基于区组设计的功能性近红外光谱实验中的定性与比较性皮层活动数据分析

摘要

我们描述了使用区组设计结合感觉运动任务的连续波功能近红外光谱实验的分析方法。为了提高数据分析的可靠性，我们采用了基于定性一般线性模型的统计参数映射方法，以及用于多通道数据比较的分层混合模型。

摘要

神经影像学研究在评估干预前与干预后的神经功能状态（如康复治疗和外科手术）中发挥着关键作用。在众多用于测量脑活动的神经影像技术中，功能性近红外光谱成像（fNIRS）通过检测局部血红蛋白浓度变化来评估皮层动态活动，其原理与功能性磁共振成像（fMRI）相似。此外，由于fNIRS对受试者的物理限制较小，因此可适用于多种感觉运动任务的评估。目前许多实验室已开发出多种fNIRS数据分析方法；然而，尽管基本原理相同，尚无统一标准化的分析流程。本文介绍了采用区组设计的多通道fNIRS实验所获得数据的定性与比较分析方法。在定性分析中，我们采用基于广义线性模型的NIRS专用软件进行大规模单变量分析。NIRS-SPM分析通过可视化任务期间的脑区激活情况，提供每次实验会话的定性结果。此外，可使用无创三维数字化仪来估算fNIRS通道在大脑上的相对位置。为了验证NIRS-SPM的分析结果，可通过多通道分层混合模型，对同一受试者在不同实验会话（干预前与干预后）中由感觉运动任务诱发的血红蛋白浓度变化幅度进行统计学比较。本方法可用于多种神经系统疾病（如运动障碍、脑血管疾病及神经精神疾病）的干预前后效果评估。

引言

神经康复在感觉运动功能障碍后的功能恢复中起着重要作用。为了阐明与神经可塑性相关功能恢复的机制，已采用多种神经影像技术，如功能磁共振成像（fMRI）、正电子发射断层扫描（PET）、脑电图（EEG）和功能近红外光谱成像（fNIRS）。不同的成像方式各有其优缺点。尽管fMRI是最典型的设备，但它易受磁场干扰，成本高、物理限制大，且适用于感觉运动任务的范围有限^1,2,3,4。fNIRS作为一种非侵入性光学神经成像技术脱颖而出，其空间分辨率相对较低，但时间分辨率优于fMRI⁴。由于fNIRS可用于比较干预前后的效应，支持动态运动任务，具有便携性，并可在比fMRI更自然的环境中运行，因此在验证治疗效果方面尤为适用^1,2,4。已有研究报道，NIRS在脑血管疾病、癫痫性疾病、重度脑损伤、帕金森病和认知障碍等领域更具适用性^1,5。在感觉运动任务方面，fNIRS被广泛应用于步态和站立平衡^6,7,8、上肢功能（手部抓握、手指敲击）^8,9、复杂运动技能训练^10,11、机器人辅助康复^12,13,14,15以及脑-机接口^16,17,18。fNIRS基于光学神经成像和神经血管耦合原理，通过测量皮层代谢活动、血流量增加，从而间接反映皮层活动的次级信号¹⁹。已有研究报道，fNIRS信号与血氧水平依赖性fMRI信号具有高度相关性²⁰。连续波fNIRS利用修正的比尔-朗伯定律 ，根据宽带近红外光衰减的测量变化，来确定氧合血红蛋白（HbO₂）和脱氧血红蛋白（HHb）皮层浓度的变化^21,22。由于连续波NIRS系统无法测量差分路径长度因子（DPF），我们假设DPF为常数，并将血红蛋白信号变化表示为任意单位毫摩尔·毫米（mM × mm）^2,18。

