本方案描述了利用聚合和去聚合循环从小规模或中等规模来源（如培养细胞或单个小鼠脑组织）中纯化微管蛋白的方法。所获得的纯化微管蛋白在特定异构体或特定翻译后修饰方面得到富集，可用于体外重建实验，以研究微管动力学及其相互作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
微管细胞骨架研究的一个重要方面是在体外重建实验中探究微管的行为。这类实验可用于分析微管的内在特性（如动态行为）及其与微管相关蛋白（MAPs）的相互作用。“微管蛋白密码”是一个新兴概念，强调不同的微管蛋白异构体以及多种翻译后修饰（PTMs）对微管特性和功能的调控作用。为了深入探究微管蛋白密码的分子机制，关键在于利用具有特定异构体和翻译后修饰的纯化微管蛋白进行体外重建实验。
迄今为止，这一目标在技术上具有挑战性，因为体外实验中广泛使用的脑源性微管蛋白含有多种翻译后修饰，并具有特定的亚型组成。因此，我们开发了本实验方案，采用经典的聚合与解聚循环方法，从不同来源纯化具有不同亚型组成和可控翻译后修饰的微管蛋白。与基于亲和纯化的现有方法相比，该方法可获得高纯度且具备聚合能力的微管蛋白，因为在连续的纯化步骤中，无法正常聚合或解聚的微管蛋白会被去除。
我们描述了从悬浮培养或贴壁培养的细胞系以及单个小鼠脑组织中纯化微管蛋白的方法。该方法首先介绍了在悬浮和贴壁条件下细胞量的制备，随后进行细胞裂解，再通过聚合-去聚合循环的连续步骤实现微管蛋白的纯化。本方法获得的微管蛋白可用于研究微管蛋白编码对微管内在特性及其与相关蛋白相互作用影响的实验。
引言
微管在多种细胞过程中发挥着关键作用。它们赋予细胞形态，构建减数分裂和有丝分裂过程中用于染色体分离的纺锤体，并作为细胞内运输的轨道。为了执行这些多样的功能，微管会以不同的方式组织自身。该领域中一个引人关注的问题是：结构上和进化上保守的微管如何适应如此多样的组织形式和功能，其背后的分子机制是什么。一种可能的机制是微管的多样化，这一概念被称为“微管蛋白编码”1,2,3。微管蛋白编码包含两个主要组成部分：α-和β-微管蛋白基因产物（即微管蛋白异构体）在微管中的差异性整合，以及微管蛋白的翻译后修饰（PTMs）。
自20世纪70年代以来，体外重建实验结合不断发展的光学显微镜技术，为揭示微管的特性——如动态不稳定性4和踏车行为5，以及其他机制与功能6,7,8,9,10,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究的动物护理与使用均遵循欧洲共同体（2010/63/UE）的建议。实验操作已由居里研究所伦理委员会 CEEA-IC #118（由国家主管部门授予编号 04395.03 的许可）特别批准，符合国际指导原则。
1. 微管蛋白纯化所需试剂的制备
注意：用于微管蛋白纯化的所有缓冲液应含有钾盐，不得含有钠盐30。
- 配制1 L完全培养基：含10%胎牛血清（FBS，100 mL）、200 mM L-谷氨酰胺（2 M母液10 mL）和1×青霉素-链霉素（100×母液10 mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。4 °C保存。
- 通过将140 g KOH溶于水中，定容至250 mL，配制10 M氢氧化钾（KOH）溶液，室温保存。
- 通过将36.5 g EDTA溶于水中，用KOH调节pH至8.0（否则EDTA无法溶解），定容至250 mL，过滤除菌后室温保存，配制pH 8的0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
- 向500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入5 mL 0.5 M EDTA，过滤除菌后室温保存，配制5 mM PBS-EDTA溶液。
- 通过将75.5 g PIPES溶于水中，用KOH调节pH至6.8（否则PIPES无法溶解），定容至500 mL，过滤除菌后4 °C保存，配制pH....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方法的主要目标是制备高质量、具备组装能力的微管蛋白，其产量足以使用纯化组分进行多次体外实验。由该微管蛋白组装形成的微管可用于基于全内反射荧光（TIRF）显微镜技术的重建实验，适用于动态或稳定的微管；也可用于研究微管动力学、微管相关蛋白（MAPs）或分子马达的相互作用以及马达产生的力学作用25。此外，还可用于微管-MAP共沉淀实验和固态核磁共振波谱分析28。
在整个纯化过程中，可通过考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶监测微管蛋白的富集程度与纯度，建议使用“TUB” SDS-PAGE凝胶，该凝胶可将α-和β-微管蛋白分离，而这两者在传统凝胶中会共迁移为单一蛋白条带32。在不同纯化步骤（除最后一步去聚合外，见实验方案）收集的裂解液应以相近的量上样，以评估微管蛋白纯化的成效（图2A）24。最终获得的微管蛋白样品极为珍.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法提供了一个平台，可从细胞系和单个小鼠脑组织中快速制备中等到较大量、具有组装能力的高质量微管蛋白。该方法基于多年来在该领域广泛使用的牛脑微管蛋白纯化金标准方案16,17。该方法的一个显著优势是采用HeLa S3细胞的悬浮培养体系，一旦建立，可在较少人工操作的情况下获得大量细胞。这使得该方案在任何细胞生物学实验室中都相对容易实施；而其他微管蛋白纯化方法18,19,32,37则需要特定设备和技术专长，因此主要由具备较强蛋白质纯化背景的实验室使用。当从贴壁细胞系制备较少量微管蛋白时，可使用多种不同的细胞系。我们已成功从HeLa、U-2 OS和HEK-293细胞中纯化出微管蛋白。