自动步态分析是评估周围神经损伤和脊髓挫伤动物模型功能恢复的可行工具。尽管只需一次设置即可评估多种实验模型的运动功能，但对动物进行精细的硬件和软件调整及训练至关重要。
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摘要
摘要
周围神经和中枢神经损伤的研究主要在啮齿类动物（尤其是大鼠）中进行，因为这些动物模型不仅成本较低，而且已有大量可比较的数据发表于文献中。这包括多种用于研究神经损伤与修复后功能恢复的评估方法。除了通过组织学、电生理学以及其他体内和体外评估技术来评价神经再生外，功能恢复是判断神经再生程度最重要的标准。自动化步态分析能够记录大量与步态相关的参数，例如足印面积和足部摆动速度，以及评估四肢间的协调性。此外，该方法可提供神经损伤后及神经再生过程中大鼠足部的数字化数据，有助于我们理解周围神经系统和中枢神经系统损伤如何影响其运动行为。除了常用的坐骨神经损伤模型外，其他周围神经损伤模型（如股神经损伤）也可通过该方法进行研究。此外，还可用于评估中枢神经系统损伤，例如脊髓挫伤。有效且可重复的数据评估在很大程度上依赖于数据采集前对硬件和软件设置的精细调整。同时，实验动物的适当训练也至关重要。本研究旨在说明如何利用计算机化的自动化步态分析技术，评估不同周围神经损伤动物模型以及脊髓挫伤损伤模型中的功能恢复情况。同时强调该方法的局限性，例如在坐骨神经完全断裂（neurotmesis）的大鼠中，由于功能恢复有限，难以准确评估神经再生。因此，本方案旨在帮助对周围神经和中枢神经系统损伤感兴趣的研究人员，在啮齿类动物模型中评估功能恢复情况。
引言
周围神经系统和中枢神经系统的损伤常以啮齿类动物为研究对象，由此产生了大量关于神经损伤进程、修复手段或神经保护措施以对抗进一步继发性损伤及促进再生的比较数据1,2,3。在啮齿类动物模型中，实验性治疗策略的效果可通过多种技术进行评估，如组织学、免疫组织化学、电生理学以及成像技术（例如X射线显微断层扫描（μCT）），但与人类患者一样，判断治疗成功与否的最重要标准是功能恢复的程度4,5。最早研究啮齿类动物运动功能表现的研究可追溯至20世纪40年代6,7,8。在随后的几十年中，大鼠和小鼠被广泛用于研究其运动行为9,10,11。如今，针对周围神经和中枢神经损伤啮齿类动物模型的评估技术已十分丰富，涵盖从传统的墨水-纸步态分析12,13,14，到踝关节和步态运动学分析15,16,17，再到基于机器学习的先进方法，后者可实现对步态、肢体及关节运动轨迹的复杂估算18,19。
计算机化自动步态分析（AGA）用于评估外周和中枢神经系统损伤后以及潜在实验性治疗后的运动功能。该设备主要由一条玻璃走道和一个光源组成，光源根据啮齿类动物足部施加的压力来照亮其足印。随后，这些数据被计算机化处理，以计算一系列静态和动态参数。根据Deumens的观点，这些参数可进一步细分为步态的一般参数、与疼痛相关的参数以及与协调性相关的参数20（表1）。AGA检测步态行为变化的可行性已在多种外周神经损伤（PNI）动物模型中得到验证21，例如坐骨神经20、股神经22和正中神经23,24损伤模型。该方法也常规用于评估中枢神经系统损伤大鼠的运动功能，例如脑卒中25或脊髓挫伤26。该技术的优势在于能够获取大量可比较的数据，并可记录多种与步态相关的参数27。本文旨在为关注外周神经损伤（PNI）和脊髓损伤（SCI）动物模型的研究人员提供一份详细且可操作的指南，以评估这些模型中的运动功能。
| 类别 | 参数 | 描述 | |
| 步态的一般参数 | 足迹面积（距离单位） | 足印的面积 | |
| 足迹长度（距离单位） | 足印的长度 | ||
| 支撑基底（BoS）（距离单位） | 两只后肢或前肢之间的距离 | ||
| 步幅长度（距离单位） | 同一肢体连续两次着地之间的距离 | ||
| 与疼痛相关的步态参数 | 摆动时相时间（s） | 摆动时相的持续时间 | |
| 支撑时相时间（s） | 支撑时相的持续时间 | ||
| 平均足印强度（任意单位） | 支撑时相期间足印的平均强度 | ||
