本实验方案的目的是通过人工膜饲喂器向埃及伊蚊（Aedes aegypti）提供动物来源及人工配制的血液餐，并精确量化其摄入的餐液体积。
方法文章
动物源性血液及人工饲料的喂食与定量方法 埃及伊蚊 蚊子
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
某些蚊种的雌蚊在叮咬脊椎动物宿主以获取富含蛋白质的血液用于卵子发育时，可能会传播疾病。在实验室中，研究人员可通过膜饲喂器向蚊子提供动物来源或人工配制的血液餐，从而调控餐液的成分。本文介绍了对埃及伊蚊（Aedes aegypti）进行血液和人工血液饲喂，并定量测定单只雌蚊摄食体积的方法。
靶向饲喂并定量人工或血液餐具有广泛的应用，包括测试餐中成分对蚊虫行为和生理的影响、无需注射即可递送药理学化合物，以及用特定病原体感染蚊虫。在饲喂前向餐中添加荧光素染料，可实现后续对摄食量的定量。蚊虫摄入的餐液体积可通过称重法测定（若雌蚊后续需用于行为学实验），也可通过将单只雌蚊在96孔板中匀浆后使用酶标仪检测荧光强度作为终点法进行测定。餐食摄入量的精确量化可用于判断改变餐液成分是否影响蚊虫摄食体积，或不同蚊株之间的摄食量是否存在差异。精确的餐量测定对于下游实验至关重要，例如评估对宿主趋向性或生殖力影响的实验。本文所述方法还可进一步拓展，用于追踪数天内餐食的消化过程，或在不同餐食（如花蜜和血液）中加入多种可区分的标记物，以定量单只蚊虫对每种餐食的摄取情况。
这些方法使研究人员能够独立进行高通量测量，以比较数百只个体蚊虫所摄取的餐血量。因此，这些工具将广泛适用于蚊虫研究领域的科研人员，以回答多种多样的生物学问题。
引言
我们介绍一种使用人工膜饲喂器为埃及伊蚊（Aedes aegypti）提供改良血液餐并精确测量每只蚊虫摄取餐液体积的实验方案。该方案可灵活调整，以改变餐液成分，或比较不同实验组蚊虫摄取的餐液体积。
Ae. aegypti 蚊子通过传播引起黄热病、登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒等疾病的病原体，对全球公共卫生构成威胁1,2,3,4,5。Ae. aegypti 雌蚊必须吸食血液才能生存；它们需要摄取脊椎动物的血液以获得卵子发育所必需的蛋白质，而每批卵的产生都需要至少从一个宿主身上获取一次完整的血液餐6,7,8。雌蚊首先用其口针刺破宿主皮肤并注入唾液，从而完成叮咬，唾液中的化合物会引发宿主的免疫反应9。随后，它通过口针将血液抽吸至中肠进行吸血。当从受感染的宿主身上吸食血液时，雌蚊可能摄入随血液传播的病原体6,8，这些病原体随后会从蚊子的中肠迁移至其唾液腺10。以这种方式感染的雌蚊在叮咬后续宿主时，可将病原体随唾液一同注入，从而传播疾病11,12。了解并量化吸血行为的机制，是控制蚊媒疾病传播的关键步骤。
许多蚊虫饲养和实验的实验室方案使用活体动物（包括小鼠、豚鼠或人类）作为血液来源13,14,15,16。使用活体动物会引发伦理问题，同时还对人员培训、动物饲养与护理以及遵守机构动物护理和使用委员会（IACUC）政策等方面提出复杂要求。此外，这种方法也限制了可递送至蚊虫的化合物类型，从而制约了可开展的研究范围17。
人工饲血装置通常采用膜系统来模拟宿主皮肤，是研究吸血行为的有用工具，可避免饲养活体宿主的需要。全血可从多家供应商购买，并通过加热水套式人工膜饲喂器或类似设备喂给蚊子18,19。在本方案中，我们演示使用一种称为“Glytube”的小型一次性膜饲喂器。该膜饲喂器由Costa-da-Silva等人（2013）先前发表20，可利用标准实验室设备轻松组装，非常适合为中等数量的蚊子提供血液餐，并易于扩大规模以测试更大群体或多种餐液配方。Glytube是一种经济高效的替代方案，相较于其他商业人工饲喂器，它所需餐液体积更小，而后者通常适用于对大量蚊子群体使用单一餐液配方进行批量饲喂21。
本实验方案包含两个部分：人工饲料的制备与投喂，以及摄食量的定量分析。在第一部分中，采用Glytubes作为高效递送经调控饮食的方法。可使用完全人工饲料替代全血，以比较不同血液替代物在取代血液餐时的效果。本文提供了一种改编自Kogan（1990）22的配方，尽管目前已开发出多种人工饲料配方23,24。此外，与注射相比，饲喂是一种侵入性更小且更省力的给药方式。由于每餐所需总体积较小（1–2 mL），本方案提供了一种具有吸引力的递送方法，可减少昂贵试剂的使用量。Ae. aegypti雌蚊能够 readily摄食含有腺苷5′-三磷酸（ATP）的无蛋白盐溶液25,26，这为测量单个饲料成分的作用提供了基线。例如，已知Ae. aegypti中的神经肽Y样受体7（NPYLR7）在摄入富含蛋白质的血液餐后可介导宿主搜寻行为的抑制；当将NPYLR7激动剂添加至无蛋白盐溶液餐中时，雌蚊表现出与摄食全血个体相似的宿主搜寻抑制现象7。