功能性近红外光谱（fNIRS）实验需要选择最适宜的方法，包括探头设置、实验设计以及分析方法。在探头设置方面，脑电图（EEG）测量中常用的国际10-20系统是许多神经影像学研究者采用的标准设置。近年来，也有研究基于蒙特利尔神经研究所（Montreal Neurological Institute, MNI）的标准脑坐标进行定位。实验设计通常采用区组设计（常用于感觉运动任务）和事件相关设计。该方法通过比较静息状态与任务执行期间血红蛋白浓度的变化来评估脑活动；随着任务依赖性皮层活动引起的脑血流变化，氧合血红蛋白（HbO₂）浓度升高，而脱氧血红蛋白（HHb）浓度降低。尽管存在多种分析方法，NIRS-SPM这一免费软件可实现类似于功能性磁共振成像（fMRI）的统计参数映射（SPM）分析。NIRS数据的处理采用基于一般线性模型（GLM）的多变量单变量方法。在进行任务相关脑活动分析时，fNIRS测量结果可能受到诱发性或非诱发性神经活动以及脑内和脑外隔室中的系统性生理干扰（如心率、血压、呼吸频率和自主神经系统活动）的影响²³。因此，分析前的数据预处理，如滤波、小波变换和主成分分析，具有重要作用²³。在使用NIRS-SPM进行数据处理时，针对滤波和伪迹的处理，采用了低通滤波⁹和基于小波最小描述长度（Wavelet-MDL）²⁴的去趋势方法，以消除运动或其他噪声/伪迹来源的影响。有关该分析方法的更多细节，请参见Ye等人的研究报告²⁵。尽管有研究仅使用SPM进行分析，但其仅为基于图像分析的定性指标，且由于NIRS空间分辨率较低，在进行组间分析时需格外谨慎。此外，当差分路径因子（DPF）保持恒定时，不应在通道间或个体间进行数值上的直接比较，但可以验证各通道变化的差异。基于上述限制，为了补充NIRS-SPM组分析的结果，我们在提高空间配准精度后，采用了一种自定义的多通道分析方法。该多通道分析利用分层混合模型，比较了治疗前与治疗后即刻各通道在静息期与任务期之间HbO₂和HHb浓度变化的幅度，模型中包含固定的干预因素（治疗前或治疗后）、固定的时期因素（静息或任务中）以及随机的个体效应。

因此，目前存在多种fNIRS测量与分析方法，但尚未建立统一的标准方法。本文中，我们介绍我们的分析方法：基于定性GLM的统计参数映射法，以及比较性多水平分层混合模型，用于分析采用区组设计结合感觉运动任务所获取的多通道fNIRS实验在干预前与干预后的数据。

方案

本研究获得了日本福冈大学机构审查委员会（IRB）的批准（IRB编号：2017M017）。在参与研究之前，所有患者均签署了书面知情同意书。

1. 准备 fNIRS 实验

注意：本实验采用了一种基于多通道连续波激光的近红外光谱系统。近红外光的波长分别为780 nm、805 nm和830 nm，采样率设置为7.8 Hz。时间分辨率和空间分辨率（光源与探测探头之间的距离）分别为0.13 s和3.0 cm。

1. 将fNIRS设备置于黑暗且无噪音的环境中，在室温下进行实验。实验开始前30分钟启动fNIRS仪器。
   注意：fNIRS系统需在受控的温度和湿度条件下使用，以确保设备稳定运行²⁶。
2. 使用全头帽进行fNIRS记录，并将头帽佩戴于受试者头部，使对应国际10-20系统中央点（Cz）的位置对准头帽上的第245号固定位。（图1）。
3. 在参考定位点处粘贴标记贴纸：鼻根点（Nz）、右侧外耳道（AR）和左侧外耳道（AL）。
   注意：由于三维（3D）坐标将在Nz、AR、AL标记贴纸及Cz固定位周围读取，因此必须在拍照前完成贴纸的粘贴。
4. 完成高分辨率数码相机的空间配准校准后，从15个不同视角拍摄受试者头部照片，显示探头位置及参考点（Cz、Nz、AR和AL）。
   注意：请在放置探头前进行拍照。若在放置探头后拍照，标记点可能被探头或连接线遮挡。根据制造商建议，先从受试者右前方以30°对角线方向拍摄12张照片，再从略高角度拍摄至少三张照片，确保Cz（第245号固定位）出现在图像中。这是因为总共拍摄15张或更多照片时，更易于实现三维重建。
5. 使用带LED照明的塑料棒小心分开妨碍光极接触的受试者头发，以便安装探头。调整探头位置，使光极尽可能贴近头皮表面并与头皮紧密接触。
   注意：需仔细检查光极安装是否对受试者造成任何压力或不适，因为这可能增强与自主神经系统激活相关的系统性干扰因素²³。
6. 将包含32个光极（16个光源和16个探测器；每侧半球为4×4阵列）的48通道系统对称地布置于头帽的额区和顶区，作为感兴趣区域（图2）。
7. 启动并使用3D数字化仪软件以确定空间配准。
8. 扫描完整头部的图像数据后，通过自动测量确定每位受试者的空间坐标，并保存为Origin 和Others 文件（*CSV格式）。
   ​注意：若自动测量无法从图像中检测到坐标点，则需手动输入调整。