| 与协调性相关的步态参数 | 正常步序模式（NSSP） | 步态周期中足部着地的特定顺序 | |
| 相位离散度（%） | 两个特定肢体步态周期之间的时间差异 | ||
| 规律性指数（RI）（%） | 通过将完美NSSP次数乘以4，再除以一个步态周期中总的足部着地次数，来量化四肢间的协调性 | ||
表1：通过自动化步态分析可评估的步态参数。 参数的分类依据为Deumens等人的研究20。
方案
所有实验的实验方案均事先获得维也纳市政府动物实验审查委员会的批准。所有操作均严格遵循《赫尔辛基动物权利宣言》以及美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定执行。
1. 动物饲养
- 将体重为 250–300 g 的雄性大鼠（Lewis 或 Sprague Dawley 品系）饲养在 12 小时光照/12 小时黑暗的循环环境中，自由获取食物和饮水。
- 控制饲养环境的室温（维持在 20–22 °C）和湿度（45%–65%），以确保适宜的动物饲养条件。本研究中使用了雄性 Lewis 大鼠（PNIs）和 Sprague Dawley 大鼠（SCI）。
- 每周更换并清洁笼具两次。每笼饲养 2 至 3 只大鼠，并密切观察其社会行为和互动情况。在进行任何手术操作或功能测试前，应给予大鼠至少 1 周的适应期。
注意：大鼠在手术前需接受至少连续 5 天的步态分析装置训练，因此应确保大鼠到达实验设施后与计划进行实验手术的时间之间至少间隔 2 周28。
2. 神经损伤的诱导
注意：穿戴个人防护装备，例如手术服、手套和口罩。若无无菌手术服，干净且经清洗的实验服亦可。除非被污染，手术服或实验服无需在每只动物之间更换，但需在不同手术批次之间更换。建议使用无菌外科手套。若无此类手套，也可使用检查手套，但须在手术前用外科消毒剂清洗。手套应在每只动物之间更换。
- 手术当天，应尽量减少动物的应激反应，因为这可能干扰麻醉效果，例如动物可能需要更高剂量的麻醉剂。
- 手术当天，术前1小时通过25 G套管针在大鼠皮下注射0.05 mg布托啡诺/kg体重，溶于100–200 μL 0.9% NaCl中，以提供术前和术中镇痛。除非另有说明，首选注射部位为大鼠侧腹部。
- 将大鼠置于连接七氟烷蒸发器和活性石灰容器（用于吸收CO2）的麻醉诱导舱中进行麻醉。以1.5 L/min的氧气流速，向麻醉箱内通入4%–5%七氟烷-氧气混合气体约5分钟（诱导阶段）。将脉搏血氧仪探头连接至大鼠一只足掌，以监测其血氧饱和度。随后以2.5%–4.5%七氟烷-氧气混合气体维持全身麻醉状态。
注意：实验性手术必须采用全身麻醉。通过检查大鼠对尾部或足部夹捏刺激无反应来确认其处于全身麻醉状态。 - 当大鼠进入全身麻醉状态后，剃除拟手术区域的毛发，并交替使用酒精和皮肤消毒剂擦拭进行消毒，最后一次擦拭应使用皮肤消毒剂。
- 将大鼠按所需体位置于可调节加热垫上（股神经模型取仰卧位，坐骨神经及脊髓损伤模型取俯卧位）。将柔性体温探头插入大鼠直肠以监测体温，并在手术期间维持体温在约37 °C。麻醉期间应使用眼膏保护大鼠眼睛，防止角膜干燥。
3. 神经损伤的手术诱导
- 进行外科手术操作时，必须严格遵守 Halsted 的七项原则29，具体如下：
- 操作组织时务必轻柔，避免撕裂或压榨组织。
注：自制30或市售的牵开器系统有助于将肌肉和血管移出手术视野。 - 使用电凝止血器或结扎方法仔细控制止血，确保止血彻底。
- 通过精细解剖和轻柔操作，始终维持组织的血液供应。
- 通过佩戴口罩、手术衣和无菌手套，严格保持无菌操作。
- 缝合时避免对组织施加张力，确保缝合既不过紧也不过松。
- 仔细对合组织，使各边缘准确对接，不得重叠。
注：这一点在神经外膜或神经束膜神经缝合术中尤为重要。所有显微外科操作均应在 6x–16x 放大倍数的手术显微镜下进行。理想情况下，显微镜应配备两组目镜，以便助手同时观察手术过程。 - 通过仔细缝合各组织层，避免死腔形成。
- 操作组织时务必轻柔，避免撕裂或压榨组织。
- 右侧后肢坐骨神经神经断裂模型的建立