在第二部分中，介绍了定量测定单只雌性蚊虫摄食每餐体积的步骤。该检测方法基于荧光信号，能够比仅通过肉眼观察腹部膨胀程度将雌蚊简单分类为“已吸血”或“未吸血”的传统方法提供更高分辨率的摄食状态信息。在喂食前向餐液中添加荧光素，随后将每只蚊虫在96孔板中匀浆，并通过检测荧光强度来定量个体摄入的餐液体积。该方法可用于评估不同因素（如餐液成分或蚊虫遗传背景）对摄食强度的影响。对于中等大小的餐量，精确量化尤为重要，例如当雌蚊摄食含有摄食抑制剂的非理想餐液，或摄取体积不一的蔗糖餐时27。若在测定餐量后需保留已吸血蚊虫用于后续行为学实验，可改为通过称量麻醉后的雌蚊群体重量，估算个体平均增重来推算餐量。尽管该方法在精度上不如荧光素标记法，但称重法仍可提供餐量的总体估计值，并可用于研究餐量对后续生理过程（如繁殖力或对宿主的后续趋性）的影响。尽管血液餐量存在个体差异，并受多种因素影响11,28,29，但使用本文所述方法测得的摄入餐量与以往研究中的定量结果一致7,30,31。
方案
未使用活体动物或人类宿主进行吸血操作，且遵守洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）及机构审查委员会（IRB）制定的指南。
1. 餐食制备
- 促摄食剂三磷酸腺苷（adenosine 5′-triphosphate）的制备
- 配制25 mM的NaHCO3水溶液（分子量，MW = 84.006 g/mol）。配制100 mL的25 mM NaHCO3溶液时，称取210 mg NaHCO3加入容量瓶中，用双蒸水（ddH2O）定容至100 mL总体积。使用磁力搅拌子充分搅拌，直至NaHCO3完全溶解。
- 将ATP二钠盐水合物（MW = 551.14 g/mol）用25 mM NaHCO3水溶液重悬，配制成终浓度为200 mM ATP的溶液。配制10 mL含25 mM NaHCO3缓冲液的200 mM ATP溶液时，称取1.1 g ATP二钠盐水合物加入容量瓶中，用25 mM NaHCO3缓冲液定容至10 mL总体积。使用磁力搅拌子充分搅拌，直至ATP完全溶解。
注意：为减少ATP水解，必须使用如NaHCO3等盐溶液进行缓冲。 - 将ATP溶液分装后于-20 °C保存。
注意：该ATP储备液通常每六个月新鲜配制一次，用于下述所有餐液的制备。为防止降解，ATP分装液应避免反复冻融，也不应与其他餐液成分一同加热。
- 荧光示踪剂溶液荧光素（fluorescein）的制备
- 配制2%（w/v）的荧光素水储备液。配制10 mL储备液时，在室温下将0.2 g荧光素二钠盐溶于10 mL双蒸水（ddH2O）中，置于15 mL锥形管内，并用铝箔包裹避光。该荧光素储备液可用于下述所有餐液的稀释。
注意：由于荧光素对光敏感，应使用铝箔包裹容器以避免光照。
- 配制2%（w/v）的荧光素水储备液。配制10 mL储备液时，在室温下将0.2 g荧光素二钠盐溶于10 mL双蒸水（ddH2O）中，置于15 mL锥形管内，并用铝箔包裹避光。该荧光素储备液可用于下述所有餐液的稀释。
- 动物来源血液餐液的制备
- 计算喂养全部蚊虫所需的餐液数量；每个Glytube可容纳2 mL餐液，约可喂养25只蚊虫。额外准备一份餐液用于荧光读数标准曲线的校准。除非另有说明，本节中所有步骤均描述制备一份终体积为2 mL餐液所需的试剂用量。
- 对于动物来源血液餐液，将1.98–2 mL去纤维羊血转移至15 mL锥形管中（所需血量见步骤3.3）。
注意：可使用市售的去纤维脊椎动物血液，包括羊、豚鼠或人血13。使用前应确认所购血液未过期，并通过反复倒置瓶身充分混匀，尤其当血液成分出现明显分层时。 - 为获得最佳摄食效果，在羊血于水浴中预热至45 °C后，加入ATP至终浓度为1–2 mM。若终浓度为1 mM ATP，则向1.99 mL预热血液中加入10 μL的200 mM ATP储备液并混匀；若终浓度为2 mM ATP，则向1.98 mL预热血液中加入20 μL的200 mM ATP储备液并混匀。若不添加ATP，则仅将2 mL去纤维羊血预热即可。
