一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

摘要

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。

摘要

从转化医学的角度来看，使用可吸收生物材料在体内直接诱导再生是一种极具吸引力的策略。这类材料在植入后会引发炎症反应，而该炎症反应正是材料后续被吸收以及新组织再生的驱动因素。这一策略也被称为原位组织工程，目前正被用于开发心血管替代物，例如组织工程血管移植物。炎症反应和再生过程均受到支架局部生物力学信号（即拉伸和剪切应力）的调控。本文详细描述了一种自主开发的生物反应器的使用方法，该反应器能够独特地将管状支架上的拉伸应力与剪切应力解耦。这使得在精确控制的力学载荷条件下，对管状支架的炎症反应能力和再生能力进行系统化、标准化的评估成为可能。我们通过人源巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养实验，展示了该方法的应用。本文详细讨论了该方法中的关键操作步骤，包括生物反应器的构建与设置、支架的制备与细胞接种、拉伸与剪切流的施加及维持，以及用于分析的样本采集。

引言

心血管组织工程（TE）正被探索作为当前使用的心血管永久性假体（例如，血管移植物、心脏瓣膜置换物）的一种替代治疗方案，而现有假体对大量患者群体而言效果并不理想^1,2,3,4。备受关注的应用包括组织工程血管移植物（TEVGs）^5,6和组织工程心脏瓣膜（TEHVs）^7,8。通常，心血管组织工程技术采用可吸收生物材料（天然或合成材料），作为引导新组织形成的支架。新组织的形成可通过两种方式实现：一种是完全在体外进行，即将细胞接种于支架上，并在植入前于生物反应器中培养（体外TE）^9,10,11；另一种是在体内原位直接实现，即将合成支架未经预培养直接植入体内，以诱导新组织在体内原位形成（原位TE）^12,

方案

在本方案所述的研究中，使用了从外周血富集层分离的原代人巨噬细胞，以及从冠状动脉旁路移植术后大隐静脉中分离的人肌成纤维细胞⁴⁴。富集层样本来自健康的匿名志愿者，志愿者均签署了经Sanquin Research机构医学伦理委员会批准的书面知情同意书。人源大隐静脉细胞（HVSCs）的使用遵循荷兰医学协会联合会（FMWV）制定的《人体组织二次利用伦理规范》。

1. 生物反应器设置前的常规准备与必要操作

注意：有关相应的分离与培养方案的详细信息，请参见先前的研究^19,43,44。本方案中的所有计算均以单核细胞与肌成纤维细胞共培养实验为例，实验设置为8个施加血流动力学载荷的支架和2个静态对照组（n=10）。

1. 开始细胞分离与细胞培养。共培养样本（单核细胞与肌成纤维细胞的接种比例为2:1）的接种密度分别为 30 × 10⁶ 单核细胞/cm³ 和 15 × 10⁶ 肌成纤维细胞/cm³。
   注意：电纺材料具有高孔隙率（>90%）。为估算每段移植物所需的细胞数量，使用空心圆柱体体积公式计算支....

结果

该生物反应器旨在研究剪切应力和周期性拉伸对三维生物材料支架中血管组织生长和重塑的单独及联合作用。生物反应器的设计可支持在多种加载条件下同时培养多达八个血管构建体（图1A）。血管构建体被置于流动培养室中（图1B），其中环向拉伸和壁面剪切应力（WSS）均可独立控制。流动培养室的上部腔室装有流动整流器，可在相对较短的稳定长度内使流场稳定（图1C）。在流动整流器正下游，导流锥体将流体均匀地分配至环形通道中（图1D）。当实验方案的所有步骤均正确执行时，流动培养室中的血管支架可在支架与玻璃壁之间的环形通道内承受持续单向流动，并由气动泵施加环向拉伸（图1E–F）。在安装支架前，应将静电纺丝管状材料切割为25 mm长的管段（图1G），并可通过扫描电镜（SEM）检测其.......

讨论

本文所述的生物反应器可用于系统评估剪切应力和周期性拉伸对管状可吸收支架中炎症反应和组织再生的单独及联合作用。该方法还可对血管构建物进行多种分析，如代表性结果部分所示。这些结果展示了不同血流动力学加载模式（即剪切与拉伸的不同组合）对组织工程血管构建物生长和重塑的独特影响。通过该体外平台获得的这些见解，有助于优化新型原位组织工程血管支架的设计参数。为确保实验流程的正确进行，理解本方案中的关键步骤及其局限性至关重要。

