， Natick， MA计算电纺支架的最小和最大外径
数据采集板National InstrumentsBNC-2090数据处理在放大器系统和计算机之间
乙醇VWRVWRK4096-9005保持无菌工作条件
胎牛血清 （FBS）Greiner758087细胞培养基补充剂;补充血清
的流动培养室，由一个带有雕刻凹槽和小孔的压力导管组成，用于在硅胶管上施加压力、螺纹、鼻锥、带进流口和底部隔室出流口的顶部隔室、适配器衬套定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系n.a.flow培养室隔室（步骤 1 的高压灭菌器， 步骤 7）
玻璃巴斯德移液管助手HE40567002在静电纺丝支架上施加真空（步骤 1 中的高压灭菌器）
流动培养室的玻璃管，设备和埃因霍温理工大学原型中心（不适用式培养室的一部分（在第 1 步和第 7 步中清洁并储存在 70% 乙醇中）
GlutaMaxGibco35050061细胞培养基氨基酸补充剂，可最大限度地减少氨积聚高速
相机MotionScopeM-5监测培养过程中的拉伸;以 30 Hz 的频率拍摄脚手架的延时照片，持续 6 秒（即 3 个拉伸周期）
高速相机镜头 - 微距尼克尔 55mm f/2.8 - 镜头尼康JAA616AB监测培养过程中的拉伸;脚手架的延时照片以 30 Hz 的频率拍摄 6 秒（即 3 个拉伸周期）
软管夹ibidi GmbH10821块介质流量（步骤 1 处的高压灭菌器， 步骤 7）
带有 8 个螺纹的液压储液器，用于 8 个流动培养室定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系n.a.对硅胶安装的结构施加压力（用含 70% 乙醇的纸巾清洁外部，用 70% 乙醇冲洗储液器，然后用去离子水冲洗储液器，在第 1 步和第 7 步）
Ibidi 泵系统 （8x） 包括 ibidi 泵、PumpControl 软件、流体装置、灌注装置（介质管）、气压管、带有橙色二氧化硅珠的干燥瓶ibidi GmbH10902设置用于控制流动培养室中的流量。注 1：制造商对 ibidi 泵进行了修改，以实现 200 mbar 的容量。注 2：可以由其他制造商的泵系统代替，只要可以应用相同的流态。
刀（10 号无菌刀片，独立铝箔包）和手术刀手柄（不锈钢，单独包装）Swann Morton0301;0933将硅胶管切割成适合脚手架的正确尺寸并切割缝合材料
LabVIEW 软件National Instruments2018 版，以控制施加在脚手架上的拉伸
带紫外线的层流生物安全柜Labconco302310001确保无菌的工作条件。紫外线用于净化所有不能高压灭菌或高压灭菌后无法触摸的东西
大大小小的培养皿Greiner664-160用于无菌工作条件
L-抗坏血酸 2-磷酸（维生素 C）SigmaA8960细胞培养基补充剂，对胶原蛋白生产很重要
LED 光源 KL2500蔡司肖特股份公司为了帮助在监测拉伸
鲁尔（母和公）锁和连接器ibidi GmbH各种，参见 （https://ibidi.com/26-flow-accessories）关闭或连接生物反应器和 ibidi 泵的部件（第 1 步、第 7 步的高压灭菌器）
测量放大器 （PICAS）PEEKEL instruments BV注意放大来自压力传感器的信号并反馈到 LabView
中型储液罐（60 mL 大注射器）和储液槽支架ibidi GmbH10974中型储液罐（步骤 1、步骤 7 的高压灭菌器）
外径为 4.25 mm 和 1 mm 内径的中型管BV1805橡胶为了实现更大的流速，使用了直径较大的 ibidi 中型管。注意：通过流体单元阀引导的中型管部分与默认的 ibidi 中型管相同
Motion Studio SoftwareIdtvision2.15.00用于制作用于拉伸监测的高速延时图像
针头 （19G）BD Microlance301700与细软管一起用于用超纯水填充液压油箱，无需添加气泡
针头驱动器Adson2429218通过硅胶管处理尼龙缝合线的针头（步骤 1、步骤 7 的高压灭菌器）
纸巾Kleenex38044001，用于用 70% 乙醇清洁设备
封口膜SigmaP7793-1EA如果发生泄漏，则快速修复
青霉素/链霉素 （P/S）LonzaDE17-602E细胞培养基补充剂;防止细菌污染
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）SigmaP4417-100TAB用于储存和洗涤步骤（步骤 1 高压灭菌器）
带红色螺旋盖的塑料容器 （60 mL）制备纤维蛋白原溶液Greiner
206202 气缸FestoAEVC-20-10-I-P用于驱动特氟龙波纹管（在步骤 1 和 7 中用含 70% 乙醇的纸巾清洁）
聚己内酯双脲 （PCL-BU） 管状支架（3 mm 内径，200 µm 壁厚，20 mm 长）SyMO-Chem，荷兰埃因霍温n.a.15% （w/w） 氯仿（Sigma;372978）聚合物溶液的静电纺丝生产。有关详细信息，请参见 Van Haaften 等人组织工程 C 部分（2018
） 无孔压力导管（用于静电控制）定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系n.a.将静电纺丝管安装在硅管上（步骤 1、步骤 7 的高压灭菌器）
压力传感器和传感器BDTC-XX 和 P 10 EZ流向气动泵的气压升高，直至达到设定压力
比例气压控制阀和压力传感器FestoMPPES-3-1/8-2-010,159596为气动泵提供压缩空气
罗斯威尔公园纪念研究所 1640 （RPMI-1640）GibcoA1049101单核细胞/巨噬细胞细胞培养基
安全锁定 Eppendorf 管 （1.5 mL）Eppendorf30120086多种应用（步骤 1 高压灭菌器）
十二烷基硫酸钠溶液 20%Sigma5030用于清洁材料，浓度为 0.1%。 
硅胶 O 形圈Technirub1250S防止泄漏（第 1 步、第 7 步高压灭菌器）
硅胶管（外径 2.8 mm，壁厚 400 um）橡胶 BV1805用于将静电纺丝管安装在压力导管上（第 1 步高压灭菌器）
无菌管 （15 mL）Falcon352095多种应用
合线，5-0 prolene，带预装锥形针头Ethicon， Johnson&JohnsonEH7404HProlene 缝合线 5-0（75 cm 长，TF 锥形针，1/2 圆圈，13 mm 针长）
注射器 （24 mL）B. Braun Melsungen AG2057932将超纯水或培养基添加到液压储液器或流动培养室
针式过滤器（0.2 µm）Satorius17597-K过滤纤维蛋白原溶液
T150 细胞培养瓶（带过滤盖Nunc178983脱气培养基
T75 细胞培养瓶（带过滤盖Nunc156499 培养静电对照样品
特氟龙波娄定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系n.a.加载液压储液器（在步骤 1 和 7 中用含 70% 乙醇的纸巾清洁外部）
托盘（不锈钢）PolarWare15-248用于将流体培养室和生物反应器从培养箱运输到层流柜并返回（使用前后用含 70% 乙醇的纸巾清洁）
镊子Wironit4910单个部件的无菌处理（步骤 1 和 7 的高压灭菌器）
超纯水StakpureOmniapure UV 18200002校正中等蒸发，与 aqua stabil 混合并用作液压油。（步骤 1 的高压灭菌超纯水）
飞利浦TUV 30W/G30 T8紫外光灯，用于在接种前对移植物和生物反应器部件进行去污
牛 牛机 Custon 制造的）流 用于期间脚手架的延时可视化，白色鲁尔帽 用于的 使用 年缝中） ）

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