- 若后续需基于荧光法定量餐液摄入量，应加入荧光素溶液至终浓度为0.002%（在2 mL总餐液体积中加入2 μL的2%荧光素储备液）。同时相应减少等体积的血液量。保留1 mL含0.002%荧光素的最终餐液用于构建参考标准曲线。该保留样本应与供给蚊虫的餐液处理方式完全一致，在整个实验过程中暴露于相同的光照和温度条件下，并在实验结束后与供餐样本一同冷冻保存。
- 人工血液餐液的制备
- 计算喂养全部蚊虫所需的餐液数量；每个Glytube可容纳2 mL餐液，约可喂养25只蚊虫。额外准备一份餐液用于荧光读数标准曲线的校准。除非另有说明，本节中所有步骤均描述制备一份2 mL餐液所需的试剂用量。
- 配制人工血液（参照Kogan（1990）22方法修改），如表1所示，首先配制400 mM NaHCO3储备液。配制10 mL的400 mM NaHCO3溶液（MW = 84.006 g/mol）时，称取336 mg NaHCO3加入容量瓶中，用双蒸水（ddH2O）定容至10 mL总体积。使用磁力搅拌子充分搅拌，直至NaHCO3完全溶解。
- 对于人工血液中的蛋白组分，分别配制以下储备液：在400 mM NaHCO3中配制50 mg/mL的γ-球蛋白溶液，在ddH2O中配制35 mg/mL的血红蛋白溶液，以及在ddH2O中配制300 mg/mL的白蛋白溶液。蛋白储备液可在4 °C保存最多2个月。人工血液中总人源蛋白的终浓度为125 mg/mL，其中包括15 mg/mL γ-球蛋白、8 mg/mL血红蛋白和102 mg/mL白蛋白。
- 每份2 mL餐液中，从表1所列储备液中取600 µL γ-球蛋白、460 µL血红蛋白、680 µL白蛋白和250 µL ddH2O混合。待餐液在水浴中预热至45 °C后、喂食前立即加入10 µL的200 mM ATP储备液。
- 若后续需基于荧光法定量餐液摄入量，应加入荧光素溶液至终浓度为0.002%（在2 mL总餐液体积中加入2 μL的2%荧光素储备液）。同时在步骤4.4中相应减少等体积的ddH2O。保留至少1 mL含0.002%荧光素的最终餐液用于构建参考标准曲线。该保留样本应与供给蚊虫的餐液处理方式完全一致，在整个实验过程中暴露于相同的光照和温度条件下，并在实验结束后与供餐样本一同冷冻保存。
- 示例性无蛋白盐溶液餐液的制备（参照Duvall等（2019）7方法修改）
注意：无蛋白盐溶液餐液可通过多种方式制备7,27,32。此处提供的盐溶液餐液为上述人工血液配方的无蛋白版本。- 计算喂养全部蚊虫所需的餐液数量；每个Glytube可容纳2 mL餐液，约可喂养25只蚊虫。额外准备一份餐液用于荧光测量标准曲线的校准。除非另有说明，本节中所有步骤均描述制备一份2 mL餐液所需的试剂用量。
- 配制盐溶液餐液时，先配制400 mM NaHCO3储备液。配制10 mL的400 mM NaHCO3溶液（MW = 84.006 g/mol）时，称取336 mg NaHCO3加入容量瓶中，用ddH2O定容至10 mL总体积。使用磁力搅拌子充分搅拌，直至NaHCO3完全溶解。
- 每份2 mL餐液中，在15 mL锥形管中混合600 µL的400 mM NaHCO3溶液与1.39 mL的ddH2O。待餐液在水浴中预热至45 °C后，再加入10 µL的200 mM ATP储备液。
- 若后续需基于荧光法定量餐液摄入量，应加入荧光素溶液至终浓度为0.002%（在2 mL总餐液体积中加入2 μL的2%荧光素储备液）。同时在步骤5.3中相应减少等体积的ddH2O。保留至少1 mL含0.002%荧光素的最终餐液用于构建参考标准曲线。该保留样本应与供给蚊虫的餐液处理方式完全一致，在整个实验过程中暴露于相同的光照和温度条件下，并在实验结束后与供餐样本一同冷冻保存。
2. 向蚊虫递送餐食
- 设置蚊虫饲养容器以进行喂养
注意：只要满足以下条件，蚊子可在多种容器中进行饲喂。确保容器大小足以让蚊子自由飞行，但又不能过大，以免蚊子难以找到网面并开始吸血。覆盖容器的网纱材质和孔径可有所不同，但网孔必须足够大，以便雌蚊的口针能够刺穿，同时又不能过大而导致蚊子逃逸。应将网纱牢固固定，使其绷紧，从而在整个饲喂期间确保 Glytube 能稳定地放置在其表面。- 一个示例容器（图1) 是一个经过改装的 946 mL（32 oz）高密度聚乙烯（HDPE）塑料桶。为复制此装置，使用剃刀片在桶盖中央切割一个直径约 10 cm 的孔。为组装供蚊虫栖息的容器，固定一块约 400 cm2 将一块方形白色0.8 mm聚酯蚊帐布放在桶顶，然后牢固地将带孔盖子压在上面，使其紧密扣合。
- 收集羽化后至少3天的雌蚊，以确保其发育成熟，能够吸血。最佳吸血率通常在羽化后7天观察到。33.
