利用开放式血管窗和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗血管纹血流量

摘要

采用荧光示踪剂的开放式血管窗方法可提供足够的分辨率用于测量耳蜗血流（CoBF）。该方法有助于研究小鼠在正常和病理状态下CoBF的结构和功能变化。

摘要

声音转导具有较高的代谢需求，耳蜗侧壁微血管系统的正常功能对于维持内耳电位、离子转运和液体平衡至关重要。已有报道指出，多种类型的听力障碍与耳蜗内微循环异常有关。由于缺乏可行的检测手段以及难以接近内耳，研究耳蜗血流（CoBF）病理变化如何影响听力功能具有较大挑战性。通过在耳蜗侧壁建立开放的血管观察窗，结合荧光活体显微技术，已可用于在体研究CoBF的动态变化。, 但主要在豚鼠中应用，直到最近才在小鼠中实现。本文及配套视频介绍了用于观察小鼠耳蜗血流的开放血管窗方法。具体内容包括：1）制备荧光标记的小鼠血细胞悬液；2）在麻醉小鼠体内构建用于活体显微观察的开放血管窗；3）通过离线分析成像记录，测量血流速度和血流量。本方法以视频形式展示，说明如何在小鼠中采用开放窗技术，研究正常和病理状态下耳蜗微循环的结构与功能变化。

引言

耳蜗侧壁微循环（包括大部分螺旋韧带和血管纹中的毛细血管）的正常功能对维持听力至关重要¹。耳蜗血流（CoBF）异常参与多种内耳疾病的发生发展，包括噪声性听力损失、耳积水和老年性耳聋^{2,3,4,5,6,7,8,9}。 活体可视化耳蜗血流将有助于更深入理解听力功能与耳蜗血管病理之间的关联。

尽管耳蜗位于颞骨内，其结构复杂且位置深在，难以直接观察和测量耳蜗血流（CoBF），但目前已开发出多种评估CoBF的方法，包括激光多普勒血流仪（LDF）^10,11,12、磁共振成像（MRI）¹³、荧光活体显微成像（FIVM）¹⁴、荧光微内窥成像（FME）¹⁵、内窥式激光散斑对比成像（LSCI）¹⁶，以及通过向血液中注射标记物和放射性标记微球的方法（光学微血管成像，OMAG）^17,18,19,20。然而，除FIVM外，这些方法均无法实现对活体中CoBF变化的绝对实时追踪。FIVM结合耳蜗外侧壁的血管窗技术，已在不同实验条件下被多个实验室用于豚鼠，并经过验证^14,21,22。

已成功建立一种FIVM方法，用于研究小鼠耳蜗微循环的结构和功能变化，该方法采用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖作为对比剂，并使用荧光染料DiO（3,3′-二辛基氧羰花青高氯酸盐，绿色）或Dil（1,1-二辛基-3,3,3,3-四甲基吲 carbocyanine 高氯酸盐，红色）预先标记血细胞，以实现血管可视化和血流速度追踪。本研究中，描述了该方法在正常及病理条件下（如噪声暴露后）对小鼠耳蜗血流（CoBF）变化进行成像和定量分析的实验方案。该技术为研究人员提供了必要的工具，可用于探究与听力功能障碍及血管纹病理机制相关的CoBF基础机制，尤其适用于结合现有转基因小鼠模型进行研究的情况。

方案

注意：本实验为非存活手术。所有涉及动物使用的操作均经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理与使用委员会审查并批准 & 科学大学（IACUC批准编号：TR01_IP00000968）。

1. 荧光标记血细胞的制备

1. 麻醉供体小鼠（约6周龄的雄性C57BL/6J小鼠），通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液（5 mL/kg，参见 材料表).
   ​注意：该麻醉方案非常可靠，且能维持全身血压。
2. 将小鼠仰卧放置，打开 用镊子和解剖剪打开皮肤并暴露胸腔。剪开膈肌，用持针钳夹住胸骨基部，剪开肋骨，抬起以暴露心脏。 通过心脏穿刺采集1 mL血液至含肝素（15 IU/mL血液）的容器中，于3,000 × g 4 °C下离心3分钟。采血后通过颈椎脱位法处死小鼠。
3. 移除血浆，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤血细胞沉淀，并以 3000 × g 离心 3 次 g 4 °C 下 3 分钟
4. 用1 mL浓度为20 mM的DiO或Dil PBS溶液标记血细胞，在室温下避光孵育30分钟^23,24.
5. 离心并用 1 mL PBS 洗涤标记的血细胞，以 3000 × g 离心 3 次 g 4 °C下离心3分钟，然后将细胞沉淀重悬于约0.9 mL PBS中，调节至30%红细胞压积（终体积约1.3 mL），用于注射。