- 使用连接 #3 手柄的 #10 手术刀片，在后肢背侧做一条长约 5 cm 的切口，暴露大腿中段水平的右侧坐骨神经。分离覆盖的肌肉和软组织后，将牵开器置入切口，以保持肌肉和皮肤远离手术区域。使用弯头显微手术剪小心清除周围组织，充分暴露神经。
- 使用直头显微手术剪，在坐骨神经分叉近端 1–2 mm 处切除一段长 8 mm 的神经节段。
- 将该神经节段旋转 180°，置于切断的坐骨神经近端与远端残端之间，并使用显微持针器以两针间断 10–0 缝线在两端进行神经外膜缝合。
- 右侧后肢股神经神经断裂模型的建立
- 使用连接 #3 手柄的 #10 手术刀片，在腹股沟区域做一条纵向长 3–4 cm 的切口，以暴露右侧股神经血管束。使用手术剪进行钝性分离，直至暴露股神经分叉处。将牵开器置入切口，以保持肌肉和皮肤远离手术区域。
- 在分叉远端横断已暴露的运动支和感觉支，并使用直头显微手术剪分别切除每支一段长 6 mm 的神经节段。
- 将两个神经节段均旋转 180°，分别置于切断的股神经分支近端与远端残端之间，并使用显微持针器以两针间断 11–0 缝线在每处进行神经外膜缝合。
注：可进行同位自体神经移植，即将运动支移植物移植至原运动支，感觉支移植物移植至原感觉支；也可进行异位自体神经移植，即将运动支移植物移植至原感觉支，反之亦然。
- 胸段脊髓挫伤模型的建立
- 使用连接 #3 手柄的 #10 手术刀片，在胸段脊柱区域做皮肤切口，随后沿棘突两侧做两个平行的肌肉切口，以便牵开肌肉。将牵开器置入切口，以保持肌肉和皮肤远离手术区域。
- 确认第 11 胸椎（Th），使用咬骨钳去除覆盖组织及棘突，暴露椎弓的椎板。
- 使用微型钻头和合适的磨头在椎板上钻一小孔，孔径略大于撞击器的探头。为防止损伤脊髓，仅用咬骨钳逐步削薄并扩大椎板开窗，避免穿透。若骨膜仍完整，使用尖头探针小心去除，避免损伤硬脊膜。
- 确认开窗足够大且未导致椎板不稳定后，使用撞击器的稳定钳在 Th11 的头侧和尾侧夹住动物脊柱以固定位置。通过前方和侧方的手轮调节，将钢杆置于椎板切除开窗上方 3–5 mm 处。最后，对所有动物施加 150 kilodyne 的固定冲击力，以建立轻度至中度的脊髓挫伤模型4。
- 使用聚乳酸羟基乙酸（polyglactin）4–0 或 5–0 缝线及手术持针器，按解剖层次逐层关闭切口。用浸有无菌 0.9% NaCl 的纱布轻轻擦拭，彻底清洁伤口。
- 术后将动物放回饲养笼，并避免光照和噪音刺激。密切观察动物行为至术后第 7 天（DPO），并确保其摄入足够的食物和水。必要时，通过皮下注射补充液体（例如，0.9% NaCl 10 ml）。
- 术后至少提供 2 天镇痛治疗，例如使用阿片类药物（皮下注射布托啡诺 0.05 mg/kg 体重）和/或解热药（皮下注射卡洛芬 4 mg/kg 体重）。如需要，且在脊髓损伤（SCI）模型中，还应给予术后抗生素治疗（口服恩诺沙星 7.5 mg/kg 体重）。
- 如发生脊髓损伤，需手动排空大鼠膀胱，直至恢复自主排尿。
4. 步态分析前的手术干预恢复
注意：坐骨神经损伤的大鼠由于神经损伤后出现疼痛性神经病变，会表现出啃咬后肢足部的倾向。这种自残行为可能导致脚趾或相应后足部分的自断。在使用坐骨神经损伤模型时，建议优先选用Lewis大鼠品系，因为该品系大鼠自残倾向较小31。坐骨神经损伤的大鼠还容易出现手术侧肢体的挛缩，这可能因干扰数据采集而需将其排除出研究。此类不良事件在股神经损伤大鼠中发生率显著更低。
- 术后每天检查动物，特别注意其肢体和足部的状态。
注意：在脊髓损伤（SCI）大鼠中，由于动物自主排尿和排便能力受损，在Th11水平可能出现阴茎或直肠脱垂。这些情况通常被定义为研究的人道终点，需立即将受影响的动物从研究中剔除。 - 持续给予术后镇痛，直至大鼠不再表现出任何与疼痛相关的症状。
- 若出现持续性疼痛，可给予加巴喷丁（30–120 mg/kg 体重）口服，以治疗神经性疼痛。
5. 自动步态分析前的准备工作
注意：步态分析系统的原理是通过从下方拍摄动物穿过玻璃板的过程，玻璃板由绿色LED光源照射。当动物的足爪接触玻璃板时，足印区域会被照亮，并由高速摄像机记录下来。这些数据随后通过以太网电缆传输至运行步态分析软件的计算机。虽然实验人员可手动对单个足印进行分类，但最新版本的软件还具备自动足印分类功能。