若需进行更大规模的纯化，可将收获的细胞或脑组织在裂解缓冲液中速冻，并于-80 °C保存，.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由 ANR-10-IDEX-0001-02、LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 以及 Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 资助。CJ 得到居里研究所、法国国家科研署（ANR）项目 ANR-12-BSV2-0007 和 ANR-17-CE13-0021、法国国家癌症研究院（INCA）资助 2014-PL BIO-11-ICR-1 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 DEQ20170336756 的支持。MMM 得到战胜阿尔茨海默病基金会（Fondation Vaincre Alzheimer）资助 FR-16055p 以及法国阿尔茨海默病基金会（France Alzheimer）资助 AAP SM 2019 n°2023 的支持。JAS 得到欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 675737 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201904008210 的支持。SB 得到法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201805005465 的支持。
我们感谢 Janke 实验室的所有成员，特别是 J. Souphron，以及 G. Lakisic（Institut MICALIS，AgroParisTech）和 A. Gautreau（Ecole Polytechnique）在本实验方案建立过程中提供的帮助。我们还要感谢居里研究所....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl₂ | Sigma | #M1028 | |
| 1-L 细胞培养容器 | Techne F7610 | 用于悬浮培养。切勿搅拌空的悬浮瓶。当悬浮瓶置于细胞培养孵箱中时，应始终保持悬浮瓶的侧向阀门略微打开，以促进培养基与孵箱环境的气体平衡。’s 大气环境。使用后应立即用自来水注满旋转瓶，以防止残留细胞在瓶壁上干燥。用去离子水清洗瓶子，加入约 200 ml 去离子水后进行高压灭菌。在无菌细胞培养罩内去除水分，并在罩内静置数小时，使瓶子完全干燥。切勿使用洗涤剂清洗旋转瓶，因为任何残留的微量洗涤剂都可能对细胞产生有害影响。 | |
| 1.5 ml 和 2 ml 离心管 | |||
| 14 毫升圆底管 | |||
| 直径15厘米的无菌培养皿 | |||
| 15 ml 螺口管 | |||
| 2-巯基乙醇 | Sigma | #M3148 | 2-巯基乙醇具有毒性，应在通风橱中使用。 |
| 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟 | Sigma | #A8456 | |
| 40% 丙烯酰胺 | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5、10、20 ml 注射器 | |||
| 5 ml、10 ml、25 ml 无菌移液管 | |||
| 50 ml 螺口管 | |||
| 过硫酸铵（APS） | Sigma | #A3678 | |
| 抗α-微管蛋白抗体，12G10 | 由 J. Frankel 和 M. Nelson 开发，源自美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）支持建立的发育研究杂交瘤库，并由爱荷华大学维护 | 稀释比例：1/500 | |
| 抗谷氨酸化微管蛋白抗体，GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | 稀释比例：1/20,000 |
| 抑肽酶 | Sigma | #A1153 | |
| 天平（0.1 – 10 g | |||
| Beckman 1 L 聚丙烯瓶 | 用于收集悬浮培养物 | ||
| Beckman Avanti J-26 XP 离心机 | 用于收集悬浮培养物 | ||
| 生物搅拌器 | Techne MCS-104L | 安装于细胞培养孵育箱中（用于悬浮培养），Hela S3 和 HEK 293 细胞转速为 25 rpm | |
| 双N，N’-甲叉双丙烯酰胺 | 伯乐（Bio-Rad） | #161-0201 | |
| IKA Ultra-Turrax 匀浆器® | 使用5-mm探头（仪器功率设为6或7）在冰上匀浆脑组织，每次15秒，重复2-3次。 | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | #A7906 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | #1.08122 | |
| 羧肽酶A（CPA） | Sigma | #C9268 | 浓度：1.7 U/µl |
| 细胞培养罩 | |||
| 37℃细胞培养箱°C，5% CO2 | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | #D8418 | DMSO 可增强其他化合物的细胞和皮肤通透性。避免接触，并使用皮肤和眼部防护装备。 |
