方法文章

通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

DOI：

10.3791/61826

⸱

2020年11月5日

 ,  ,  , 
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了利用聚合和去聚合循环从小规模或中等规模来源（如培养细胞或单个小鼠脑组织）中纯化微管蛋白的方法。所获得的纯化微管蛋白在特定异构体或特定翻译后修饰方面得到富集，可用于体外重建实验，以研究微管动力学及其相互作用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管细胞骨架研究的一个重要方面是在体外重建实验中探究微管的行为。这类实验可用于分析微管的内在特性（如动态行为）及其与微管相关蛋白（MAPs）的相互作用。“微管蛋白密码”是一个新兴概念，强调不同的微管蛋白异构体以及多种翻译后修饰（PTMs）对微管特性和功能的调控作用。为了深入探究微管蛋白密码的分子机制，关键在于利用具有特定异构体和翻译后修饰的纯化微管蛋白进行体外重建实验。

迄今为止，这一目标在技术上具有挑战性，因为体外实验中广泛使用的脑源性微管蛋白含有多种翻译后修饰，并具有特定的亚型组成。因此，我们开发了本实验方案，采用经典的聚合与解聚循环方法，从不同来源纯化具有不同亚型组成和可控翻译后修饰的微管蛋白。与基于亲和纯化的现有方法相比，该方法可获得高纯度且具备聚合能力的微管蛋白，因为在连续的纯化步骤中，无法正常聚合或解聚的微管蛋白会被去除。

我们描述了从悬浮培养或贴壁培养的细胞系以及单个小鼠脑组织中纯化微管蛋白的方法。该方法首先介绍了在悬浮和贴壁条件下细胞量的制备，随后进行细胞裂解，再通过聚合-去聚合循环的连续步骤实现微管蛋白的纯化。本方法获得的微管蛋白可用于研究微管蛋白编码对微管内在特性及其与相关蛋白相互作用影响的实验。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管在多种细胞过程中发挥着关键作用。它们赋予细胞形态，构建减数分裂和有丝分裂过程中用于染色体分离的纺锤体，并作为细胞内运输的轨道。为了执行这些多样的功能，微管会以不同的方式组织自身。该领域中一个引人关注的问题是：结构上和进化上保守的微管如何适应如此多样的组织形式和功能，其背后的分子机制是什么。一种可能的机制是微管的多样化，这一概念被称为“微管蛋白编码”1,2,3。微管蛋白编码包含两个主要组成部分：α-和β-微管蛋白基因产物（即微管蛋白异构体）在微管中的差异性整合，以及微管蛋白的翻译后修饰（PTMs）。

自20世纪70年代以来，体外重建实验结合不断发展的光学显微镜技术，为揭示微管的特性——如动态不稳定性4和踏车行为5，以及其他机制与功能6,7,8,9,10,11,12,13,14,15——铺平了道路。迄今为止，几乎所有的体外实验均基于通过反复的聚合与解聚循环从脑组织中纯化的微管蛋白16,17。尽管从脑组织中纯化具有可大量获取高质量微管蛋白（通常为克级产量）的优势，但其一个重要缺陷在于异质性：从脑组织纯化的微管蛋白是多种微管蛋白异构体的混合物，并富含多种微管蛋白翻译后修饰（PTMs）。这种异质性使得无法明确特定微管蛋白PTM或异构体在调控微管特性与功能中的具体作用。因此，制备具有可控微管蛋白PTMs且异构体组成均一的功能性组装微管蛋白，对于解析微管密码的分子机制至关重要。

最近，已开发出一种利用酵母Stu2p的微管结合TOG（肿瘤过表达基因）结构域通过亲和层析纯化微管蛋白的方法18。该方法将细胞或组织的粗裂解液通过一个固定有TOG结构域的层析柱，使微管蛋白与基质上的TOG结构域结合，从而能够分析给定样本（即使样本量非常小）中全部微管蛋白池。近年来，还报道了一种长期期待的重组微管蛋白纯化方法，该方法基于杆状病毒表达系统，利用含有α-和β-微管蛋白基因的双顺反子载体在昆虫细胞中表达19。然而，该方法操作繁琐且耗时较长，因此主要用于体外研究微管蛋白突变20以及微管蛋白异构体21,22,23的影响。