- 所有测试操作均需在黑暗且无干扰噪音的环境中进行。由于大鼠能够感知超声波频率，还需确认环境中无此类声源。
注意：步态分析应每周或每两周进行一次，但不要过于频繁地测试大鼠，尤其是Lewis大鼠，若频繁接受相同训练，会逐渐失去参与实验的兴趣。然而，在手术前需连续每日训练5天，以使大鼠适应测试环境和操作流程。 - 在训练阶段及测试当天，关闭所有可能干扰自动步态分析设备摄像头的光源，准备行为测试室。用于数据采集的计算机屏幕应远离摄像头放置，避免屏幕光线对摄像头造成干扰。
- 确保设备安装稳固，并采取措施防止任何形式的振动，因为振动将严重干扰数据采集过程。
- 将大鼠带入行为测试室后，先将其置于各自的饲养笼中至少适应30分钟，再开始测试。
注意：每次接触动物时，均应穿戴个人防护装备，如手术服或实验服、手套和口罩。
6. 进行自动化步态分析
- 训练环节
注意：在训练过程中，动物会经历一个学习过程，因此建议逐步调整训练计划。每次训练成功完成后，使用食物奖励（例如，1–2 片早餐麦片）奖励动物。- 训练第一天，轻轻抓住动物躯干下方，将其平稳地携带至步道入口处。
- 将动物放置在入口区域，让其自行探索走廊开口，操作人员在测试过程中不得干预。
注意：切勿通过喊叫、吹口哨、吹气或触碰动物的方式来促使它穿过步道。这些行为会严重增加动物的应激反应，进而显著干扰数据采集过程。 - 等待动物自愿穿过步道回到其居住笼具。有时，尤其是未经训练的动物，可能需要数分钟才能完成。在训练第一天，不要求动物以匀速连续跑完全程。此阶段的主要目的是让动物适应测试装置和操作流程。
- 训练第二天，使动物习惯毫不犹豫地进入步道，并能毫不犹豫地返回其居住笼具。部分动物可能已经学会不间断地穿过步道，但在第二天结束时仍不要求必须达到此标准。
- 训练第三天，确保动物学会毫不犹豫、不嗅探或进行其他探索性动作地穿过步道，并以均匀速度行走。
- 训练第四天和第五天，重复之前的训练以巩固测试流程。
注意：如果动物在为期5天的训练结束时仍未掌握正确穿过步道所需的技能，可额外增加2天训练时间（例如利用周末）。也可考虑每天进行最多3次训练，每次训练之间至少间隔2小时休息。在95%的情况下，动物将在延长训练期结束时掌握所需技能。极少数情况下，若动物经过7天训练后仍未掌握该技能，建议将原定的实验手术至少推迟1周，并重复上述训练方案。
7. 数据采集
注意：步态分析系统可在动物行走时可视化每只足印，并自动分析多种步态参数，如足印面积、足印强度、摆动时间和摆动速度（表1）。由于步态分析系统基于动物足印产生的强度记录所有数据，因此请根据大鼠的体重和体型调整相机设置。此外，在数据采集前，确保步道干燥且清洁，以避免对数据采集造成任何干扰。
- 在采集任何数据之前，使用市售玻璃清洁剂和刮水器清洁行走通道。多次向玻璃板喷洒清洁剂，然后用刮水器擦拭其表面以去除任何颗粒物。同时清洁玻璃板下方。务必清除通道两端的任何液体，否则动物可能会踩到液体，从而影响记录的数据。
- 必要时重复清洁程序，例如步行区域受到污染，或在记录来自不同笼子的大鼠数据之前。此举旨在防止动物受到同种个体气味的干扰。
- 在首次数据采集之前，根据动物的体重调整相机设置。通过将最轻和最重的动物分别置于步道上，确认该设置在两种情况下均能获得良好的数据质量。调整相机增益、红色顶灯、绿色步道灯以及绿色强度阈值（GIT），以确保足印检测达到最佳效果。
注意：数据采集开始后，请勿更改已选定的设置，否则将影响所采集数据的可比性。作为例外，在数据分类过程中可更改GIT，但必须对所有试验统一进行更改。 - 使用提供的校准表定义并校准步行通道。
- 选择注册列表中的相机 设置 表。
- 点击 开放采集 按钮，可在 获取 表。
- 拍摄清洁后空走道的照片，该照片将在后续数据采集过程中作为参考。
- 注意状态从 等待快照 到 准备就绪，可进行采集.
- 点击 开始采集 按钮并注意状态从 准备就绪，可进行采集 到 等待运行开始.
- 将大鼠放置在走道上，并在计算机屏幕上跟踪动物的运动。注意状态从 等待运行开始 到 记录运行.