该实验方案中最关键的步骤与对样品施加拉伸力有关。在施加拉伸力时，确保整个系统无泄漏至关重要。系统中存在两个薄弱环节：一是将静电纺丝移植物固定到压力导管上的结，二是生物反应器底座与流动培养室之间的连接处。如步骤2.5.2和2.5.4所述，必须将多个牢固的结准确地固定在刻蚀凹槽处。如果结不够紧，或位置略高于或低于凹槽，则可能导致液压液轻微渗入流动培养室。这种泄漏可能表现为液压储液罐中的压力下降，以及为达到设定压力值而需要应变泵持续升高电压。此外，这还会导致流动培养室内的流体流动紊乱、细胞培养污染风险增加以及培养基被稀释。一旦发生此类情况，必须将该流动培养室从实验中移除，并使用白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级杜氏改良伊格尔培养基’改良型伊格尔培养基（aDMEM）	Gibco	12491-015	成纤维细胞培养基
Aqua Stabil	Julabo	8940012	防止生物反应器-液压储液罐中的微生物生长
牛纤维蛋白原	Sigma	F8630	制备纤维蛋白原凝胶以在电纺支架上接种细胞
牛凝血酶	Sigma	T4648	制备纤维蛋白原凝胶以在电纺支架上接种细胞
离心	Eppendorf	5804	离心收集细胞和条件培养基
止血钳剪刀 - "凯利钳"	阿尔梅迪克	P-422	夹紧硅胶管，对支架施加预拉伸，以便将支架缝合至刻蚀凹槽中（步骤1和步骤7进行高压灭菌）
CO2 细胞培养箱	三洋	MCO-170AIC-PE	用于细胞培养
压缩空气储罐	Festo	CRVZS-5	平滑气压波动并为压力积聚创造时间延迟
自定义 Matlab 脚本用于计算最大拉伸率	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	计算静电纺丝支架的最小和最大外径
数据采集板	National Instruments	BNC-2090	放大器系统与计算机之间的数据处理
乙醇	VWR	VWRK4096-9005	保持无菌工作条件
胎牛血清（FBS）	Greiner	758087	细胞培养基添加剂；血清补充剂
流动培养室组件，包括带有刻蚀凹槽和小孔的压力导管（用于向硅胶管施加压力）、螺纹、锥形头、带流体入口的上部组件和带流体出口的下部组件、转接衬套	定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系	n.a.	流体培养室隔间（步骤1、步骤7中进行高压灭菌）
玻璃巴斯德吸管	可吸收生物材料在体内直接诱导再生的策略在转化医学中具有重要吸引力。这类材料在植入后会引发炎症反应，进而驱动材料自身的降解以及新生组织的再生。该策略亦被称为原位组织工程，正被用于开发心血管替代物，如组织工程血管移植物。材料支架所受的局部生物力学信号（即拉伸和剪切应力）决定了后续的炎症反应与组织再生过程。本文详细描述了一种自主开发的生物反应器的使用方法，该装置能够独特地实现对管状支架上拉伸与剪切应力的解耦控制。由此可在精确调控的力学载荷条件下，对管状支架的炎症响应与再生能力进行系统性与标准化评估。我们通过人源巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养实验，验证了该方法的应用效果。文中详细讨论了该技术的关键操作步骤，包括生物反应器的构建与调试、支架制备与细胞接种、拉伸与剪切流的施加及维持，以及用于分析的样本采集。	HE40567002	对电纺支架（步骤1中已进行高压灭菌）施加真空
流培培养室的玻璃管	定制设备 &埃因霍温理工大学先进制造与原型中心	n.a.	流体培养室的部件（在步骤1和步骤7中用70%乙醇清洗并保存）
GlutaMax	Gibco	35050061	细胞培养基氨基酸补充剂，可减少氨的积累
高速相机	MotionScope	M-5	用于在培养期间监测拉伸；以每秒30帧的频率连续6秒拍摄支架的时间序列图像（即3个拉伸周期）
高速摄像镜头 - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - 镜头	尼康	JAA616AB	以在培养期间监测拉伸情况；以每秒30帧的频率拍摄支架的时间推移图像，持续6秒（即3个拉伸周期）
软管夹	ibidi GmbH	10821	阻断培养基流动（在第1步和第7步进行高压灭菌）
带有8个螺纹接口的液压储液罐，用于连接8个流动培养室	定制制造，荷兰埃因霍温理工大学生物医学工程系	n.a.	对安装在硅胶上的构建物施加压力（在步骤1和7，用含70%乙醇的纸巾清洁外部，用70%乙醇冲洗储液器，随后用去离子水冲洗）
Ibidi 泵系统（8套），包括 Ibidi 泵、PumpControl 软件、流体单元、灌注套装（培养基管路）、气压管路、含橙色硅胶珠的干燥瓶	ibidi GmbH	10902	用于控制流体培养室中流速的装置。注意1：ibidi泵经制造商改装，以实现200 mbar的压力容量。注意2：可替换为其他厂商的泵系统，只要能施加相同的流动模式即可。
手术刀片（10号无菌刀片，单个铝箔包装）和手术刀柄（不锈钢，单独包装）	Swann Morton	0301; 0933	切割硅胶管至支架所需的合适尺寸，并切割缝合材料
LabVIEW 软件	National Instruments	版本 2018	控制施加于支架的拉伸力
带有紫外灯的层流生物安全柜	Labconco	302310001	以确保无菌工作条件。紫外线用于对无法进行高压灭菌或在高压灭菌后可能被接触的物品进行去污染。