在本实验方案中，我们描述了一种基于成熟且广泛应用的聚合-去聚合方法的技术，用于从细胞系或小鼠脑组织中制备具有不同修饰水平的微管蛋白24。该方法通过在可溶形式（4 °C 下的微管蛋白二聚体）与聚合形式（在鸟苷-5'-三磷酸 [GTP] 存在下，30 °C 时形成的微管）之间循环微管蛋白来实现纯化。每种形式通过连续的离心步骤进行分离：在低温（4 °C）离心后，微管蛋白二聚体保留在上清中，而微管则在30 °C 离心后形成沉淀。此外，其中一个聚合步骤在高浓度哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)（PIPES）条件下进行，从而可去除与微管结合的蛋白，最终获得高纯度的微管蛋白。从悬浮或贴壁培养的 HeLa S3 细胞中纯化的微管蛋白几乎不含任何微管蛋白翻译后修饰（PTM），并已被用于近期的体外重建实验25,26,27,28。我们进一步优化了该方法，使其适用于从小鼠单个脑组织中纯化微管蛋白，可用于大量具有微管蛋白异构体及翻译后修饰改变的小鼠模型研究。

在本实验方案中，我们首先描述了源材料（细胞团或脑组织）的制备及其裂解过程（图1A），随后通过微管蛋白的聚合与去聚合的连续步骤来纯化微管蛋白（图1B）。我们进一步描述了评估纯度的过程（图2A，B）和数量（图3A，B纯化微管蛋白的产量。该方法可通过在微管蛋白纯化前于细胞中过表达特定修饰酶，从而制备富含选定翻译后修饰（PTM）的微管蛋白。图 4B）。或者，可在纯化过程中向微管蛋白中添加微管蛋白修饰酶。最后，我们还可从缺乏相应微管蛋白修饰酶的小鼠脑组织中纯化出缺少特定异构体或翻译后修饰的微管蛋白图4B)29.

本文所述方法具有两个主要优势：（i）可在相对较短的时间内生产出足够大量的微管蛋白；（ii）能够获得高质量且高纯度的微管蛋白，其微管蛋白异构体组成或翻译后修饰具有特异性。在本论文的配套视频中，我们重点展示了该实验流程中的一些关键步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的动物护理与使用均遵循欧洲共同体（2010/63/UE）的建议。实验操作已由居里研究所伦理委员会 CEEA-IC #118（由国家主管部门授予编号 04395.03 的许可）特别批准，符合国际指导原则。

1. 微管蛋白纯化所需试剂的制备

注意：用于微管蛋白纯化的所有缓冲液应含有钾盐，不得含有钠盐30。

  1. 配制1 L完全培养基：含10%胎牛血清（FBS，100 mL）、200 mM L-谷氨酰胺（2 M母液10 mL）和1×青霉素-链霉素（100×母液10 mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。4 °C保存。
  2. 通过将140 g KOH溶于水中，定容至250 mL，配制10 M氢氧化钾（KOH）溶液，室温保存。
  3. 通过将36.5 g EDTA溶于水中，用KOH调节pH至8.0（否则EDTA无法溶解），定容至250 mL，过滤除菌后室温保存，配制pH 8的0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
  4. 向500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中加入5 mL 0.5 M EDTA，过滤除菌后室温保存，配制5 mM PBS-EDTA溶液。
  5. 通过将75.5 g PIPES溶于水中，用KOH调节pH至6.8（否则PIPES无法溶解），定容至500 mL，过滤除菌后4 °C保存，配制pH 6.8的0.5 M K-PIPES溶液。
  6. 通过将15.1 g PIPES溶于水中，用KOH调节pH至6.8，定容至50 mL，过滤除菌后4 °C保存，配制pH 6.8的1 M K-PIPES溶液。
  7. 通过将47.5 g EGTA溶于水中，用KOH调节pH至7.7，定容至250 mL，过滤除菌后室温保存，配制pH 7.7的0.5 M钾-乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸（K-EGTA）溶液。
  8. 通过混合3.2 mL 0.5 M PIPES、40 µL 0.5 M K-EGTA和20 µL 1 M MgCl2，定容至20 mL，配制BRB80溶液（80 mM K-PIPES，pH 6.8；1 mM K-EGTA；1 mM氯化镁[MgCl2]）。4 °C保存。
  9. 将435 mg苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于异丙醇中，定容至25 mL，配制0.1 M PMSF溶液，-20 °C保存。
  10. 将10 mg抑肽酶、10 mg亮抑蛋白酶肽和10 mg 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟溶于水中，定容至2.5 mL，配制蛋白酶抑制剂混合液（200×），分装为100 µL每管，-20 °C保存。
  11. 将5 mL Triton X-100与45 mL水混合，过滤除菌后室温保存，配制10% Triton X-100溶液。
  12. 在微管蛋白纯化当天，通过将20 mL BRB80与1.5 µL 2-巯基乙醇、200 µL 0.1 M PMSF、100 µL蛋白酶抑制剂混合液以及（可选，针对HEK-293细胞）400 µL 10% Triton X-100混合，配制裂解缓冲液（BRB80补充1 mM 2-巯基乙醇、1 mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂混合液，以及可选的0.2% Triton X-100）。
    注意：2-巯基乙醇具有毒性，应在通风橱中操作。
  13. 将1 g GTP溶于9.5 mL水中，用KOH调节pH至7.5，分装为20 µL每管，-20 °C保存。避免反复冻融。
  14. 将60.56 g Tris溶于水中，用HCl调节pH至6.8，定容至500 mL，过滤除菌后室温保存，配制1 M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）溶液。
  15. 向16 mL预热的1 M Tris-HCl（pH 6.8）中加入4 g十二烷基硫酸钠（SDS），轻轻混匀。加入2.6 g二硫苏糖醇（DTT）和20 mL 100%甘油，搅拌至溶液均匀。加入适量溴酚蓝（2.5 mg）以达到所需颜色深度，配制5×Laemmli上样缓冲液（450 mM二硫苏糖醇[DTT]；10%十二烷基硫酸钠[SDS]；400 µM Tris-HCl，pH 6.8；50%甘油；~0.006%溴酚蓝）。分装为5 mL每管，-20 °C保存。使用时用去离子水将5×母液稀释，配制2×工作液。