注意：软件将根据预设的运行特征自动将符合要求的运行标记为绿色符号，不符合要求的运行则标记为红色符号。当记录到三次符合要求的运行时，软件将自动停止数据采集，但可通过点击继续数据采集 开始采集 再次按下按钮。
8. 数据分类
注意：AGA 结果参数列表请参见表 1。需要至少三次符合标准的运行，期间动物必须稳定地通过走道，不得犹豫27。此外，奔跑速度应在文献中定义的相同类别范围内保持一致30。
- 在相应试验的 Experimental Explorer 选项卡中，点击 Classify 按钮以进行分类。
- 以正常速度播放采集的运行数据，初步判断数据是否符合前述要求。
- 在左上角，点击 Auto Classify 按钮，由软件自动对足印进行分类。
注意：尽管软件对足部的分类正确率较高，但有时可能无法为足印分配对应的足部，或分配错误。因此，务必在自动分类后再次仔细核对已分类的足印。 - 为准确计算正常步序模式（Normal Step Sequence Patterns, NSSPs），需确保分类算法不会因不可见的足印而产生混淆，从而导致NSSP计算错误（图1A）。因此，在计算NSSP时，仅应包含对侧足部同时可见时可检测到的足印，例如左前足（LF）和右后足（RH）（图1B）。
图1：典型的AGA数据示例，说明需手动二次核对数据分类的正确性。 当检测到前肢一次落脚后紧随另一前肢的落脚时（A），由于未检测到后肢落脚，AGA软件可能误判为不协调的行走模式。因此，建议始终进行二次核对，并选择初始的脚印点，即在对侧肢体也可见时所检测到的脚印点（B）。请点击此处查看该图的放大版本。
9. 计算统计量
注意：为了校正随时间推移因体重增加引起的变化，强烈建议计算实验足与非实验足（如对照足）之间的比值。此外，为考虑个体间足部使用差异，应进一步将该足对足比较的结果标准化为术前数值的比值。
- 点击查看运行统计按钮，以全面了解运行统计信息。
- 选择文件和导出，将运行统计或试验统计导出至电子表格软件。
结果
12只大鼠接受了实验性外周神经手术。其中7只大鼠进行了坐骨神经切除术（图2A），5只大鼠诱导建立了股神经横断损伤（图2B）。所有动物均采用自体神经移植修复神经缺损。另有6只大鼠诱导建立了脊髓胸椎11节段（Th11）的脊髓挫伤模型（图2C），共计18只大鼠。
图2：神经重建术后的手术部位。 坐骨神经（A）和股神经（B）的自体移植神经重建，以及脊髓挫伤后（C）的修复情况。请点击此处查看该图的放大版本。
所有动物术后恢复良好，未出现自残情况。坐骨神经损伤组有一只动物在术后观察期间出现右后肢足部严重挛缩，因此被排除在后续数据分析之外。
坐骨神经完全断裂
由于坐骨神经为后肢大部分区域提供肌肉运动和感觉支配，其切除会导致运动功能严重受损。损伤后，大鼠仅使用足底后部支撑体重（图3B–E），肢体以划圈样方式移动。因此，通过自动步态分析（AGA）评估的运动功能变化表现为印迹面积显著减小（图4A）和摆动时间显著延长（图4B）。与术前（Pre-OP）相比，观察期结束时这两个参数仍存在显著差异。值得注意的是，一只动物自术后第10周（WPO 10）开始出现右后足严重挛缩，导致在WPO12时右后足印迹面积较左后足增加超过150%（图5）。由于该数据点相较于本研究中其他所有动物属于极端异常值，因此在印迹面积的数据分析中排除了该动物。
图3：右侧坐骨神经进行临界尺寸切除及自体移植修复前后典型的足印图。 注意神经损伤后（B）与术前（A）相比，印迹面积显著减小。尽管在观察期间印迹面积略有增加（C–E），但右后肢的足印仍明显不同于基线记录。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：坐骨神经大段缺损切除后自体移植修复的功能恢复过程。 打印区域比值（A）和摆动时间比值（B）在坐骨神经切除术后立即较术前（Pre-OP）出现显著的统计学变化。尽管打印区域直至术后第10周（WPO10）仍显著低于基线水平，摆动时间在术后第12周（WPO12）仍显著高于术前值。*：与术前相比，p < 0.05；**：与术前相比，p < 0.01。误差条表示均值 ± 均值标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：坐骨神经损伤后打印面积变化过程的箱形图。 注意在术后第12周（WPO12）出现的极值（红色椭圆标注），其原因为一只动物自术后第10周（WPO10）起出现右后足严重挛缩。因此该动物被排除在图4所示的统计分析之外。请点击此处查看该图的高清版本。
股神经完全性损伤
股神经切除会导致大腿股四头肌失神经支配33,34。因此，膝关节伸展功能受损，导致踝关节过度屈曲，并继而引起相应足掌脚跟离地抬高。因此，术后该侧足掌的印迹面积（图6B）显著减小。由于体重代偿性地向左侧转移，左后足的印迹面积则相应增加。这一点需特别注意，因为该现象会直接影响“实验侧”与“对照侧”足掌之间计算比值的结果。从术后第4周（WPO4）开始，随着股神经再生并重新支配股四头肌，上述变化逐渐逆转，右后足的足印面积随之增大（图7A）。由于大腿股四头肌也参与相应足掌摆动相的运动，股神经损伤的大鼠其摆动时间（图7B）显著延长。随着再生的股神经重新支配股四头肌，摆动时间的延长趋势也随之改善并逐渐缩短。至术后第10周（WPO10），步态的这两个参数均已恢复至基线水平，表明功能完全恢复。