| DMEM 培养基 | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT，DL-二硫苏糖醇 | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| 乙醇，绝对 | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | #F7524 | |
| 法国压力细胞压碎机 | 赛默飞世尔科技公司 | #FA-078A | 使用#FA-032细胞破碎仪处理大量细胞。设定为中等比例，表压为1,000 psi（相当于破碎室内部压力3,000 psi）。 |
| 甘油 | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| 甘氨酸 | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| 加热块 | Stuart | #SBH130D | |
| Hela细胞 | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 细胞 | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| 盐酸（HCl） | VWR | #20252.290 | |
| 倒置显微镜 | 通过荧光检测以验证细胞转染是否成功 | ||
| 异丙醇 | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 转子 | 用于收集悬浮培养物 | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH 具有腐蚀性，可引起灼伤；使用时需佩戴眼部和皮肤防护装备。 |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | #25030123 | |
| 用于50 ml离心管的实验室离心机 | Sigma | 4-16 K | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma | #L2884 | |
| 液氮 | |||
| 微量移液器 p2.5、p10、p20、p100、p200 和 p1000 及相应的吸头 | |||
| 微型研磨棒 | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| 小鼠脑组织 | 本研究的动物饲养与使用均遵循欧洲共同体（2010/63/UE）的建议。实验程序已由居里研究所伦理委员会 CEEA-IC #118（国家主管部门授予编号 04395.03 的许可）特别批准，符合国际指导原则。 | ||
| 18G X 1 针头 ½” (1.2 × 38 mm | Terumo | #18G | |
| 20G X 1 针头 ½” (0.9 × 38 mm | Terumo | #20G | |
| 21G × 4 针头 ¾” (0.8 × 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | #15140130 | |
| pH计 | |||
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma | #P7626 | PMSF 粉末具有危险性。配制 PMSF 溶液时应使用皮肤和眼睛防护装备。 |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| 移液器助吸器 | |||
| 转子 | Beckman 70.1 Ti；TLA-100.3；和 TLA 55 | ||
| SDS-PAGE电泳设备 | 伯乐（Bio-Rad） | #1658001FC | |
| SDS，十二烷基硫酸钠 | VWR | #442444H | 用于制备Laemmli缓冲液 |
| SDS，十二烷基硫酸钠 | Sigma | #L5750 | 用于制备“TUB”SDS-PAGE凝胶 |
| 超声波破碎仪 | 布拉森 | #101-148-070 | 用于裂解贴壁培养的细胞。使用直径为6.5 mm的探头，将超声波破碎仪设定为 “输出控制” 1, “占空比” 10% 及时间取决于所使用的细胞类型。 |
| 用于1.5 ml离心管的台式离心机 | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED，N，N，N′，N′四甲基乙二胺 | Sigma | #9281 | |
| 曲古抑菌素 A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma碱（Tris） | Sigma | #T1503 | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | #15090046 | |
| 超速离心机转子 | TLA-55、TLA-100.3 和 70.1 Ti 转子 | 设为4°C 或 30°根据实验需求 | |
| 超速离心管 | 贝克曼 | #357448 | 用于与 TLA-55 转子配合使用 |
| 超速离心管 | 贝克曼 | #349622 | 用于与 TLA-100.3 转子配合使用 |
| 超速离心管 | 贝克曼 | #355631 | 用于 70.1 Ti 转子 |
| 超速离心机 | 贝克曼 | Optima L80-XP（或同等型号）和 Optima MAX-XP（或同等型号） | 设为4°C 或 30°根据实验需求而定 |
| 涡旋混合器 | |||
| 配备浮架或试管架的水浴锅 | 设定为30°C |
参考文献
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