2. 微管蛋白的扩增与收获来源

注意：本方案中使用了三种微管蛋白来源：（i）以悬浮培养方式培养的细胞（HeLa S3 和 HEK-293）；（ii）以贴壁培养方式培养的细胞（HEK-293、HeLa 和 U2 OS）；（iii）小鼠脑组织。本方案将微管蛋白纯化的当天记为“第 0 天”，其余步骤均相对于第 0 天进行描述。

  1. 细胞扩增
    1. 悬浮培养细胞
      注意：为成功从悬浮培养物中纯化微管蛋白，需使用至少 2 L 的悬浮培养物。
      1. 对于 2 L 悬浮培养物，在制备日前 10 天复苏并培养所需细胞类型，以获得 6 × 107 个细胞。在第 -10 天，将细胞以每皿 107 个细胞的密度接种至六个直径 15 cm 的培养皿中。
      2. 在第 -8 天，将所需量的完全培养基预热至 37 °C。在无菌条件下，向每个旋转瓶中加入 1 L 预热的培养基。将旋转瓶置于细胞培养箱内的搅拌台上，设置转速为 20–25 rpm，并略微打开旋转瓶的侧盖，使培养基与培养箱内的气体环境平衡。
        注意：为避免任何污染，需使用 70% 乙醇彻底清洁培养基瓶和旋转瓶的外表面。
      3. 在第 -7 天，用胰蛋白酶消化并收集生长至 80–90% 汇合度的细胞（约 1.8 × 108 个细胞）。每次从三个培养皿中收集细胞，离心（200 × g，5 分钟，室温），并将所有细胞重悬于 10 mL DMEM 中。
        注意：在此步骤中，细胞的充分解离至关重要，以避免在旋转瓶中形成较大的细胞聚集体，这会影响细胞存活率并导致微管蛋白得率降低。
      4. 将 5 mL 细胞悬液加入每个含有 1 L DMEM 的旋转瓶中，将旋转瓶放回细胞培养箱内的搅拌台上，继续培养一周。
    2. 贴壁培养细胞
      注意：为成功从贴壁细胞中纯化微管蛋白，至少需使用十个生长至 80–90% 汇合度的培养皿。
      1. 在微管蛋白制备日前三天复苏并扩增所需细胞类型，以获得 1 × 108 个细胞。
      2. 在第 -3 天，将这些细胞以每皿 1 × 107 个细胞的密度接种至十个直径 15 cm 的培养皿中，并使其生长至 80–90% 汇合度。
      3. 在第 -1 天，如有需要，可转染细胞以表达微管蛋白修饰酶或特定的微管蛋白异构体。
  2. 收集细胞/脑组织
    1. 悬浮培养细胞
      1. 将旋转瓶中的细胞悬液转移至 1 L 离心管（材料表）中，在 250 × g、15 分钟、室温条件下离心收集细胞。若需立即在旋转瓶中开始另一轮 HeLa S3 细胞培养，则在旋转瓶中保留 100 mL 细胞悬液，并向旋转瓶中加入 1 L 完全预热的 DMEM。
        注意：在进行微管蛋白纯化前，应仔细检查是否存在细菌污染。
      2. 将每个离心管中的细胞沉淀用 10 mL 冰冷 PBS 重悬，并将所有细胞转移至 50 mL 螺口管中。重悬过程中保持细胞处于冰上。在 250 × g、15 分钟、4 °C 条件下离心收集细胞。
        注意：请遵循旋转瓶的清洗与储存建议（见 材料表）。
      3. 弃去上清液，并测定细胞沉淀的体积。从 2 L 悬浮培养物（两个旋转瓶）中，预期可获得 5–6 mL 的细胞沉淀。
        注意：在下文所述的方案中，假设细胞沉淀体积为 10 mL。请根据实际沉淀体积调整实验。
      4. 加入与细胞沉淀等体积（10 mL）的裂解缓冲液，并重悬细胞沉淀。
        注意：细胞沉淀体积与裂解缓冲液体积的比例对成功纯化微管蛋白至关重要。加入过多裂解缓冲液会降低微管蛋白浓度，使其无法达到聚合所需的临界浓度，从而显著降低微管蛋白得率。
        注意：用裂解缓冲液重悬的细胞可在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存两个月。
    2. 贴壁培养细胞
      注意：为成功纯化微管蛋白，贴壁培养细胞必须快速收集（约 15 分钟内完成十个 15 cm 培养皿的收集）。本步骤需三人协作完成。
      1. 倾斜培养皿以去除培养基，然后用 7 mL 室温 PBS-EDTA 轻柔洗涤细胞（操作者 1）。每次仅处理三个 15 cm 培养皿，以避免细胞长时间暴露于无培养基或缓冲液的环境中。
      2. 向细胞中加入 5 mL PBS-EDTA，并在室温下孵育 5 分钟。
      3. 使用细胞刮轻轻将细胞刮至培养皿一侧边缘以脱离（操作者 2），并将所有细胞收集至 50 mL 螺口管中（操作者 3）。用额外 2 mL PBS-EDTA 冲洗每个培养皿，以收集残留细胞。此过程中，盛有细胞悬液的 50 mL 螺口管应始终置于冰上。
      4. 在 250 × g、10 分钟、4 °C 条件下离心收集细胞。弃去上清液，并测定细胞沉淀的体积。从十个 15 cm 培养皿中预期可获得约 1 mL 的细胞沉淀。
        注意：在下文所述的方案中，假设细胞沉淀体积为 10 mL。请根据实际沉淀体积调整实验。
      5. 用与细胞沉淀等体积（10 mL）的裂解缓冲液重悬细胞。
        注意：用裂解缓冲液重悬的细胞可在 -80 °C 保存长达两个月。
    3. 脑组织
      注意：可使用任意年龄、性别或遗传背景的小鼠。转基因小鼠品系的选择取决于拟研究的科学问题。本文中，我们展示了从缺乏主要脑部谷氨酸化酶——微管蛋白酪氨酸连接酶样蛋白 1（TTLL1）的 ttll1-/- 小鼠中纯化微管蛋白的示例31。
      1. 通过颈椎脱位法处死小鼠，迅速断头，并将脑组织收集至圆底管中。若脑组织表面有过多血液，可用裂解缓冲液快速冲洗。小鼠处死后应尽快收集脑组织，因为死后延迟可能影响微管蛋白纯化的成功率。使用圆底管以适应匀浆所用探针的宽度。
        注意：收集的小鼠脑组织可在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存长达 3 年。
      2. 向一只成年小鼠提取的单个脑组织中加入 500 µL 裂解缓冲液。在后续方案中，假设加入的裂解缓冲液体积为 10 mL。请根据所用脑组织数量调整实验条件。

