基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

摘要

本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。

摘要

近十年来，对人类脑组织的蛋白质组学分析极大地增进了我们对大脑的理解。然而，与脑相关的疾病仍然是全球死亡的重要原因，迫切需要更深入地了解其发病生物学机制。传统的基于抗体的技术，如蛋白质印迹（western blotting）或免疫组织化学，存在通量低、劳动强度大以及仅为定性或半定量的局限性。即使是传统的基于质谱的鸟枪法（shotgun）分析方法，也往往无法提供支持特定假设的明确证据。靶向蛋白质组学方法在很大程度上由假设驱动，不同于长期使用的传统鸟枪法蛋白质组学方法。多反应监测（multiple reaction monitoring）即是一种此类靶向方法，其需要使用一种特殊的质谱仪，称为串联四极杆质谱仪或三重四极杆质谱仪。在本研究中，我们系统地阐述了利用人类脑组织成功实施基于串联四极杆质谱仪的蛋白质组学工作流程所涉及的主要步骤，旨在将该工作流程介绍给更广泛的研究群体。

引言

在过去十年中，质谱技术（MS）的快速发展，结合对色谱技术理解的不断深入，极大地推动了基于质谱的蛋白质组学的进步。基于分子生物学的技术，如蛋白质印迹（western blotting）和免疫组织化学，长期以来存在可重复性差、周转时间长、观察者间变异大以及无法准确量化蛋白质等诸多问题。在此背景下，高通量蛋白质组学方法所具备的更高灵敏度，持续为分子生物学家提供了更可靠、更有效的替代工具，助力他们更深入地理解蛋白质在细胞中的功能。然而，鸟枪法蛋白质组学方法（数据依赖性采集，DDA）在检测复杂组织中低丰度蛋白质方面常常存在局限，且高度依赖仪器的灵敏度和分辨率。近年来，全球各地的实验室正在开发诸如数据非依赖性采集（DIA）等新技术，这些技术需要更强的计算能力和能够处理高度复杂数据集的可靠软件支持。然而，这些技术仍处于发展完善阶段，且使用不够便捷。基于质谱的靶向蛋白质组学方法则在质谱技术的高通量特性与ELISA等分子生物学方法的高灵敏度之间实现了理想平衡。靶向质谱蛋白质组学实验聚焦于检测来自发现型鸟枪法蛋白质组学实验或现有文献中提出的假说驱动型蛋白质或肽段^1，2。多反应监测（MRM）即为一种此类靶向质谱方法，其利用串联四极杆质谱仪，从复杂样品中实现对蛋白质/肽段的精确定性和定量。尽管该方法使用的是低分辨率仪器，但仍能提供更高的灵敏度和特异性。

四极杆由4根平行的杆组成，每根....

方案

本研究涉及人类参与者的脑组织样本，已通过TMH和IITB伦理审查委员会（IITB-IEC/2018/019）的审查和批准。参与者已提供知情并签署书面同意书，自愿参加本研究。

1 从脑组织中提取蛋白质

1. 称取约 50 mg 脑组织，使用移液器加入 300 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。
   注意：此步骤旨在去除组织表面的血液，必要时需重复操作。应尽可能去除组织中的血液，因其会干扰后续的蛋白质定量与处理。
2. 用 PBS 清洗后，在含有组织的离心管中加入 300 µL 裂解缓冲液（缓冲液 A）。缓冲液 A 包含 8 M 尿素、50 mM Tris（pH 8.0）、75 mM NaCl、1 mM MgCl₂ 以及蛋白酶抑制剂混合物（按制造商说明添加）。
   注意：蛋白得率受多种因素影响，包括样本储存条件、起始材料量以及处理过程中的操作效率。当组织量少于 50 mg 时，应按比例减少缓冲液 A 的体积。
3. 将离心管置于冰浴中，使用探头式超声破碎仪裂解组织。超声参数设置如下：振幅 40%，工作 5 秒，间歇 5 秒，总时长 2 分 30 秒。
4. 继续使用珠磨均质器进行组织匀浆，以实现组织的完全裂解。
   注意：此步骤应在中等速度下运行 90 秒，随后在冰上孵育 3–5 分钟。
5. 将管内液体在 4 °C 条件下以 6,00....

结果

我们对来自两组脑部异常患者（每组5个样本）的10个样本中的3种蛋白质进行了相对定量分析。这些蛋白质包括载脂蛋白A-I（APOA-I）、波形蛋白（VIM）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT），已知它们在脑细胞中发挥多种功能。数据的运行后分析使用Skyline-daily（版本20.2.1.286）完成。共监测了对应于3种蛋白质的10个肽段，其中包括APOA-I的3个肽段、VIM的4个肽段以及NAMPT的3个肽段。这10个肽段产生的总转换数为57。样本根据其所属的病理状态被分为两组。利用Skyline软件中的组间比较功能，对这些肽段的峰强度进行了比较，并计算出相对定量值（图3）。

讨论

多年来，免疫组织化学和蛋白质印迹等技术一直被视为验证蛋白质靶标的金标准。 尽管这些方法至今仍在使用，但其实验流程仅经过细微修改，且对技术依赖性较低，导致操作极为繁琐和耗时。此外，这些方法还需使用价格昂贵的抗体，而这些抗体在不同批次之间并不总能保持相同的特异性，且实验过程需要大量的专业技术经验。另外，利用质谱等高通量技术鉴定出的蛋白质中，仅有很小一部分有可用的匹配抗体，这进一步加剧了整个验证过程的复杂性。因此，靶向蛋白质组学检测正逐渐被采纳为验证靶标的新策略¹⁰。随着大多数靶标发现工作在高通量组学平台上进行，一组经过验证的靶标也正被考虑用于临床筛查应用^11,12,13。

本文的代表性结果验证了载脂蛋白A-I（Apolipoprotein A-I, APOA-I）、波形蛋白（Vimentin, VIM）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinam.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
乙腈（质谱级）	Fisher Scientific	A/0620/21
牛血清白蛋白	HiMedia	TC194-25G
氯化钙	Fischer Scienific	BP510-500
甲酸（质谱级）	Fisher Scientific	147930250
碘乙酰胺	Sigma	1149-25G
异丙醇（质谱级）	Fisher Scientific	Q13827
氯化镁	Fischer Scienific	BP214-500
甲醇（质谱级）	Fisher Scientific	A456-4
质谱级水	Pierce	51140
磷酸盐缓冲液	HiMedia	TL1006-500ML
蛋白酶抑制剂混合物	Roche Diagnostics	11873580001
氯化钠	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris碱	Merck	648310
胰蛋白酶（质谱级）	Pierce	90058
尿素	Merck	MB1D691237
耗材
Hypersil Gold C18色谱柱	Thermo	25002-102130
微量移液器	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
氧化锆/二氧化硅珠	BioSpec products	11079110z
仪器
珠磨仪（均质器）	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
酶标仪（分光光度计）	Thermo	MultiSkan Go
pH计	Eutech	CyberScan pH 510
探头式超声破碎仪	Sonics Materials, Inc	VCX 130
振荡干浴器	Thermo	88880028
TSQ Altis质谱仪	Thermo	TSQ02-10002
超高效液相色谱仪 - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
真空浓缩仪	Thermo	Savant ISS 110