本方案描述了一种三维（3D）磁性打印培养系统，可用于研究癌细胞条件培养基诱导的白色脂肪组织（WAT）重塑过程。利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的UCP1+脂肪细胞的三维培养系统，可研究米色脂肪细胞在脂肪组织重塑中的作用。
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摘要
摘要
癌症恶病质（cancer cachexia, CC）是一种具有多种表现形式的综合征，可导致明显的多器官代谢失衡。近年来研究表明，恶病质性消耗可能由多种炎性介质所驱动，这些介质可能破坏脂肪组织及其他组织（如脑和肌肉）之间的整合生理功能。在此情况下，肿瘤得以以宿主为代价而存活。近期的临床研究发现，不同脂肪沉积部位消耗程度的加剧与患者生存预后呈负相关。研究还表明，多种代谢紊乱可改变白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）的重塑过程，尤其是在恶病质发展的早期阶段。由组织重塑引起的WAT功能障碍是整体恶病质的重要促成因素，其中WAT的主要改变包括形态与功能变化、脂肪细胞脂解作用增强、免疫细胞积聚、脂肪生成减少、前体细胞群体改变以及 beige/brown样表型的增加 "生态位" 含有米色/褐色脂肪细胞。
为了研究恶病质诱导的白色脂肪组织重塑的各个方面，特别是其变化 前体细胞和米色重塑研究中，二维（2D）培养一直是体外研究的首选方法。然而，该方法无法充分概括白色脂肪组织（WAT）的复杂性。为重建功能性脂肪组织（AT），需要改进的检测方法 离体 有助于理解不同细胞群体之间的生理相互作用。本方案描述了一种基于磁性纳米颗粒的高效三维（3D）打印组织培养系统。该方案针对恶病质诱导因子（CIFs）引起的白色脂肪组织（WAT）重塑研究进行了优化。结果表明，三维培养是体外研究WAT建模的合适工具，可用于功能性筛选，以鉴定针对特定脂肪细胞群体的生物活性分子，并有助于发现基于WAT细胞的抗恶病质疗法。
引言
生物体由处于三维微环境中的细胞构成，细胞之间以及细胞与基质之间存在相互作用，并具有复杂的营养物质和细胞运输动力学1,2。然而，目前细胞生物学领域获得的大部分基础知识均来源于单层细胞培养（二维培养）。尽管二维培养能够回答某些机制性问题，但该方法无法充分模拟细胞所处的天然环境，可能难以准确预测复杂的药物反应1。此外，细胞通过机械转导感知其物理环境。事实上，机械力会被转化为生化信号，最终影响基因表达模式和细胞命运。在过去的几十年中，三维组织培养作为一种新的体外工具应运而生，能够更真实地模拟体内微环境，从而避免二维体外培养方法带来的一些机制性缺陷3。
癌症恶病质（CC）被定义为一种具有多种表现的综合征，可导致显著的多器官代谢失衡。在恶病质发展过程中，白色脂肪组织（WAT）会发生多种形态学改变，导致脂肪细胞脂解作用增强、免疫细胞积聚、脂肪生成减少、 前体细胞群体发生变化，以及含有米色/亮色细胞（米色样重塑）的“生态位”"niches"数量增加4。然而，利用体外模型重现恶病质影响WAT重塑的机制仍面临重大的技术挑战。事实上，少数尝试研究肿瘤与组织间通讯的研究采用了单层体外细胞培养（2D），从而规避了WAT....
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方案
1. 二维细胞与磁性纳米颗粒的孵育
- 采用标准细胞培养方法，将贴壁的二维培养物培养至约 70% 汇合度。
- 准备磁性纳米颗粒复合物：将其从冰箱中取出，在室温（20–25 °C）下静置约 15 分钟，使其恢复至室温1。
- 混合培养基：将磁性纳米颗粒直接加入 100 mm 细胞培养皿中的 12 mL 培养基中。反复吹打混匀数次，以确保纳米颗粒均匀分散。
注意：由于氧化铁呈棕色，培养基会呈现深色。建议使用浓度为 2.5 µL/cm2 培养面积。 - 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 100 mm 二维培养皿三次。
- 向 100 mm 细胞培养皿中加入 12 mL 步骤 1.3 中的混合培养基。将培养皿置于培养箱中孵育过夜（37 °C，5% CO2），以使磁性纳米颗粒与细胞充分结合。
2. 在96孔板中通过球状体组装构建3D培养
- 过夜孵育后，用 PBS 轻柔振荡培养板 3 次，每次 10 mL，以洗去残留的培养基和未结合的磁性纳米颗粒。
- 吸除培养皿中的 PBS，并加入 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在 37 °C 下孵育 2–5 分钟，使细胞脱落。
- 在等待细胞脱落的同时，用 70% 乙醇对磁力驱....