3. 细胞或脑组织的裂解

  1. 悬浮培养的细胞
    1. 对于HEK-293细胞，在冰上使用不同宽度的移液枪头反复吹打裂解细胞。首先，将一个p1000枪头连接至10 mL移液器，每5分钟上下吹打细胞悬液一次，共10分钟（吹打3个循环）。随后，将一个p200枪头套在p1000枪头上，继续每5分钟吹打一次，持续20分钟（吹打5个循环）。
    2. 对于HeLa S3，使用法式高压匀浆器裂解细胞（参见 材料表 （用于设置）。
    3. 取1/100th 裂解液（L）的体积（20 mL L对应200 µL），加入等体积的2×Laemmli缓冲液，煮沸5 min，-20 °C保存以备后续分析。
  2. 贴壁培养的细胞
    1. 将细胞转移至一个高度已缩短的14 mL圆底管中，以适配超声波探头（参见 材料表 设置）。超声处理细胞约45次脉冲，并取少量裂解液在显微镜下观察以确认细胞裂解。
      注意：脉冲次数可能因用于微管蛋白纯化的细胞类型而异。过度超声处理细胞可能导致微管蛋白沉淀，从而对纯化得率产生不利影响。
    2. 每5分钟在冰上用P200枪头将细胞上下吹打一次，共20分钟（吹打5个循环）。
    3. 取1/100th 裂解液（L）的体积（20 mL L对应200 µL），加入等体积的2×Laemmli缓冲液，煮沸5分钟，-20 °C保存以备后续分析。
  3. 脑组织
    1. 使用组织匀浆器裂解脑组织（参见 材料表 （用于设置）。或者，使用微型离心管研杵或等效设备裂解组织，并用带18 G针头的1 mL注射器在冰上反复吹打。
    2. 取1/100th 裂解液（L）的体积（20 mL L对应200 µL），加入等体积的2×Laemmli缓冲液，煮沸5分钟，-20 °C保存以备后续分析。