- 将雌性蚊子放入容器中，并用网罩盖住。若容器中蚊子密度较高，应增加使用的 Glytube 数量。每根 Glytube 对应约 25 只蚊子时可达到最佳饲喂效果，以减少蚊子对饲喂膜接触机会的竞争。
- 留出一组未进食的蚊虫作为对照组，不提供血餐。在体重测量实验流程中，将未进食组单独称重，并利用该重量估算实验组蚊虫进食后的体重增加量。在基于荧光的定量实验流程中，将未进食的蚊虫加入标准曲线计算所需的孔中，同时作为阴性对照。为匹配实验组蚊虫组织的自发荧光背景，确保标准曲线和阴性对照孔中均含有未进食的蚊虫。
- 构建并设置Glytube（改编自Costa-da-Silva等，2013）20)
- 如图所示 图1，为产生热源，取一个50 mL锥形管，加入40 mL 100%甘油。用一块5 cm × 5 cm的封口膜密封管口，并再覆盖一层5 cm × 5 cm的封口膜，以尽量减少泄漏风险。可选择使用橡皮筋固定封口膜。倒置锥形管，确认无孔洞或缝隙。
- 制作餐食递送装置时，使用锋利的剃须刀片在锥形管螺口盖中心切割一个直径为2.5 cm的孔；若需更高的均一性，可使用车床加工。将一块5 cm × 5 cm的封口膜均匀拉伸至约两倍大小，使其足够薄，以便蚊虫易于刺穿，同时确保无泄漏。将拉伸后的封口膜平整地密封在螺口盖外表面，完全覆盖孔洞，随后将盖子放置一旁备用。
注意：为了增强蚊子对Glytube的趋向性，在拉伸Parafilm膜之前，建议用未涂抹化妆品的人体皮肤轻轻擦拭膜表面，使其带有体味，注意避免产生孔洞。若实验目的并非研究蚊子接近餐食所需的感觉线索，则推荐采用此步骤。 - 将密封的甘油管和反应混合物（除ATP外的所有组分）置于42–45 °C水浴中加热至少15分钟。ATP不得预先加热，应在实验开始前立即加入。
- 向温热的餐液中加入ATP，充分涡旋混匀。用移液器吸取2 mL温热餐液加入螺口盖的内腔中，轻轻将装有甘油、已预热并倒置的50 mL锥形管放入其中。将装有餐液的螺口盖部分旋紧在装有甘油的锥形管上，旋紧程度以足以防止餐液或甘油泄漏为准。
注意：餐食体积可在1 mL至2.5 mL之间调整。当餐食用于递送稀有或昂贵化合物时，较低体积可能尤为适用。此步骤需快速操作，以避免餐食冷却至室温，从而降低充分摄食的可能性。冷却速率取决于操作环境的室温，但在25 °C条件下通常应在5分钟内完成。 - 将组装好的Glytube置于蚊虫容器上方，让蚊虫至少取食15分钟，以达到最大取食率。
- 为实现最佳喂养，将蚊子容器置于配备有 CO₂ 的密闭室中2 垫片，并在提供食物前于25–28 °C和70–80%湿度条件下至少适应15分钟。本实验所用的检测室是对先前发表的装置进行简单且低成本改造而成。16使用一个可拆卸盖子的半透明聚丙烯储存箱，尺寸为长36 cm × 宽31 cm × 高32 cm。在箱体侧壁上开有一个直径1.5 cm的孔，用于通入CO₂2 通过硅胶管输送。CO2 在盖子内侧中心固定扩散垫，用于输送纯净空气和CO2 在试验期间调节培养室的气体环境。
注意：确保宿主线索（热量和 CO₂）2，可选宿主气味16存在以吸引蚊虫至膜饲器。如果蚊虫未聚集在Glytube下方，请检查CO₂是否正常供应。2 正确输送，并确保餐食和Glytube足够温暖。如果使用外部CO2 来源不可用，CO2 可通过呼出的人类 breath 的 puff 递送。 - 进食后，Glytube 帽可作为生物危害废物丢弃，或在低浓度次氯酸钠溶液中浸泡并用清水彻底冲洗后重复使用。
3. 摄入餐次的定量分析
- 称量用于后续实验的蚊虫
注意：通过称量蚊虫体重来量化血餐量可使其继续用于后续活体实验，但该方法需对5只蚊虫组成的群体进行称重。由于使用大多数实验室天平难以精确测量单只蚊虫的体重，因此通过称重难以准确评估个体间血餐量的差异。该方法仅建议用于雌蚊明显吸血饱食的情况。- 将蚊子的容器移至4 °C的冷室或置于冰上以进行低温麻醉。
- 称重未进食组的5只雌蚊为一组（即从未提供血餐的蚊虫），计算其平均重量，作为“吸血前”体重的估计值。未进食雌蚊的平均体重取决于基因型、性别和饲养条件。未进食的雌蚊 埃及伊蚊 与……共同饲养的蚊子 随意摄取 每块可接触蔗糖的样本通常重约2 mg。
- 根据实验队列（即提供血餐的蚊虫），通过肉眼观察腹部是否膨胀，将雌蚊分为“已吸血”和“未吸血”两组7将“已喂食”和“未喂食”两组蚊虫分别按每5只一组进行分组，用于称重。每组5只蚊虫应来自同一实验批次，以进行群体重量测量。计算实验组中“已喂食”和“未喂食”两组每只雌蚊的平均体重。
- 终点分析的荧光检测7,27,34
注意：若需对不再用于后续活体实验的个体蚊虫进行精确的摄食量测量，应在喂食后立即将蚊虫及含有0.002%荧光素的剩余1 mL餐液于-20 °C保存。实验可在此处暂停。该方法详见于 图2.- 为生成参考标准曲线，配制一系列稀释液，所用餐液含有与实验组蚊虫所摄取的相同浓度（0.002%）的荧光素。共制备8个标准曲线溶液。每个溶液中含0.002%荧光素的餐液体积分别为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125或0 µL，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）补足至总体积100 µL（例如，将5 µL含0.002%荧光素的餐液加入95 µL的1× PBS中）。