大、小培养皿	格雷纳	664-160	用于无菌工作条件
L-抗坏血酸-2-磷酸（维生素C）	Sigma	A8960	细胞培养基添加剂，对胶原蛋白生成至关重要
LED 光源冷光源 KL2500	蔡司	Schott AG	以帮助在监测支架拉伸过程中进行延时成像的可视化
鲁尔接头（雌性和雄性）锁扣与连接器，白色鲁尔帽	ibidi GmbH	多种，见（https://ibidi.com/26-flow-accessories）	用于封闭或连接生物反应器和ibidi泵的部件（在步骤1和步骤7中进行高压灭菌）
测量放大器（PICAS）	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	用于放大压力传感器的信号并反馈至LabView
培养基储液器（大容量注射器，60 mL）及储液器支架	ibidi GmbH	10974	培养基储液罐（步骤1和步骤7中进行高压灭菌）
外径为4.25 mm、内径为1 mm的中等硬度导管	Rubber BV	1805	以实现更大的流速，使用了直径更大的 ibidi 培养基管路。注意：穿过流体单元阀门的培养基管路部分与默认的 ibidi 培养基管路相同
Motion Studio 软件	Idtvision	2.15.00	用于获取用于拉伸监测的高速时间序列图像
针头（19G）	BD Microlance	301700	与细的柔性管路一起使用，用于向液压储液器中注入超纯水而不引入气泡
持针器	艾德森	2429218	用尼龙缝合线的针穿过硅胶管（在第1步和第7步进行高压灭菌）
纸巾	Kleenex	38044001	使用70%乙醇对设备进行清洁
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	若发生泄漏，快速处理方法
青霉素/链霉素（P/S）	Lonza	DE17-602E	细胞培养基添加剂；防止细菌污染
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P4417-100TAB	用于储存和洗涤步骤（步骤1中进行高压灭菌）
带红色螺旋盖的塑料容器（60 mL）	格雷纳	206202	制备纤维蛋白原溶液
气动缸	Festo	AEVC-20-10-I-P	驱动特氟龙波纹管（在步骤1和步骤7中用含70%乙醇的纸巾清洁）
聚己内酯双脲（PCL-BU）管状支架（3 mm 内径，200 µm 壁厚，20 mm 长度	SyMO-Chem，荷兰埃因霍温	n.a.	采用15%（w/w）氯仿（Sigma；372978）聚合物溶液通过静电纺丝制备。更多细节参见Van Haaften等，Tissue Engineering Part C（2018）
无孔压力导管（用于静态对照）	定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系	未提供	将静电纺丝管安装到硅胶管上（步骤1和步骤7中进行高压灭菌）
压力传感器与换能器	BD	TC-XX 和 P 10 EZ	向气动驱动泵输送的气压逐渐升高，直至达到设定压力
比例式空气压力控制阀和压力传感器	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	为气动驱动泵提供压缩空气
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	单核细胞/巨噬细胞培养基
安全锁式 Eppendorf 管（1.5 mL）	Eppendorf	30120086	多种应用（步骤1中进行高压灭菌）
20% 十二烷基硫酸钠溶液	Sigma	5030	用于清洁材料，浓度为 0.1%。
硅胶O型环	Technirub	1250S	以防止泄漏（在步骤1、步骤7中进行高压灭菌）
硅胶管（2.8 mm 外径，400 μm 管壁厚度）	橡胶 BV	1805	将静电纺丝管安装到压力导管上（在步骤1中进行高压灭菌）
无菌管（15 mL）	Falcon	352095	多种应用
5-0 Prolene 缝线，带预装锥形针	Ethicon, Johnson&安普&约翰逊	EH7404H	Prolene 缝合线 5-0（75 厘米长，TF 圆锥尖针，1/2 圆弧，针长 13 毫米）
注射器（24 mL）	B. Braun Melsungen AG	2057932	向液压储液器或流动培养室中加入超纯水或培养基
注射器滤器（0.2 µm)	Satorius	17597-K	过滤纤维蛋白原溶液
带滤膜瓶盖的T150细胞培养瓶	Nunc	178983	去除培养基中的气体
带滤膜瓶盖的T75细胞培养瓶	Nunc	156499	用于培养静态对照样本
聚四氟乙烯波纹管	定制生产，埃因霍温理工大学生物医学工程系	n.a.	用沾有70%乙醇的纸巾清洁液压储液器外部（步骤1和步骤7）
托盘（不锈钢）	PolarWare	15-248	便于将流体培养室和生物反应器在培养箱与超净工作台之间转移（使用前后用含70%乙醇的纸巾清洁）
镊子	Wironit	4910	各部件的无菌操作（第1步和第7步进行高压灭菌）
超纯水	Stakpure	Omniapure UV 18200002	为校正培养基蒸发，与水稳定剂混合并用作液压流体。（在步骤1中对超纯水进行高压灭菌）
紫外光	Philips	TUV 30W/G30 T8	用于接种前移植物和生物反应器部件的去污处理