4. 微管蛋白的纯化

  1. 裂解液澄清
    1. 通过在 150,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟，澄清裂解液（分离裂解混合物中的沉淀和可溶性组分）。有关超速离心机转子和离心管的详细信息，请参见材料表。对于细胞提取物，离心后常会形成一层白色漂浮层。转移上清液时请勿将此漂浮层一同转移，因其会干扰微管蛋白的聚合。使用适当体积的注射器连接一根长的 20 G 或 21 G 针头，轻轻吸取上清液，避免扰动漂浮层。若上清液仍浑浊，可在 5,000 × g、4 °C 条件下再次离心 10 分钟。
    2. 将上清液（SN1）转移至超速离心管，并记录其体积。对于 10 mL 的细胞沉淀，预期 SN1 体积约为 12 mL。
    3. 取 SN1 体积的 1/100th（12 mL SN1 对应 120 µL），加入等体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
    4. 用与 SN1 相同体积的 BRB80 缓冲液（材料表）重悬沉淀（P1）。取 P1 体积的 1/100th（20 mL P1 对应 200 µL），加入等体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
  2. 低离子强度缓冲液中的第一次聚合
    1. 在适当体积的螺旋盖离心管中，将 1 体积 SN1（12 mL）、1/200th 体积的 0.2 M GTP（60 µL；终浓度 1 mM）和 0.5 体积预热的甘油（6 mL）混合，制备聚合反应体系。
      注：在整个方案的聚合步骤中，甘油用作分子拥挤剂，因此在计算其他组分浓度时不予考虑。
    2. 用移液器轻轻吹打混合液，避免产生气泡，并将其转移至适当的超速离心管中。
      注：将混合液转移至离心管时，需对离心管进行配重（成对调整）。这使得实验者可在聚合反应完成后直接进行微管沉降步骤。本方案中所有聚合步骤均需如此操作。
    3. 用 Parafilm 封口膜覆盖离心管，转移至 30 °C 水浴中孵育 20 分钟。
    4. 在 150,000 × g、30 °C 条件下离心 30 分钟。弃去上清液（SN2），保留聚合微管沉淀（P2）。
      注：微管沉淀可速冻并在 -80 °C 下保存长达 1 年。
    5. 取 SN2 体积的 1/200th（18 mL SN2 对应 90 µL），加入等体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
  3. 第一次去聚合
    1. 通过向沉淀 P2 中加入冰浴预冷的 BRB80 缓冲液并在冰上静置 5 分钟，使微管去聚合：对于细胞来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/60th（200 µL）；对于脑组织来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/20th（600 µL）。
      注：在去聚合步骤中加入冰浴预冷 BRB80 的体积始终相对于 SN1 的体积。
    2. 轻轻重悬微管沉淀，避免产生气泡，直至溶液完全均一。使用 p1000 枪头进行数次吹打，随后每 5 分钟使用 p200 枪头吹打一次，持续 20 分钟（共五次吹打循环）。此步骤对微管蛋白纯化成功至关重要。
    3. 将溶液转移至适当的超速离心管中，在 150,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。将上清液（SN3）转移至新的 1.5 mL 超速离心管中。此离心步骤后形成的沉淀（P3）包含沉淀的蛋白质（微管相关蛋白或 MAPs）和未去聚合的微管。上清液（SN3）包含可溶性组分：去聚合的微管蛋白二聚体和已从微管上解离的 MAPs。
    4. 取 1–4 µL SN3，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
    5. 用 BRB80 缓冲液（与 SN3 相同体积）重悬沉淀 P3，取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存。
  4. 第二次聚合（高离子强度缓冲液中）
    1. 在适当体积的离心管中，将 1 体积 SN3（200 µL）、1 体积预热的 1 M PIPES（200 µL，终浓度 0.5 M）、1/100th 体积的 0.2 M GTP（2 µL，终浓度 1 mM）和 1 体积预热的甘油（200 µL）混合，制备聚合反应体系。
    2. 用移液器轻轻吹打混合液，避免产生气泡，并转移至超速离心管中。