- 制作标准曲线的第一个溶液时，取50 µL含0.002%荧光素的餐液加入950 µL的1x PBS中，充分涡旋混匀（最终体积为：95 µL 1x PBS中含有5 µL含0.002%荧光素的餐液）。制备标准曲线其余溶液时，从上一管中取500 µL加入另一含有500 µL 1x PBS的新管中，依次进行2倍梯度稀释。每次进行下一步2倍稀释前，需充分涡旋混匀。
- 在96孔PCR板的第一列中，向8个孔分别加入100 µL标准曲线溶液，用于制备生成参考标准曲线的反应孔。向同一列的每个孔中各加入1只未喂血的对照蚊虫。在第二列重复上述操作，以进行重复检测。
注意：如果实验组接受不同类型的餐食，则每种餐食类型都必须分别制备一条独立的参考标准曲线。 - 在未进食对照组和实验组的每个剩余孔中加入 100 µL 1x PBS。如果后续步骤中需使用珠磨匀浆器或涡旋振荡器破坏组织，则在每孔中加入一颗 3 mm 硼硅酸盐实心玻璃珠。
- 作为阴性对照，在培养板接下来的2列中，每孔加入1只未吸血的蚊虫。该组测得的荧光值将作为基线截断值，用于校正组织自发荧光，并判断实验组中的蚊虫是否摄食了餐食。
- 向已提供餐食的实验组中剩余的孔中每孔加入1只蚊子。
- 小心密封培养板，通过手动研磨破碎组织。应充分匀浆腹部组织以释放其中的食物。组织破碎方法包括：使用带有3 mm硼硅酸盐实心玻璃珠的珠磨匀浆器（30 Hz，30秒）、带有3 mm硼硅酸盐实心玻璃珠的涡旋振荡器，或不加珠子的研钵研磨。
- 以2000 rpm离心平板1–2分钟，以收集裂解液。
- 在96孔黑色培养板的每个孔中加入180 µL 1x PBS。
- 将20 µL裂解液转移至各孔，每孔加入180 µL 1x PBS并混匀。如有条件，此步骤建议使用多通道移液器以提高速度和一致性。
- 使用酶标仪在485/520激发/发射波长下测定每孔的荧光强度。通过将已知的餐食体积与相应的荧光强度测量值作图，绘制参考标准曲线。
- 根据生成的标准曲线，推算实验组每只蚊虫摄入的餐液体积。为校正组织本底自发荧光，需从实验组每只蚊虫的荧光强度读数中减去未进食对照组的平均荧光强度读数。
结果
图1展示了Glytube组装的示意图，而图2概述了使用本文所述基于荧光的检测方法测定摄食量的实验设计。图3提供了来自一次吸血实验的代表性荧光素摄食量测量结果。图4、图5和图6展示了可利用本方案解决的部分生物学问题。该方案的应用范围广泛，包括改变血液餐的组成、饲喂药理学化合物、精确量化次优血液餐或较小的花蜜餐，以及比较不同蚊子基因型间的摄食行为。
为了建立用于餐液体积计算的标准曲线，将每个含有未吸血蚊虫和已知体积含0.002%荧光素餐液的指定参考孔的荧光读数进行绘图（图3A）。其余孔中的蚊虫来自未吸血的阴性对照组或接受餐液的实验组，其荧光读数与该标准曲线进行比较，以量化每只蚊虫摄取的餐液体积（µL）（图3B）。为验证本实验中的基线读数，应确认未吸血阴性对照组的蚊虫未被赋予正的摄取体积（µL）值（图3B，左侧）。尽管实验组中的所有雌蚊均被提供血液餐液，但部分蚊虫已吸血（图3B，中部），而另一些则未吸血（图3B，右侧）。该结果表明，本方案可获得两类数据：1）总雌蚊中摄取特定餐液的比例；2）摄取特定餐液的雌蚊所摄入的餐液体积。
本方案可用于递送并定量不同蛋白质组成的餐食。图4A,B展示了使用添加荧光素的餐食所收集的数据。根据荧光读数分别计算出取食的蚊虫比例及其摄入的餐食体积。这些读数具有高度敏感性，可精确量化至微升（µL），但其局限性在于蚊虫无法用于后续活体实验。图4C,D展示了另一项独立实验的数据，该实验中蚊虫在提供不含荧光素的餐食后，通过肉眼判断其是否取食。餐食量通过每组5只蚊虫的平均体重增加量来计算。尽管此类体重测量的灵敏度低于荧光测量，但其优势在于可回收雌蚊并用于后续活体实验。取食蚊虫的比例在不同实验日之间可能存在差异，如图4A和图4C所示。
图5展示了含有调节蚊虫宿主搜寻行为药物的餐食摄取量。在这些实验中，雌蚊被提供血液、生理盐水+ATP，或含有100 μM人NPY Y2受体激动剂TM30338的生理盐水+ATP餐食。该药物通过激活埃及伊蚊（Ae. aegypti）类NPY受体7来改变其宿主搜寻行为。测量餐食摄入量对于评估该药物对吸血后行为影响的实验解释至关重要，因为它使研究人员能够计算每只雌蚊摄入的药物剂量。
在之前的实验中，雌性蚊子被喂食血液或替代性血餐，所有处理均获得3–5 µL的餐量（图3，图4，图5）。这种基于荧光的检测方法还可用于测量更小和/或变异更大的摄食量，这些摄食量无法通过群体平均体重变化准确判断。在图6中，采用相同的荧光定量方案，通过将Glytube替换为浸有含0.002%荧光素的10%蔗糖溶液的棉球，来测量蚊子的花蜜摄食行为。在Glytube检测中无法提供花蜜糖类，因为雌蚊无法用口针探测到花蜜糖的存在，因而不会启动摄食27。这些数据使研究人员能够确定，糖餐的摄食量 consistently 小于血餐，这与先前的研究结果一致34（图6）。