2. 运行实验

1. 为实验选择一个区组设计，任务可以是研究中感兴趣的任何运动，例如手部张开/闭合、手指敲击等。在我们之前的研究中，任务为机器人辅助的肘部运动¹⁵。
   注意：每个周期由三个区组组成（15 秒休息 - 15 秒任务 - 15 秒休息），每位患者在每次实验中完成七个周期。
2. 让受试者以舒适姿势等待，直至开始信号。指导受试者在休息和执行任务期间闭上眼睛。
3. 给出开始和停止提示（即"重复进行肘部屈伸运动"、"停止并放松"）。
   注意：测量过程中不要说话。测量期间需仔细检查显示器上的伪迹。
4. 以相同姿势执行区组设计任务。建议采用直立姿势（站立或坐姿），以避免头戴装置发生形变。
   注意：如果患者在长时间佩戴头架后感到不适，可在机器人辅助训练期间取下或松开探头。
5. 完成近红外光谱（NIRS）测量后，取下头架和标记贴纸，结束实验。
   ​注意：需仔细检查头皮是否因长时间佩戴而出现皮肤损伤。

3. 使用 NIRS-SPM 软件进行定性 GLM 分析

1. 在 MATLAB 软件中启动 NIRS-SPM。将来自 NIRS 设备获取的 HbO₂ 和 HHb 浓度变化相关数据文件转换为适用于 NIRS-SPM 分析的文件格式。
2. 从弹出菜单中选择所使用的 NIRS 系统选项。点击加载按钮，并选择导入 HbO₂ 和 HHb 浓度变化的选项。
3. 检测 NIRS 通道位置的空间配准。选中 独立运行（Stand-alone） 复选框，然后选中 使用三维定位仪（With 3D Digitizer） 复选框。
4. 在“从实际坐标到 MNI 空间”部分，使用对话框选择指代坐标参考点文件的 _origin.CSV，以及指代坐标探针/通道文件的 _others.CSV。
5. 点击 配准（Registration） 按钮。选择用于进行空间估计的点，然后点击 确定（OK） 按钮。接着点击 将 MNI 坐标投影至渲染脑图（Project MNI coordinate to Rendered Brain） 按钮。
   注：NIRS 通道位置的空间定位基于蒙特利尔神经学研究所（Montreal Neurological Institute, MNI）脑模板进行估计。
6. 选择 背侧视图（Dorsal View） 选项，然后点击 保存（Save） 按钮。
7. 在 指定一级分析（Specify the 1^st Level） 部分，选择 NIRS 数据文件名和 SPM 目录。选中血红蛋白复选框，选择 HbO₂ 或 HHb。高亮 指定设计（Specify design） 选项并选择 Sec 选项。高亮 条件/试验次数（Number of Condition/Trials） 选项，并输入数字 7。
8. 高亮 起始时间向量（Vector of Onset） 和 持续时间[s]（Duration[s]） 选项，并输入起始时间向量乘以实验条件持续时间的数值，如下所示。
   注：在此情况下，起始时间向量应设置为 [15:45:285] 或 [15 60 105 150 195 240 285]；持续时间向量应设置为 [15* ones(7,1)] 或 [15 15 15 15 15 15 15]。
9. 进行去趋势处理时，选择 小波-MDL（Wavelet-MDL） 按钮。使用 预着色方法：低通滤波（precoloring method: low-pass filter），选择 hrf 按钮以校正序列相关性，然后选择 无（none） 按钮。
10. 在估计时间相关性时，勾选 个体分析（Individual Analysis）。
    注：将 fNIRS 通道位置在个体 MNI 坐标系中的空间定位保存为文本文件。同样，将基于个体布罗德曼分区（Brodmann area, BA）的地图保存为文本文件。
11. 在估计时间相关性时，勾选 组分析（Group Analysis）。NIRS-SPM 根据 MNI 标准化脑坐标系统对参与者的平均光极位置进行对齐。
12. 基于标准化脑图的血红蛋白水平变化计算激活图。HbO₂ 和 HHb 水平的变化在未经校正的阈值 p < 0.01 时被认为具有显著性。
    ​注：在组分析中，右侧受累侧的左右信息进行了翻转。