    3. 用 Parafilm 封口膜覆盖离心管，转移至 30 °C 水浴中孵育 20 分钟。
    4. 在 150,000 × g、30 °C 条件下离心 30 分钟。弃去上清液（SN4），保留聚合微管沉淀（P4）。沉淀 P4 包含聚合的微管，上清液 SN4 包含未聚合的微管蛋白、MAPs 及其他可溶性蛋白。
      注：第二次聚合步骤后的微管沉淀可速冻并在 -80 °C 下保存长达 1 年。
    5. 取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
  5. 第二次去聚合
    1. 通过向沉淀 P4 中加入冰浴预冷的 BRB80 缓冲液并在冰上静置 5 分钟，使微管去聚合：对于细胞来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/100th（120 µL）；对于脑组织来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/40th（300 µL）。
    2. 每 5 分钟使用 p200 枪头吹打一次，持续 20 分钟（共五次吹打循环）。
    3. 将溶液转移至 1.5 mL 超速离心管中，在 150,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。将上清液（SN5）转移至新的 1.5 mL 超速离心管中。此离心步骤后形成的沉淀（P5）包含未去聚合的微管。上清液（SN5）包含可溶性微管蛋白。
    4. 取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
    5. 用 BRB80 缓冲液（与 SN5 相同体积）重悬沉淀 P5，取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
  6. 第三次聚合（低离子强度缓冲液中）
    1. 在适当体积的离心管中，制备聚合反应体系：1 体积 SN5（120 µL）、1/200th 体积的 0.2 M GTP（0.6 µL，终浓度为 1 mM）和 0.5 体积预热的甘油（60 µL）。
    2. 用移液器轻轻吹打混合液，避免产生气泡，并转移至适当的超速离心管中。
    3. 用 Parafilm 封口膜覆盖离心管，转移至 30 °C 水浴中孵育 20 分钟。
    4. 在 150,000 × g、30 °C 条件下离心 30 分钟。沉淀（P6）包含聚合的微管，上清液 SN6 包含少量未聚合的微管蛋白。
      注：微管沉淀可速冻并在 -80 °C 下保存长达 1 年。
    5. 取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
  7. 第三次去聚合
    1. 通过向沉淀 P6 中加入冰浴预冷的 BRB80 缓冲液并在冰上静置 5 分钟，使微管去聚合：对于细胞来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/100th（120 µL）；对于脑组织来源的微管蛋白，加入 SN1 体积的 1/40th（300 µL）。
    2. 每 5 分钟使用 p200 枪头吹打一次，持续 20 分钟（共五次吹打循环）。
    3. 将溶液转移至适当的超速离心管中，在 150,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。将上清液（SN7）转移至新的 1.5 mL 超速离心管中。沉淀（P7）包含少量未去聚合的微管。上清液（SN7）仅包含去聚合的微管（可溶性微管蛋白）。
    4. 取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
    5. 用 BRB80 缓冲液（与 SN7 相同体积）重悬沉淀 P7，取 1–4 µL，加入 9 倍体积的 2× Laemmli 缓冲液，煮沸 5 分钟，-20 °C 保存以备后续分析。
    6. 定量微管蛋白含量（参见代表性结果），将 SN7 分装为小体积，速冻后于 -80 °C 保存。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法的主要目标是生产出高质量、具备组装能力的微管蛋白，其产量足以使用纯化组分重复进行体外实验。由该微管蛋白组装而成的微管可用于基于全内反射荧光（TIRF）显微镜技术的重建实验，适用于动态或稳定的微管；也可用于检测微管动力学、微管相关蛋白（MAPs）或分子马达的相互作用，以及分子马达产生的力25。此外，这些微管还可用于微管-MAP共沉淀实验和固态核磁共振波谱分析28。

