本方案旨在对小鼠的心脏和肺进行脱细胞处理。所获得的细胞外基质（ECM）支架可通过免疫染色和成像，以绘制其组分的位置与拓扑结构图谱。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种小鼠心脏和肺组织的脱细胞化方案。该方法可制备出结构完整的细胞外基质（ECM）支架，用于分析ECM的拓扑结构和组成成分。该方案基于显微外科技术，通过对安乐死小鼠的气管和主动脉进行插管，灌注脱细胞试剂以处理心脏和肺组织。脱细胞后的心肺复合体可进一步进行免疫染色，以显示结构性ECM蛋白的分布位置。整个操作过程可在4天内完成。
通过本方案获得的细胞外基质（ECM）支架无尺寸形变。由于去除了细胞，可实现对ECM结构进行三维亚微米分辨率的结构观察。该方案适用于低至4周龄小鼠的健康及病变组织，包括纤维化和癌症小鼠模型，为研究心肺疾病相关的ECM重塑提供了途径。
引言
细胞外基质（ECM）是由蛋白质和聚糖构成的三维网络结构，存在于多细胞生物体的所有细胞周围，赋予器官特定形态，并在生物体整个生命周期中调控细胞行为1。从卵子受精开始，细胞不断构建并重塑细胞外基质，同时又受到其严格调控。本实验方案的目的是为小鼠细胞外基质的分析与图谱绘制提供一种可行方法，因为小鼠是哺乳动物病理生理学研究中最常用的模式生物。
该方法的开发源于对表征和分离与转移相关的天然细胞外基质（ECM）的需求2。由于肿瘤缺乏正常的解剖学血管化结构，且小鼠为相对较小的生物体，因此设计了显微外科手术，通过逆行导管插入主动脉，同时隔离通向肿瘤的主要血管（如肺静脉）的血液循环，从而集中试剂流动，实现肿瘤的脱细胞化。该方法可产生结构保持良好的ECM支架2，可用于免疫染色和成像，实现亚微米级精度的ECM结构图谱绘制。实施本方案需要掌握外科及显微外科技术（包括解剖、显微缝合和导管插入），这些技术要求可能成为该方法应用的潜在限制因素。据我们所知，该方法代表了当前用于天然ECM结构成像分析的最先进技术2,3。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所包含的所有实验程序均已通过哥本哈根大学实验医学伦理委员会的审查和批准，并符合丹麦及欧洲相关法律法规。为演示本实验方案，我们使用了8至12周龄的雌性BALB/cJ小鼠以及一只11周龄的雌性MMTV-PyMT小鼠。
注意：避免脱细胞 ECM 支架的细菌污染可获得最佳成像效果，并允许样本长期保存。因此，保持所有步骤的无菌状态至关重要。所有器械和手术材料，包括缝合线、显微缝合线、溶液、管路、鲁尔接头和导管，都必须保持无菌。所有表面（包括聚苯乙烯托盘）必须用 70% 乙醇消毒，灌注操作最好在层流罩内进行。除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
1. 尸检显微手术
- 使用 CO2 室处死小鼠。
- 将小鼠放入一个 4 L 的密闭室中，开始以 0.2 L/min 的流速通入 100% CO2，持续 2 分钟， 随后逐渐增加流速，至 3 分钟后达到 0.8 L/min。 小鼠通常在前 2 分钟内失去意识，随后呼吸停止（通常在约 5 分钟时发生，但可根据需要维持气流）。在进入下一步操作前，需确认小鼠已死亡。
- 使用毛发剪剃除小鼠胸部、腹部和背部的毛发，并用 70% 乙醇进行消毒。剃毛可显著减少因毛发残留在成像或生化分析样本上而造成的伪影。
- 将小鼠固定于聚苯乙烯托盘上，伸展其前肢、后肢、头部和尾部，并将其置于显微外科显微镜下。
- 使用直型梅奥剪刀，从下颌下区域至下腹部做皮肤切口，建立手术通路，并进行皮下分离，暴露胸壁和腹膜。
- 使用显微外科剪刀，沿胸壁两侧第六肋间隙切开胸大肌和胸小肌。
- 使用直型剪刀，沿前述切口剪开胸骨，然后沿胸骨长轴完成胸骨切开术，抬起并固定胸壁两侧，以暴露心肺复合体。
- 使用圆头显微镊（或杜蒙特显微镊），轻柔地牵拉并去除胸腺及其周围脂肪组织，从而暴露主要血管。
- 使用电凝器对下腔静脉进行电凝止血，并使用直型剪刀切断食管。
- 使用尖头显微镊，将头臂静脉以及头臂干、左颈总动脉和左锁骨下动脉从其下方组织中分离出来，以便进行结扎和电凝。
- 使用显微持针器、尖头显微镊和 9-0 缝线，在头臂干、左颈总动脉和左锁骨下动脉起始处上方分别缝合结扎。
- 对头臂静脉进行电凝止血。
- 沿中线分离下颌下唾液腺，暴露颈部肌肉和气管。进一步分离肌肉以暴露环甲膜。使用显微剪刀，切开该韧带以建立通路。
- 将 27 G 导管插入气管，并轻柔推进，直至气管分叉至支气管处（即遇到阻力后回撤 3 mm）。注意避免损伤支气管。使用 6-0 缝线，在气管周围缝合 3 道，以固定导管。
- 在第 12 胸椎水平处切断小鼠躯体。降主动脉位于脊柱前方，应在此处与脊柱一同切断。将下半部分移开备用。
- 逆行插管至主动脉，并推进导管直至到达主动脉弓。使用 9-0 缝线，在导管尖端下方 5 mm 处开始，围绕主动脉缝合 4 道。