图6：典型的足印图。 右侧股神经切断并自体移植修复前（A）和修复后（B–E）的典型足印。术后第2周（WPO2）时，右侧后肢（RH）的足印面积显著减小（B），而由于负重增加，左侧后肢（LH）的足印面积增大现象变得明显。从术后第6周（WPO6）开始，RH足印面积逐渐增加（C），同时伴随LH足印面积的减小。在术后第8周（WPO8）（D）和术后第10周（WPO10）（E），RH足印面积恢复至接近术前水平。（经Heinzel等22许可改编，采用CC BY 4.0许可。） 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：股神经切除 7 mm 并进行自体神经移植修复后的功能恢复过程。 打印区域比值（A）和摆动时间比值（B）的变化显示，在股神经切除术后立即出现显著变化，但在术后第 8 周（WPO8）时数值恢复至术前水平。#：p < 0.05。误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。（经 Heinzel 等人22 许可改编，CC BY 4.0 许可协议。） 请点击此处查看该图的高清版本。
脊髓挫伤
步态分析显示，胸段脊髓挫伤损伤后，足印出现显著改变（图8），最显著的特征是印迹面积减小以及术后2周（WPO2）时后肢足部明显内旋（图8B）。值得注意的是，足部旋转角度在BBB评分中也被作为可评估的指标之一，这突显了计算机化步态分析在评估原本通过开放场地测试（Open Field testing）所判定的步态变化方面的适用性。就各项步态参数的变化过程而言，在Th11水平造成的脊髓挫伤导致印迹面积比值降低（图9A）以及摆动时相比值升高（图9B）。在后续观察期间，这两项参数均呈现向基线水平恢复的趋势，但未观察到具有统计学意义的变化。与协调性相关的参数——规则性指数（Regularity Index）（图9C）在WPO2时也有所下降，但在不同动物之间差异较大，并持续呈现向术前值恢复的趋势直至WPO16。根据Deumens的分类，后肢支撑基础（Base of Support）作为一项通用的步态参数（图9D），表现出显著增加，从WPO10至WPO14期间该变化具有统计学显著性。至WPO16时，该参数趋于基线水平，与术前值相比已无显著差异。
图8：两只后肢足印的代表性示例。 术前（A）及胸段脊髓挫伤后（B–F）的足印。注意从伤后第2周（B）开始足印面积减小，并伴有明显的足部内旋。在观察期间（C–F），足印面积逐渐增大，同时足部内旋现象逐步改善。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9：胸段11（Th 11）水平脊髓挫伤。 Th 11水平的脊髓挫伤导致足印面积比（A）和摆动时间（B）以及规律性指数（C）出现可观察到的变化，但这些变化无统计学意义。与基线相比，损伤后后肢的支撑基础明显增加，在术后10周（WPO10）至术后14周（WPO14）期间具有统计学显著性。*：与术前相比，p < 0.05。误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件1：故障排除详情。 请点击此处下载该文件。
讨论
在周围神经损伤（PNI）和脊髓损伤（SCI）的动物模型中，功能恢复的评估仍然具有挑战性，原因是评估方法种类繁多，每种方法都有其各自的优缺点。尽管结合运动追踪与机器学习的新兴技术有望将神经行为学研究推进到功能检测的新高度，但目前仅有少数方法在多种周围性和中枢性神经系统损伤模型中经过测试和验证。我们相信，未来将很快出现适用于多种动物和损伤模型的前沿技术。基于上述考虑，AGA 的一个优势在于仅使用一台设备即可在多种神经损伤模型中评估功能恢复。自21世纪初以来，该方法已被应用于坐骨神经37、腓总神经38和股神经损伤模型22等PNI实验模型，以及腰丛39和臂丛神经根撕脱伤模型40。此外，该方法也被用于研究多种中枢神经系统损伤，包括脊髓挫伤41,42。在本文中，我们提供了详细的实验方案，介绍如何诱导三种常见的神经损伤模型，以及如何在损伤后评估其功能恢复情况。我们认为，为致力于实验性神经损伤、修复与再生研究的科研人员提供一份实用的操作指南，以充分挖掘该方法的优势特性，将具有重要意义。