在整个纯化过程中，可通过考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶监测微管蛋白的富集程度和纯度，建议使用“TUB” SDS-PAGE凝胶，该凝胶可将α-和β-微管蛋白分离，而这两者在传统凝胶中会共迁移为单一蛋白条带32。在不同纯化步骤中收集的裂解液（最后一步去聚合除外，见实验方案）应以相近的量上样，以评估微管蛋白纯化的效果（图2A）24。最终获得的微管蛋...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述方法提供了一个平台，可从细胞系和单个小鼠脑组织中快速制备中等到较大量、具有组装能力的高质量微管蛋白。该方法基于多年来在该领域广泛使用的牛脑微管蛋白纯化金标准方案16,17。该方法的一个显著优势是采用HeLa S3细胞的悬浮培养体系，一旦建立，可在较少人工操作的情况下获得大量细胞。这使得该方案在任何细胞生物学实验室中都相对容易实施；而其他微管蛋白纯化方法18,19,32,37则需要特定设备和技术专长，因此主要由具备较强蛋白质纯化背景的实验室使用。当从贴壁细胞系制备较少量微管蛋白时，可使用多种不同的细胞系。我们已成功从HeLa、U-2 OS和HEK-293细胞中纯化出微管蛋白。若需进行更大规模的纯化，可将收获的细胞或脑组织在裂解缓冲液中速冻，并于-80 °C保存，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由 ANR-10-IDEX-0001-02、LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 以及 Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 资助。CJ 得到居里研究所、法国国家科研署（ANR）项目 ANR-12-BSV2-0007 和 ANR-17-CE13-0021、法国国家癌症研究院（INCA）资助 2014-PL BIO-11-ICR-1 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 DEQ20170336756 的支持。MMM 得到战胜阿尔茨海默病基金会（Fondation Vaincre Alzheimer）资助 FR-16055p 以及法国阿尔茨海默病基金会（France Alzheimer）资助 AAP SM 2019 n°2023 的支持。JAS 得到欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 675737 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201904008210 的支持。SB 得到法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201805005465 的支持。

我们感谢 Janke 实验室的所有成员，特别是 J. Souphron，以及 G. Lakisic（Institut MICALIS，AgroParisTech）和 A. Gautreau（Ecole Polytechnique）在本实验方案建立过程中提供的帮助。我们还要感谢居里研究所动物实验中心在小鼠繁育与饲养方面给予的支持。