2. 脱细胞化
- 使用硅胶管和鲁尔接头将小鼠连接至泵系统。以200 µL/min的流速灌注去离子水15分钟。在脱细胞过程中保持此流速。
- 更换灌注液为0.5%脱氧胆酸钠（DOC）去离子水溶液，持续灌注过夜。
- 更换灌注液为0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）去离子水溶液，灌注8小时。
- 使用去离子水持续灌注过夜，彻底清洗SDS和DOC，共24小时。
- 使用弯头剪刀切断脱细胞心脏和肺与胸腔的连接组织，将其切除，并置于含有去离子水、1%（v/v）青霉素-链霉素和0.3 µM叠氮化钠的无菌冻存管中，于4 °C保存。ECM支架至少可保存12周1。若支架将用于生化分析（如质谱分析），则需在液氮中快速冷冻。
3. 免疫染色
- 规划成像：确定一抗（或多种一抗）以及与之匹配的荧光标记二抗组合，确保其与荧光显微镜的激光谱线相适应。
- 将样品浸入含有6%（v/v）驴血清和3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的冻存管中，4℃孵育过夜以进行封闭。
- 在含3%驴血清的PBS溶液中加入一抗（或多种一抗），4℃孵育24小时。
- 用含0.05% Tween 20的PBS（PBST）溶液洗涤5次，每次1小时。
- 在含3%驴血清的PBS溶液中加入荧光标记的二抗（或多种二抗），4℃孵育24小时。
- 用0.05% PBST溶液洗涤5次，每次1小时，每次洗涤间隔1小时。
- 加入去离子水，置于4 °C避光保存。此时，支架样品已准备好进行成像。
4. 成像
- 将样品置于玻璃底培养皿中，并用两滴保存液（PBS 或去离子水）润湿样品。
- 准备物镜。建议使用水浸物镜。
- 使用荧光光源检查样品。
- 切换至计算机控制。打开激光器，并调节激光强度、针孔光阑、探测器波长、增益、分辨率和缩放倍数。设置 z 轴层扫的层数和步长，然后开始采集。建议使用多光子激光激发，以增强组织穿透能力，并最大限度减少光散射、光漂白和组织损伤。
5. 苏木精-伊红染色
- 从安乐死的小鼠中切除一个肺叶。
- 将其放入一个 10 mm × 10 mm × 5 mm 的冷冻模具中，并加入约 500 µL OCT 包埋剂覆盖组织。
- 在干冰上（-70 °C）速冻，并将样本保持在此温度下保存。
- 根据步骤 2.5 处理后的小鼠中取出一个脱细胞肺叶。
- 将脱细胞肺叶放入冷冻模具中，使最大表面朝下，并按照步骤 5.2 所述加入 OCT 包埋剂覆盖。
- 在干冰上（-70 °C）速冻，并将样本保持在此温度下保存，直至后续使用。样本可在该条件下储存至少 12 周。
- 在 -20 °C 下用冷冻切片机对冷冻组织块进行切片，厚度为 5 µm，将切片贴附于防脱玻片上，并在 -80 °C 下保存。
- 将玻片恢复至室温，自然晾干（约 20 分钟）。
- 短暂浸入 PBS 中，随后将玻片浸入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中固定 15 分钟。用 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟，再用蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟。
- 浸入 Mayer 苏木精溶液中染色 10 分钟。染色时间可根据组织来源和染液配制情况进行优化。
- 在 Coplin 染色缸中用流动的蒸馏水冲洗 10 分钟。
- 浸入伊红溶液中染色 7 分钟。染色时间可根据组织来源和染液配制情况进行优化。
- 用 50% 乙醇短暂浸洗以去除多余伊红，随后依次短暂浸入 70%、96% 和 100% 乙醇中各 30 秒进行脱水。再多次浸入二甲苯中透明。
- 滴加数滴 DPX 封片剂，盖上盖玻片。
- 将玻片置于化学通风橱中过夜干燥。
- 使用玻片扫描仪对玻片进行扫描。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
心肺脱细胞
成功完成该方案后，心脏和肺脏以及主动脉弓等附属组织将完全无细胞。可通过苏木精-伊红染色（图1）对细胞外基质支架进行验证，与天然组织相比，染色结果显示细胞核已被清除。这些支架保留了新鲜器官的尺寸，其不溶性细胞外基质结构保持完整2。图2展示了成功灌注小鼠心肺复合体所需关键手术步骤的示意图。
细胞外基质成像
在标准设置中，二抗可用于绿色、红色和远红荧光通道（即 488 nm、555 nm/594 nm 和 647 nm 波长检测）；结合使用双光子激发的二次谐波生成（SHG）成像可揭示纤维状胶原蛋白。激光激发可能引起组织自发荧光，在与绿色荧光联合使用时需谨慎，因其可能干扰成像数据。验证自发荧光的一种简...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