图1：用于向蚊子提供食物的Glytube方法装置示意图。（A）拆解后的Glytube示意图，用于向蚊子提供血液及其他食物。（B）Glytube置于带有网状盖的蚊子容器上方的示意图。雌性蚊子可穿透网状盖进行取食。（C）Glytube的照片（上方），以及雌性Aedes aegypti蚊子在取食前、取食中和取食后（下方，从左至右）摄取Glytube递送食物的照片。图中显示蚊子穿透其容器的网状覆盖物以接触膜式饲喂器。（D）未进食的雌性Ae. aegypti蚊子（左），以及摄取了人工血液餐（右，上）或盐水+ATP餐（右，下）后饱食状态的蚊子照片。Glytube方法先前发表于Costa-da-Silva等（2013）20。图（C）和（D）由Alex Wild提供。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：Glytube 血饲实验后定量摄食量的示意图。（A）为蚊子提供含荧光素的餐食（上方，实验组）或不提供餐食（下方，未吸血阴性对照组）。（B）饲喂实验结束后，将单只蚊子加入 96 孔板中。（C）使用已知量的含 0.002% 荧光素的餐液建立标准曲线。（D）将蚊子匀浆以释放摄入的荧光素，并使用酶标仪定量各孔中的荧光强度。该荧光定量方法经 Liesch 等（2013）34 修改而来。请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：基于荧光素定量的 Glytube 血饲实验。（A）来自未进食对照组蚊虫加入已知数量含 0.002% 荧光素餐液的孔位所获得的标准曲线测量值（y 轴刻度 = 任意单位）。（B）根据未进食对照组雌蚊（左侧，黑色，n = 40）、血饲实验组雌蚊（中间，红色，n = 37）和未血饲实验组雌蚊（右侧，红色，n = 23）的荧光读数计算的摄食体积。每个数据点代表一只雌蚊的测量值。数据以中位数及范围表示。字母表示具有统计学差异的组别，Kruskal-Wallis 检验结合 Dunn 多重比较校正，p<0.01。这些数据发表于 Jové 等（2020）27。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：不同蛋白质组成餐液的摄食量量化。雌蚊分别被提供绵羊血（红色）、含有人血蛋白的人工血液（Kogan (1990)22）（橙色）或无蛋白的生理盐水+ATP餐液（青色）7。(A) 利用荧光读数评估的摄食雌蚊百分比。每个数据点代表一组12–16只雌蚊。数据以中位数及范围表示，n = 12。(B) 根据荧光读数计算的餐液体积。每个数据点代表来自单次实验中一只雌蚊的测量值，数据来源于图 4A。数据以中位数及范围表示，n = 12。(C) 通过人工膜饲喂后完全吸饱的雌蚊百分比，由肉眼评分。每个数据点代表一组20–30只雌蚊中吸饱个体所占的百分比。数据以中位数及范围表示，n = 23。(D) 在肉眼评估摄食状态后，按每只雌蚊体重评分的餐食大小。体重数据为每组5只蚊子的平均值。数据以中位数及范围表示，n = 23。A–D：字母表示统计学上显著不同的组别，采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn's多重比较校正，p<0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：药理学化合物对摄食量的定量分析。雌蚊摄取的绵羊血液（红色）、生理盐水+ATP（青色）以及含100 µM人源NPY Y2受体激动剂TM30338的生理盐水+ATP（深蓝色）的餐量大小相同。餐液体积通过荧光读数计算得出。每个数据点代表一只雌蚊的测量值。数据以中位数及范围表示，n = 12。字母表示具有统计学差异的组别，采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn's多重比较校正，p<0.05。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：较小花蜜餐量的定量分析。（A）花蜜摄食实验示意图。（B）通过荧光读数计算野生型雌性在花蜜摄食实验中摄取的餐液体积，实验提供含0.002%荧光素的水（蓝色，n = 36）或10%蔗糖溶液（绿色，n = 53）。每个数据点代表一只雌性个体的测量值。数据以中位数及范围表示。不同字母表示组间差异具有统计学意义（Mann-Whitney检验，p<0.05）。这些数据发表于Jové等（2020）27。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 人工血液餐 | |||
| 储备液浓度 (mg/mL) | 每毫升餐液中储备液体积 (μL/mL) | 终餐浓度 (mg/mL) | |
| 蛋白质组分* | |||
| γ-球蛋白 | 50 | 300 | 15 |
| 血红蛋白 | 35 | 230 | 8 |
| 白蛋白 | 300 | 340 | 102 |
| 总蛋白 | - | - | 125 |
| 非蛋白质组分 | |||