抗体12G10由J. Frankel和M. Nelson研制，购自美国国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助建立、由爱荷华大学维护的发育研究杂交瘤库。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M MgCl₂ Sigma#M1028
1-L 细胞培养容器Techne F7610 用于悬浮培养。切勿搅拌空的悬浮瓶。当悬浮瓶置于细胞培养孵箱中时，应始终保持悬浮瓶的侧向阀门略微打开，以促进培养基与孵箱环境的气体平衡。’s 大气环境。使用后应立即用自来水注满旋转瓶，以防止残留细胞在瓶壁上干燥。用去离子水清洗瓶子，加入约 200 ml 去离子水后进行高压灭菌。在无菌细胞培养罩内去除水分，并在罩内静置数小时，使瓶子完全干燥。切勿使用洗涤剂清洗旋转瓶，因为任何残留的微量洗涤剂都可能对细胞产生有害影响。
1.5 ml 和 2 ml 离心管
14 毫升圆底管
直径15厘米的无菌培养皿
15 ml 螺口管
2-巯基乙醇 Sigma #M31482-巯基乙醇具有毒性，应在通风橱中使用。
4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟 Sigma #A8456
40% 丙烯酰胺 Bio-Rad #161-0140
5、10、20 ml 注射器
5 ml、10 ml、25 ml 无菌移液管
50 ml 螺口管
过硫酸铵（APS）Sigma#A3678
抗α-微管蛋白抗体，12G10 由 J. Frankel 和 M. Nelson 开发，源自美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）支持建立的发育研究杂交瘤库，并由爱荷华大学维护稀释比例：1/500
抗谷氨酸化微管蛋白抗体，GT335 AdipoGen #AG-20B-0020稀释比例：1/20,000
抑肽酶 Sigma #A1153
天平（0.1 – 10 g
Beckman 1 L 聚丙烯瓶 用于收集悬浮培养物
Beckman Avanti J-26 XP 离心机用于收集悬浮培养物
生物搅拌器 Techne MCS-104L 安装于细胞培养孵育箱中（用于悬浮培养），Hela S3 和 HEK 293 细胞转速为 25 rpm
双N，N’-甲叉双丙烯酰胺 伯乐（Bio-Rad） #161-0201
IKA Ultra-Turrax 匀浆器® 使用5-mm探头（仪器功率设为6或7）在冰上匀浆脑组织，每次15秒，重复2-3次。
牛血清白蛋白（BSA）Sigma #A7906
溴酚蓝 Sigma #1.08122
羧肽酶A（CPA）Sigma#C9268浓度：1.7 U/µl
细胞培养罩
37℃细胞培养箱°C，5% CO2
二甲基亚砜（DMSO） Sigma #D8418DMSO 可增强其他化合物的细胞和皮肤通透性。避免接触，并使用皮肤和眼部防护装备。
DMEM 培养基 Life Technologies #41965062
DTT，DL-二硫苏糖醇 Sigma #D9779
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma #E3889
乙醇，绝对 Fisher Chemical #E/0650DF/15
胎牛血清（FBS）Sigma #F7524
法国压力细胞压碎机 赛默飞世尔科技公司 #FA-078A使用#FA-032细胞破碎仪处理大量细胞。设定为中等比例，表压为1,000 psi（相当于破碎室内部压力3,000 psi）。
甘油 VWR Chemicals #24388.295
甘氨酸Sigma#G8898
GTP Sigma #G8877
加热块 Stuart #SBH130D
Hela细胞 ATCC® CCL-2™
Hela S3 细胞 ATCCATCC® CCL-2.2™
盐酸（HCl）VWR#20252.290
倒置显微镜 通过荧光检测以验证细胞转染是否成功
异丙醇 VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
JLA-8.1000 转子 用于收集悬浮培养物
KOH Sigma #P1767KOH 具有腐蚀性，可引起灼伤；使用时需佩戴眼部和皮肤防护装备。
L-谷氨酰胺 Life Technologies #25030123
用于50 ml离心管的实验室离心机Sigma4-16 K 
亮抑蛋白酶肽 Sigma#L2884
液氮 
微量移液器 p2.5、p10、p20、p100、p200 和 p1000 及相应的吸头
微型研磨棒Eppendorf#0030 120.973
小鼠脑组织 本研究的动物饲养与使用均遵循欧洲共同体（2010/63/UE）的建议。实验程序已由居里研究所伦理委员会 CEEA-IC #118（国家主管部门授予编号 04395.03 的许可）特别批准，符合国际指导原则。
18G X 1 针头 ½” (1.2 × 38 mmTerumo#18G
20G X 1 针头 ½” (0.9 × 38 mmTerumo#20G
21G × 4 针头 ¾” (0.8 × 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Life Technologies #14190169
青霉素-链霉素 Life Technologies #15140130
pH计
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma #P7626PMSF 粉末具有危险性。配制 PMSF 溶液时应使用皮肤和眼睛防护装备。
PIPES Sigma #P6757
移液器助吸器
转子Beckman 70.1 Ti；TLA-100.3；和 TLA 55
SDS-PAGE电泳设备 伯乐（Bio-Rad） #1658001FC
SDS，十二烷基硫酸钠 VWR #442444H用于制备Laemmli缓冲液 
SDS，十二烷基硫酸钠 Sigma #L5750用于制备“TUB”SDS-PAGE凝胶
超声波破碎仪 布拉森#101-148-070用于裂解贴壁培养的细胞。使用直径为6.5 mm的探头，将超声波破碎仪设定为 “输出控制” 1, “占空比” 10% 及时间取决于所使用的细胞类型。
用于1.5 ml离心管的台式离心机Eppendorf5417R 
TEMED，N，N，N′，N′四甲基乙二胺 Sigma#9281
曲古抑菌素 A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma #T9284
Trizma碱（Tris）Sigma #T1503
胰蛋白酶 Life Technologies#15090046
超速离心机转子 TLA-55、TLA-100.3 和 70.1 Ti 转子设为4°C 或 30°根据实验需求 
超速离心管 贝克曼#357448 用于与 TLA-55 转子配合使用
超速离心管 贝克曼#349622用于与 TLA-100.3 转子配合使用
超速离心管 贝克曼#355631 用于 70.1 Ti 转子
超速离心机贝克曼Optima L80-XP（或同等型号）和 Optima MAX-XP（或同等型号）设为4°C 或 30°根据实验需求而定 
涡旋混合器
配备浮架或试管架的水浴锅设定为30°C 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18(2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705(2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

SDS PAGE

相关文章