基于组织搅动的脱细胞技术会改变细胞外基质（ECM）结构，因此不适用于ECM结构分析4。灌注脱细胞技术通过解剖途径（如气管的主动脉）进行，可到达毛细血管床或终末肺泡，有助于将脱细胞试剂输送到整个器官。已有文献报道使用两性离子、阴离子和非离子型去污剂进行组织脱细胞4,5,6，然而，十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）可在小鼠脂肪垫中使纤维状胶原线性化2，但在肺组织中则不会；这表明必须根据目标组织优化去污剂的选择，以维持ECM结构。组织透明化方法理论上可用于ECM分析，但其使用的化学试剂可能改变ECM的交联状态和组织尺寸7,8,9。虽然获得的组织透明度可增强显微成像效果，但细胞的存...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢哥本哈根大学先进生物成像中心（CAB）的Ivana Novak教授和Nynne Meyn Christensen博士提供显微镜使用机会。本研究得到了欧洲研究理事会（ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN；AEM-G、OW、RR和JTE）；伦德贝克基金会博士奖学金（R286-2018-621；MR）；瑞典研究理事会（2017-03389；CDM）；瑞典癌症协会（Cancerfonden，项目号：CAN 2016/783、19 0632 Pj 和 190007；CDM）；德国癌症援助组织（Deutsche Krebshilfe；RR）；以及丹麦癌症协会（R204-A12454；RR）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微外科手术 | |||
| 6-0 缝线，三角形截面针头（Vicryl） | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 微型缝合线（Safil） | B Braun | G1048611 | |
| Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 带齿 Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| 卡斯特罗维霍显微持针器 | Fine Science Tools | 编号 12061-01 | |
| CO2 用于小鼠安乐死的通气室 | |||
| 去离子水（Milli-Q IQ 7000，超纯实验室水系统） | 默克 | ZIQ7000T0 | |
| 一次性聚苯乙烯托盘（~30 × 50 cm | |||
| 解剖显微镜（Greenough型，带双臂蛇形管） | Leica | S6 D | |
| 双头微型刮勺 | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont 显微镊（两把） | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont 显微镊，45° 提示（两个） | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 毛发剪 | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey持针器（带碳化钨钳口） | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| 静脉留置针（24 号，Insyte） | BD | 381512 | |
| 静脉注射用26号导管（Terumo） | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| 手术剪（坚韧切割型，直头） | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| 带环形尖端的微型镊子（两个） | Aesculap | FM571R | |
| 微型弹簧剪（Vannas，弯型） | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| 小型切割器 | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| 针头（27 号；Microlance） | BD | 21018 | |
| 无菌纸巾或手术巾 | |||
| 带齿剪刀（CeramaCut，直型） | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| 解剖刀片（Freer-Yasargil） | Aesculap | OL166R | |