多位作者已探讨了利用足迹分析法（AGA）评估啮齿类动物功能恢复的潜力，强调该方法能够同时评估与运动和感觉再支配相关的步态参数27,28。此外，将实验侧足爪（例如重建神经损伤后）的数据与未经手术的对侧足爪进行比较（如本文所展示的两种模型所示），可引入动物个体内的阳性对照。相反，接受手术但未进行神经重建或额外治疗的足爪可作为个体内的阴性对照。已有研究显示，AGA可与机器学习方法相结合43。尽管该方法具有诸多优势，但也存在若干局限性和缺点，例如耗时较长的训练过程，这是使动物适应数据采集程序所必需的28,44。AGA的另一局限性在于，由于装置尺寸有限，仅适用于体型较小的动物。因此，目前AGA的应用仅限于啮齿类动物和雪貂等体型的动物45。此外，近年来新兴的基于运动追踪并具备机器学习能力的神经行为学评估方法，可能在全面性和应用潜力方面超越AGA18,19,46。尤为值得注意的是，与其他评估方法一致，AGA所测得的功能恢复在坐骨神经神经断伤模型中似乎受到严重限制，甚至可能根本不发生47,48。另一方面，我们的数据显示，AGA可用于全面评估股神经神经断伤后功能恢复的过程。在本研究中，我们证明“足印面积”是一个可通过AGA测量的代表性步态参数，能够典型地反映上述两种周围神经损伤模型中的功能恢复过程。在股神经自体移植修复后可观察到完全的功能恢复，而在坐骨神经自体移植修复后，观察期结束时AGA参数仍显著偏离基线水平。值得注意的是，与其他评估方法一致，肢体挛缩是坐骨神经损伤大鼠中的常见现象，需谨慎避免将肌肉失衡和瘫痪的体征误判为正在进行的功能恢复32。这在一方面凸显了AGA方法在该模型中难以检测神经断伤后显著功能恢复的能力局限；另一方面也引发了一个问题：当神经损伤程度超过轴突断伤时，是否仍可行通过步态分析来评估大鼠坐骨神经损伤模型——尽管该模型仍是目前最常用的实验性神经修复模型48。相关故障排除细节见补充文件1。
我们还提供了利用该方法评估脊髓损伤大鼠运动功能的示例性数据，此过程无需对硬件设置或数据采集程序进行任何修改。相同的原理也适用于其他中枢神经系统损伤（CNI）26,49,50和神经根撕脱伤的啮齿类动物模型。与单纯的周围神经损伤（PNI）相比，脊髓损伤在病理生理后果上要复杂得多，因为大量重要的结构同时受损，包括皮质脊髓束和红核脊髓束等传出通路，以及后索和脊髓丘脑束等传入通路35。为充分评估这些病理变化，已发展出一系列行为学测试方法，例如Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分系统36。已有报道显示，中枢神经系统损伤后，步态参数“支撑基底”（Base of Support）会增加，这很可能是机体为应对步态不稳所采取的代偿机制。在本模型中，支撑基底自伤后第10周（WPO10）至第14周（WPO14）均较基线水平发生显著改变，支持了我们的推断：该参数可用于评估胸段脊髓挫伤后通过自动步态分析（AGA）所反映的功能恢复进程。
我们确信，AGA 是评估神经系统损伤啮齿类动物功能恢复的可行工具。然而，我们建议在每一种具体的实验设计中，对观察到的步态变化进行仔细而全面的分析。在观察期间，步态参数的变化——例如，在术后即刻下降后足印面积增加，或在术后即刻该参数升高后摆动时间减少——并不一定与功能恢复相关。相反，这些变化也可能与可能的功能性适应有关，以维持不显异常的步态，因为大鼠属于被捕食物种，会尽量避免向潜在捕食者显露疼痛或功能障碍51。因此，建议将自动步态分析作为补充工具，将步态变化与其他周围神经损伤及再生的结局指标相互关联21。如前所述，我们也认为，对于坐骨神经神经断裂的啮齿类动物，是否应采用 AGA 进行研究需谨慎考量，因为我们的研究结果强烈表明，在此类情况下功能恢复极为有限。
如我们的研究所示，AGA 的主要优势在于仅需一套设备，即可在多种实验性周围神经损伤（PNI）模型以及中枢神经损伤（CNI）模型中同时研究运动和感觉神经的再支配过程。因此，我们认为该方法是进行综合性神经行为学检测的极为有价值的工具。AGA 的一大优势是仅需一个实验装置，即可在多种PNI和CNI动物模型中研究运动和感觉神经再支配，我们认为，与诸如足迹分析52、Von Frey 测试53或步态运动学16等其他功能恢复评估方法相比，这是该方法的主要优点。该方法在未来的应用中具有广阔前景，能够同时评估步态变化，这些变化可分别与再支配肌肉的电生理学检查结果22或感觉功能评估方法的结果相关联54。因此，我们建议将AGA用于研究前肢PNI的啮齿类动物模型中的功能恢复，例如尺神经、桡神经或正中神经损伤模型，以及目前尚未使用该方法研究的实验性神经转接模型55。
本文提供了一种详细的实验方案，介绍如何利用自动化步态分析来研究三种啮齿类动物神经损伤模型中的功能恢复。尽管该方法需要仔细考虑多个关键因素，例如充分的训练以及精密的硬件和软件校准，但它仍是一种可行且有价值的补充工具，可用于评估中枢和周围神经损伤啮齿类动物模型中的神经再生。
披露
作者声明，本工作得到了Noldus Inc.对开放获取出版费用的资助。所有作者均未获得任何个人薪酬或任何形式的经济资助。作者无其他竞争利益需要声明。
致谢
作者谨此感谢 Karin Brenner 对实验动物的悉心照料。作者同时感谢 Claudia Keibl、James Ferguson、Gabriele Leinfellner 和 Susanne Drechsler 在实验手术过程中提供的协助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | B. Braun 奥地利 | 3570410 | 药物递送载体 |