| 储备液浓度 (mM) | 每毫升餐液中储备液体积 (μL/mL) | 终餐浓度 (mM) | |
| NaCl | 在γ-球蛋白储备液中 | - | 5-10 |
| NaHCO3 | 在γ-球蛋白储备液中 | - | 120 |
| ATP | 200 | 5 | 1 |
| 水 | - | 125 | - |
| *除γ-球蛋白溶解于400 mM NaHCO3并含有可变含量的NaCl（2–4%）外，其余蛋白质组分均用双蒸水配制为储备液。 | |||
表1：人工血液餐的配制配方（改编自 Kogan (1990)22）。 人工血液包含人类血液中常见的蛋白质和非蛋白质成分，并可灵活调整这些成分的比例。蚊子在摄取人工血液后能够产卵7,22。
| 生理盐水餐 | |||
| 组分 | 储备液浓度 (mM) | 每毫升餐液中储备液体积 (μL/mL) | 餐液终浓度 (mM) |
| NaCl | - | - | - |
| NaHCO3 | 400 | 300 | 120 |
| ATP | 200 | 5 | 1 |
| Water | - | 695 | - |
表2：含ATP的盐水餐配方（改编自Duvall等（2019）7）。 无蛋白盐水餐可用于向蚊虫递送目标化合物，同时模拟吸血后腹部膨胀的状态，但不会引发摄入蛋白质后所导致的卵子发育。
讨论
在许多实验室应用中，与使用活体宿主相比，人工膜饲喂装置具有明显优势，因为它允许研究人员直接操控饲喂餐液的成分。尽管目前已有多种人工膜饲喂方法，但本文所述方法在灵活性、成本和通量方面更具优势。与其他商用膜饲喂装置相比，Glytube 检测所需的餐液体积较小，因此在递送昂贵试剂（如药物或病原体）时，可显著减少所需总体积，是一种高效的递送方式7,35。由于无蛋白生理盐水和人工血液餐液均能促进吸血昆虫充分摄食，因此可将化合物或病原体添加至任一种餐液中，作为注射方法的高通量且非侵入性替代方案。此外，Glytube 的各个组件均可轻松清洗、更换或放大，从而在无交叉污染的情况下递送并量化多种类型的餐液。
为了定量蚊子摄入的餐血量，基于荧光的方法比通过称量吸血前后蚊子重量的方法能更精确地测定血餐大小。需要注意的是，该方法属于终点检测法。相比之下，称重法可使蚊子保持存活，以便进行后续实验。通过使用酶标仪，基于荧光的方法可轻松扩展，实现对数百只雌蚊个体摄入血餐的高通量定量分析。
为了实现较高的取食率，必须存在足够的宿主信号组合，以激活雌蚊的寻宿主行为并吸引其飞向饲喂装置。如果蚊虫未聚集在Glytube下方，可能是由于餐食未充分加热，或CO2供应不足。在膜表面添加人体气味可稳定提高人工膜的吸引力。若观察到蚊虫位于Glytube下方但未能取食，则问题可能出在餐食成分上。雌蚊可能因餐食温度不够、血液过于陈旧，或餐食中添加物本身具有驱避性或引发不良化学反应而拒绝取食36。额外添加ATP也可显著提高取食率，并可在所提供的各种配方中按比例增加至终浓度2 mM。若石蜡膜未在Glytube盖上拉紧，雌蚊可能无法有效取食；石蜡膜应均匀透明且无褶皱，否则会阻碍雌蚊用其口针刺穿膜。若餐食渗漏至Glytube下方的网筛上，则可能是在拉伸过程中石蜡膜发生撕裂，需予以更换。
改变餐食成分还可使研究人员调控餐食从中肠清除所需的时间以及随后的宿主寻找行为。此处提供的餐食需要24–36小时完成消化7，与动物来源的血液相似。雌虫在摄取这些餐食中的任何一种后，在消化期间会抑制宿主寻找行为。由于生理盐水餐食不含蛋白质，雌虫在餐食被清除后会恢复宿主寻找行为。如果需要更快恢复，研究人员可选择其他“快速清除”型生理盐水餐食，其可在约6小时内排出27。尽管此处提供的生理盐水餐食的成分配比旨在与人工血液餐食直接比较实验结果，但“快速清除”餐食的成分更接近脊椎动物血液中的生理盐浓度。
本文所述方法存在一些局限性，在选择最适合研究人员实验目标的检测方法之前应予以考虑。所描述的荧光素测定方法不允许将蚊子再次用于其他实验。然而，可在使用荧光素法测定血餐量之前先进行体重测量。如果在多次重复实验中，特定血餐条件下的体重与血餐量保持一致，则在后续实验中可用体重作为替代指标。此外，本方案无法区分宿主搜寻行为与吸血行为中的缺陷；在寻找膜饲装置方面存在障碍的蚊子，其吸血率和/或血餐量均会降低。通过在实验过程中添加摄像设备记录行为，研究人员可判断雌蚊是无法找到Glytube，还是能够找到Glytube但未进行吸血。
此处所述的检测方法可被改进以探究与蚊子摄食行为相关的诸多未解问题。例如，可通过改变人工血液餐中特定蛋白的组成比例或总蛋白浓度，来研究特定血浆蛋白的作用。为评估多次摄食事件的餐量，可在不同来源的餐食中添加具有不同荧光光谱的染料，以区分来自不同来源的摄食。37该方案还可进行修改，以分别刺激蚊子着陆并开始吸血时用于探测血液并摄取血液的内部口器（即口针），以及接触皮肤的化学感受附器（即唇须、足）。36例如，如果将配体直接添加到餐食中，它们不会接触到唇瓣和足，因为膜仅被口针刺穿。如果将配体添加到Parafilm的外表面，则它们与餐食保持分离，可能被唇瓣和足接触36最后，关于吸血行为的详细动力学机制尚不明确，本文所介绍的方法可加以改进，将高分辨率追踪技术与机器学习工具相结合，以提取运动、姿态及摄食动态等行为学参数。38.