| 注射器（1 mL；Plastipak） | BD | 3021001 | |
| 注射器（10 mL；Plastipak） | BD | 3021110 | |
| 手术剪（Walton） | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| 免疫染色 | |||
| Alexa Fluor 488 驴抗豚鼠 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA（牛血清白蛋白第V组分，标准级，冻干粉） | Serva | 11930.03 | |
| IV型胶原多克隆抗体（RRID: AB_2276457） | Millipore | AB756P | 宿主：兔 |
| PBS（pH 7.4，10×，Gibco） | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | 宿主：山羊 |
| periostin 多克隆抗体（Manuel Koch 惠赠，RRID:AB2801621） | 宿主：豚鼠 | ||
| 一次性手术刀，11号刀片（10个） | VWR | 233-5364) | |
| 血清（正常驴血清） | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 成像 | |||
| 探测器（Leica HyD S 型混合探测器和光电倍增管（PMTs）） | Leica | ||
| 荧光光源 | Leica | EL6000 | |
| 显微镜（倒置多光子显微镜） | Leica | SP5-X MP | |
| 目标（lambda蓝，20×，0.70 数值孔径（NA）IMM UV | Leica | HCX PL APO | |
| 双光子钛–sapphire激光器（Spectra-physics，Mai Tai DeepSee型号） | |||
| 白光激光器（WLL） | Leica | ||
| 脱细胞化 | |||
| 70% 乙醇（99.9% 绝对乙醇）；必须使用去离子水将绝对乙醇调节至 70%（体积/体积） | Plum | 1680766 | |
| 去离子水（Milli-Q IQ 7000，Ultrapure lab water system） | 默克 | ZIQ7000T0 | |
| 鲁尔接头转管路公接头（1/8 英寸） | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS（pH 7.4，10×，Gibco） | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 蠕动泵（12通道） | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| 硅胶管（内径 2 mm，外径 4 mm） | Ole Dich | 31399 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| 脱氧胆酸钠（DOC） | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E 染色 | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% 乙醇 | 梅 | 201446-5L | |
| 无水乙醇 | Plum | 201152-1L | |
| 盖玻片（24×50 mm；1000 片） | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds 中号（15 × 15 × 5 mm；100 个） | Tissue-Tek | 4566 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050S | |
| DPX封片剂 | Hounisen | 1001.0025 | |
| 0.5% 醇溶伊红Y溶液 | Sigma | 1024390500 | |
| 不锈钢C35羽毛式切片刀片（50片装） | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus 载玻片（25 × 75 mm；144 片） | Thermofisher | 6319483 | |
| 迈耶苏木精 | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT包埋剂 | VWR | 361603E | |
| 切片扫描仪（Nanozoomer） | 滨松光子 | ||
| 二甲苯 | Sigma | 534056-4L |
参考文献
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