4. 基于分层混合模型的多通道比较分析

1. 启动 SAS 软件。将经过低通滤波处理（截止频率设为 0.1 Hz）的近红外光谱（NIRS）数据文件中 HbO₂ 和 HHb 浓度变化的文本文件（.TXT）转换为电子表格软件的逗号分隔值文件（.CSV）。
2. 使用程序创建导入的 SAS 数据文件（.sas7bdat）。
3. 使用以下命令输出导入文件：libname out "Import file"
4. 为每位受试者输出干预前与干预后的文件，在 Analysis SAS 中运行以下命令（图 3）。在创建导入文件时，命名应能识别受试者信息以及干预前或干预后状态（例如，id1 pre、id1 post…）。
5. 对每个通道（ch1–48；HbO₂ 和 HHb）运行干预前与干预后的数据命令，如下所示（图 4）。
6. 根据输出结果获得的数据，将每个通道在干预前与干预后变化的差异（任务中与静息状态下的差异）、静息状态值以及任务中值（估计值、上限值和下限值）输入至电子表格工作簿文件（.xlsx）中。
7. 类似地，将固定效应 III 型检验中交互项的分子自由度、分母自由度、F 值和 P 值输入至电子表格工作簿文件（.xlsx）中。
8. 为控制多通道检测中的假发现率（FDR），采用 Benjamini 和 Hochberg 方法²⁷，并将 FDR 控制在 p 值 < 0.01 的水平。

结果

本文介绍了我们团队目前正在开展的机器人辅助康复研究：急性脑卒中患者上肢运动功能障碍的生物反馈效应。我们纳入了10名签署知情同意书的脑卒中患者（平均年龄：66.8 ± 12.0 岁；女性2人，男性8人），这些患者均收治于我院。在亚急性期脑卒中阶段，即发病后超过2周时，我们采用功能性近红外光谱成像（fNIRS）系统，在同一天的上肢机器人辅助康复训练前后，即时评估了这些患者的运动相关皮层活动。在任务设计方面，患者在每个任务周期内于15秒内完成患侧肘关节屈伸运动15次，并重复7个任务周期。此外，还招募了6名健康志愿者（平均年龄：58.7 ± 7.1 岁；女性2人，男性4人）作为对照组，以确定右侧肘关节屈伸运动过程中正常任务相关皮层激活的位置。

图5 展示了对10名中风患者进行组分析的结果 t使用NIRS-SPM软件通过GLM模型进行统计映射分析。该方法显示，在机器人辅助康复训练后，与...

讨论

在我们的研究中，针对功能性近红外光谱（fNIRS）数据的组分析方法，除了通过定性的 t 统计量映射进行成像分析外，还采用多通道比较分析方法对干预前与干预后（机器人辅助运动）的数据进行了比较。在定性分析中，我们采用NIRS-SPM软件，基于广义线性模型进行大规模单变量分析。NIRS-SPM分析通过可视化任务过程中被激活的脑区，展示每次实验会话的定性结果。此外，结合无创三维数字化仪提供的信息，可估算fNIRS通道相对于大脑解剖结构的位置。利用NIRS-SPM进行的组水平分析能够大致识别感觉运动任务中干预前与干预后的脑激活区域，但无法对相同通道内变化的差异进行直接比较。为了验证NIRS-SPM的分析结果，可采用多通道分层混合模型，对同一受试者在两次不同会话（即干预前和干预后）中感觉运动任务诱发的血红蛋白浓度变化幅度进行统计学分析。通过结合这两种方法，分析结果相互补充，使研究发现更加清晰明确。

为了通过近红外光谱（NIRS）数据获得准确的任务相关脑活动，任务设计、探头放置、分析前处理、分析方法以及环境设置都至关重要²³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三维数字化软件	TOPCON	-	NS-1000 software ver.1.50
近红外光谱系统	Shimadzu	-	FOIRE-3000
机器人	CYBERDYNE	-	单关节型混合辅助肢体（HAL-SJ）