本方案旨在操作简便且成本低廉，适用于采用药理学和遗传学手段研究蚊子吸血及吸血后行为的研究人员。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Nipun Basrur、Adriana K. Rosas Villegas、Nadav Shai 和 Trevor Sorrells 对稿件提出的建议，感谢 Zhongyan Gong 和 Kyrollos Barsoum 提供的技术支持。感谢 Alex Wild 为图1提供的照片。K.V. 获得了勃林格殷格翰基金会博士奖学金的支持。V.J. 部分获得了美国国立卫生研究院 NIH T32-MH095246 项目的支持。本研究部分得到了霍华德·休斯医学研究所通过詹姆斯·H·吉利亚姆高级研究奖学金项目向 V.J. 提供的资助，该项目授予洛克菲勒大学。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（资助号：NSF DGE-1325261）对 V.J. 的资助而完成。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形管 | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 3 mm 直径硼硅酸盐实心玻璃珠 | MilliporeSigma | Z143928 | 用于珠磨均质器；若使用研钵研磨器则无需此物 |
| 32 盎司高密度聚乙烯（HDPE）塑料杯 | VWR | 89009-668 | 示例中用于取食实验的蚊虫容器；可使用其他替代选项 |
| 50 mL 圆锥形管 | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 96 孔黑色聚苯乙烯板 | ThermoFisher | 12-566-09 | |
| 96 孔 PCR 板密封膜 | Bio-Rad | MSB1001 | 可使用其他替代选项 |
| 96 孔 PCR 板 | Bio-Rad | HSP9621 | 可使用其他替代选项 |
| 腺苷 5′-三磷酸（ATP）二钠盐水合物 | MilliporeSigma | A6419 | |
| 白蛋白（人血清） | MilliporeSigma | A9511 | |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 01-213 | 可用于遮挡进入荧光素容器的光线；可使用其他替代选项 |
| 天平 | Fisher Scientific | 01-911 | 可使用其他替代选项 |
| 珠磨均质器 | Qiagen | 85300 | 若使用研钵研磨器则无需此物 |
| 棉球 | Fisher Scientific | 22456880 | 用于花蜜取食；可使用其他替代选项 |
| 去纤维蛋白羊血 | Hemostat Laboratories | DSB100 | 可使用其他替代选项 |
| Drosophila CO2 果蝇操作垫 | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | 可使用其他替代选项 |
| 荧光素 | MilliporeSigma | F6377 | |
| 荧光酶标仪 | ThermoFisher | VL0000D0 | 可使用其他替代选项 |
| γ-球蛋白（人血） | MilliporeSigma | H7379 | |
| 甘油 | MilliporeSigma | G7893 | |
| 血红蛋白（人源） | MilliporeSigma | G4386 | |
| 实验室封口膜（Parafilm） | Fisher Scientific | 13-374 | |
| 磁力搅拌器 | Fisher Scientific | 90-691 | 可使用其他磁力搅拌器 |
| 适用于 96 孔板的微量离心机 | VWR | 80094-180 | 可使用其他替代选项 |
| 微量离心管 | MilliporeSigma | 2236412 | 可使用其他替代选项 |
| 研钵研磨器 | VWR | KT749521-1500 | 若使用珠磨均质器则无需此物 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | BW17-516F | 可选 |
| 剃须刀片 | Fisher Scientific | 12-640 | 可使用其他替代选项，例如车床以获得更一致的切割效果 |
| 橡胶圈 | |||
| 硅胶管 | McMaster Carr | 若使用果蝇操作垫进行 CO2 供给则需要 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Fisher Scientific | S233 | |
| 氯化钠（NaCl） | MilliporeSigma | S9888 | |
| 搅拌子 | Fisher Scientific | 14-512 | 可使用其他磁力搅拌子 |
| 带可拆卸盖子的半透明聚丙烯储存箱 | 示例中用于取食实验的箱子 | ||
| 涡旋混合器 | |||
| 水浴锅 | 可使用其他加热装置 | ||
| 白色 0.8 mm 聚酯蚊帐网 | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | 可使用其他替代选项 |
参考文献
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