| 1 ml 注射器 | B. Braun 奥地利 | 9161708V | 注射装置 |
| 10 ml 注射器 | B. Braun 奥地利 | 4606728 V | 注射装置 |
| 1-丙醇，2-丙醇，己定醇 | Gebro Pharma | N/A | 酒精皮肤消毒 |
| 23 号（G）套管针 | B. Braun 奥地利 | 4657667 | 皮下注射用套管针 |
| 26 号（G）套管针 | B. Braun 奥地利 | 4657683 | 皮下注射用套管针 |
| 5 ml 注射器 | B. Braun 奥地利 | 4606710 V | 注射装置 |
| 盐酸丁丙诺啡 | Sigma | B9275 | 镇痛剂 |
| 微型钻头用磨头 | F.S.T | 19007-29 | 在椎板内钻孔 |
| 卡洛芬 | 硕腾奥地利 | N/A | 镇痛剂 |
| Catwalk 自动步态分析系统 | Noldus | N/A | 动物步态自动分析软件 |
| 电灼器套装 | F.S.T | 18010-00 | 手术期间血管的烧灼 |
| 恩诺沙星 | 拜耳奥地利 | N/A | 抗生素 |
| Ethilon（10-0） | ETHICON | 2810G | 用于神经吻合的缝合材料 |
| Ethilon（11-0） | ETHICON | EH7465G | 用于神经吻合的缝合材料 |
| 眼膏 | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | 麻醉期间的眼部保护 |
| Friedman-Pearson 咬骨钳 | F.S.T | 16221-14 | 手术器械 |
| 加巴喷丁 | Wedgewood Pharmacy | N/A | 镇痛剂 |
| 戈德斯坦拉钩 | F.S.T | 17003-03 | 手术中组织的牵拉 |
| 理发剪 | 七叶树属 | N/A | 手术前剃除手术部位毛发的理发器 |
| 啮齿类动物加热垫 | ALA科学仪器公司 | N/A | 体温调节 |
| 撞击器 | 精密系统与仪器 | N/A | 脊髓挫伤的诱导 |
| Lewis大鼠（<图像替代文本"公式 1" 源文本为空，无法翻译。请提供需要翻译的内容。"/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg"/>) | 一月 | N/A | 实验动物 |
| 磁性固定器牵开系统 | F.S.T | 18200-50 | 手术中组织的牵拉 |
| 梅岑鲍姆婴儿剪 | F.S.T | 14019-13 | 外科手术器械 |
| 微型钻机 | Word Precision Instruments | 503599 | 骨钻仪器 |
| 微针持针器 | F.S.T | 12076-12 | 外科手术器械 |
| 微型剪刀（弯型） | F.S.T | 15023-10 | 外科手术器械 |
| 微型剪刀（直型） | F.S.T | 15007-08 | 外科手术器械 |
| 镜面抛光镊子 | F.S.T | 11251-23 | 手术器械 |
| 持针器 | F.S.T | 12002-12 | 外科手术器械 |
| 手术显微镜 | Leica | M651 MSD | 手术区域的放大 |
| 聚维酮碘 | B. Braun Melsungen | N/A | 非酒精类皮肤消毒剂 |
| 脉搏血氧仪 | STARR Life Sciences | N/A | 心率和血氧饱和度监测 |
| 啮齿类动物体温计 | BIOSEB | BIO-TK8851 | 体温监测 |
| 手术刀片 | F.S.T | 10010-00 (#10) | 用于做切口的手术器械 |
| 手术刀柄 | F.S.T | 10003-12 (#3) | 用于切口的手术器械 |
| 七氟烷吸入用蒸气，液体（100%） | Baxter | HDG9117A | 麻醉剂 |
| 刮勺 &与探针 | F.S.T | 10090-13 | 外科手术器械 |
| Sprague Dawley 大鼠（<图片替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg"/>) | 让维耶 | N/A | 实验动物 |
| 无菌纱布 5x5cm | EVAC 医疗 | E010.03.00215 | 无菌纱布敷料 |
| 组织镊 | F.S.T | 11021-12 | 外科手术器械 |
| Vicryl（4-0） | ETHICON | V3040H | 皮下缝合用缝线材料 |
| Vicryl（5-0） | ETHICON | V303H | 皮下缝合用缝线材料 |
| Vicryl 带针缝线（4-0，角针） | ETHICON | V392ZH | 皮肤缝合用缝线材料 |
| Vicryl 带针缝线（5-0） | ETHICON | V391H | 皮肤缝合用缝线材料 |
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