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结果
来自基质血管组分（SVF）细胞三维培养的脂肪球体
采用相同数量、来自同一只小鼠腹股沟白色脂肪组织（WAT）制备的SVF细胞，分别建立三维（3D）和汇合的二维（2D）培养体系（图1A，图1B），并按照相同的实验方案进行处理，以比较基因表达标志物。在诱导培养基刺激下，球体随时间逐渐扩张。图2B 显示2D多房细胞密度增加，表明其向成熟脂肪细胞分化。定量分析脂肪球体体积显示，在成脂诱导开始后10天，体积显著增加（约1倍）；而在非分化生长培养基（DMEM 2%）中培养的球体则未见扩张（图1B（3D-WHITE），图1C）。随后，比较了脂肪球体与2D培养体系的基因表达。在2D和3D培养体系中均检测到成熟脂肪细胞标志基因（如 Adipoq
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讨论
本方案建立了一种三维细胞培养系统，用于研究源自白色脂肪组织（WAT）原代基质血管组分（SVF）细胞的脂肪球中脂肪细胞的分化过程。与传统的二维贴壁培养相比，该三维系统更有利于脂肪组织（AT）的重塑，其条件更接近体内环境。近年来的研究表明，与二维培养系统相比，三维培养可导致细胞形态和信号传导的显著差异3。成纤维细胞在三维环境中的形态与二维条件下明显不同14。在乳腺上皮细胞中，三维培养可诱导组织特异性的分化15。对于乳腺癌细胞多细胞耐药性的研究，只有在三维培养的细胞中进行分析才具有高效性，而使用传统二维培养进行评估则效果较差16。
恶病质是一种非常复杂的综合征，用于机制研究的体外模型十分有限。Lopes 等人12在共培养系统中表明，LLC 会损害脂肪生成，表现为体外培养的 3T3-L1 细胞中脂滴体积减小。本研究显示，在 2D 和 3D 培.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）DK117161、DK117163（授予SRF）以及P30-DK-046200（授予波士顿营养与肥胖研究中心脂肪生物学与营养代谢核心）的资助，同时获得了圣保罗研究基金会（FAPESP）2018/20905-1号基金及CNPq 311319/2018-1号基金（授予MLBJr）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-5879 | 细胞培养 |
| 96孔生物打印试剂盒，黑色 | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655841 | 细胞培养 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 片段 驴抗兔 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | 免疫荧光染色，二抗，TBS 缓冲液含 0.1% Tween-20 中 1:400 稀释 |
| 细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，平底，µCLEAR，黑色，CELLSTAR，抗细胞粘附表面，带盖，无菌，8 个/袋 | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655976 | 细胞培养 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D-1756 | 细胞培养 |
| DMEM | Corning (Manassas, VA, USA) | 10-017-CV | 细胞培养 |
| 胎牛血清 (Tova) | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 100-500 | 细胞培养 |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-7378 | 细胞培养 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I0516 | 细胞培养 |
| LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) | American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) | CRL-1642 | 小鼠 Lewis 肺癌细胞系 |
| NanoShuttle-PL | Greiner (Monroe, NC, USA) | 657843 | 细胞培养 |
| NucBlue 固定细胞即用型试剂 (DAPI) | ThermoFisher (Waltham, MA, USA) | R37606 | 免疫荧光染色，按制造商说明书操作 |
| 青霉素-链霉素 | Corning (Manassas, VA, USA) | 30-002-CI | 细胞培养 |
| Perilipin-1 (D1D8) XP 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) | 9349 | 免疫荧光染色，一抗，TBS 缓冲液含 0.1% Tween-20 中 1:1000 稀释 |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | R-2408 | 细胞培养 |
| 胰蛋白酶-EDTA，0.05% | Corning (Manassas, VA, USA) | 25-052-CI | 细胞培养 |
| 逆转录 PCR 引物 | |||
| 引物 | 正向 | 反向 | |
| Adipoq | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| Col4a1 | TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT | ACCCTTGCTCGCCTTTGACT | |
| Cyclophilin a | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4 | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG | TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA | |
| Fn1 | GCTTCCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGGGT | |
| Pgc1a | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG | |
| Ucp1 | TCCTAGGGACCATCACCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC | |
| 小鼠基因分型 | |||
| 引物名称 | 描述 | 序列 | |
| Cre F | 通用 Cre 正向引物 | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | 通用 Cre 反向引物 | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT/mG 正向引物 | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT/mG 野生型反向引物 | CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT/mG 突变型反向引物 | TCA ATG GGC GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 突变型正向引物 | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC | |
| WH337 | UCP1 突变型反向引物 | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | |
| WH338 | UCP1 野生型正向引物 | GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT | |
| WH339 | UCP1 野生型反向引物 | GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C |
参考文献
- Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Na....
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