2. 创建开窗的手术操作 ²⁵

1. 准备无菌外科手术器械和成像平台，并在铺巾下方放置加热垫（图1A）。按照步骤1.1所述方法麻醉小鼠（约6周龄的雄性C57BL/6J小鼠），通过检测足部反射和总体肌张力来评估麻醉深度。将动物置于温热的加热垫上，并维持直肠温度在37 °C。
2. 将动物尾巴放入CODATM监测系统中以监测血压和心率（参见 材料表记录动物在麻醉状态下的收缩压、舒张压和平均动脉压（MBP）。
   注意：动物在麻醉与非麻醉状态下，平均血压无显著差异（107 ± 11 mmHg 对比 97 ± 7 mmHg）。麻醉状态下动物心率稳定，虽较非麻醉状态偏低（仍在正常范围内）（357 ± 12 bpm 对比 709 ± 3 bpm）。对于被固定束缚的动物，预期会出现轻微的心率升高²⁶.
3. 在体视显微镜下，通过外侧和腹侧入路打开左侧鼓泡 材料表），保留鼓膜和听小骨完整²¹.
   1. 将动物头部固定并调整位置以尽量减少移动，沿其颈部中线做一切口图1B切除左侧下颌下腺及二腹肌后腹并进行电凝止血。
      注意：术中皮下注射布托啡诺（buprenorphine），剂量为0.05 mg/kg，以减轻疼痛。
   2. 通过识别胸锁乳突肌和向前延伸至鼓室泡的面神经，定位并暴露骨性鼓室泡。
   3. 用30 G针头打开骨性鼓室，再用手术镊子小心去除周围骨质，以清晰暴露耳蜗和镫骨动脉；镫骨动脉的内侧缘位于圆窗隐窝边缘上方，并向前上方走行至卵圆窗图1C，D).
      注意：气管切开术旨在保持气道通畅，应 仅在动物手术期间出现呼吸问题时进行。通常情况下，大多数处于麻醉状态的动物呼吸平稳。然而，如果动物在手术期间接受了气管切开术，则所记录的血流数据应 不得用于任何比较。
4. 使用小型刀片（定制铣削的#16手术刀）刮除小鼠耳蜗顶回中段约距顶点1.25 mm处的侧壁骨，直至刮出一处薄弱点并使其破裂。用小型金属钩清除骨碎片图1E).
5. 用切割过的盖玻片覆盖血管窗，以维持正常的生理条件，并为记录血管图像提供光学观察视野。
   注意：所有操作均需谨慎进行。除监测体温外，还应在整个手术过程中监测动物的生命体征，包括血压和心率。

3. 在FIVM下对CoBF进行成像

1. 沿右侧隐静脉做长约1 cm的切口，暴露血管（图1F）。
2. 通过隐静脉依次向动物体内注入100 μL FITC-葡聚糖溶液（2000 kDa，40 mg/mL，溶于PBS）和100 μL血细胞悬液（红细胞压积30%），以实现血管可视化并追踪血流速度（图1G）。
3. 注射后5分钟，在视频监视器上实时观察血流情况。使用配备长工作距离（W.D.）物镜（W.D. 30.5 mm，10倍，数值孔径0.26）以及带有多波段激发滤光片和匹配发射滤光片的灯箱的荧光显微镜对血管进行成像（材料表）。采用高分辨率黑白数码电荷耦合器件相机（材料表）以每秒2帧的速度录制视频。每段视频采集超过350帧图像，以确保血流速度分析的成功率。
   注意：通过调节光学焦距，可对螺旋韧带和血管纹的血管进行成像（补充视频1）。

4. 视频分析

1. 使用适当的软件（材料表）测量血管直径，并确定所获图像中血管上两个固定点之间的距离。
2. 通过追踪标记的血细胞在图像位置间的空间移动距离，从捕获的视频帧中计算血流速度²⁷。
   1. 在软件中打开血流视频（本方案使用 Fiji [ImageJ]），并设置图像的比例尺。
   2. 使用追踪功能追踪选定的DiO染色血细胞。根据细胞移动的距离以及视频中图像帧之间的时间间隔，自动计算流速。
3. 根据以下公式计算体积流量（F）：F = V × A（V：流速；A：血管的横截面积）。

5. 噪声暴露

1. 将动物放入金属丝网笼中。在声暴露舱内，让其暴露于120 dB声压级的宽带噪声中，每次暴露3小时，次日再重复暴露3小时。
   注意：本实验室常规使用的这种噪声暴露方案可导致耳蜗敏感性的永久性丧失²⁸。

结果

在手术暴露耳蜗侧壁的毛细血管后（图1），可通过开放的血管窗利用活体高分辨率荧光显微镜观察FITC-葡聚糖标记血管中Dil标记的血细胞。图2A为FIVM下拍摄的代表性图像，显示小鼠耳蜗顶回至中回侧壁的毛细血管。这些血管的管腔因FITC-葡聚糖与血浆混合后产生的荧光而清晰可见。图像中还可清楚观察到分布在血管网络中的单个标记血细胞。根据位置可区分两种不同的毛细血管网络——螺旋韧带毛细血管和血管纹毛细血管（在直立显微镜下，血管纹位于螺旋韧带的光学下方，其毛细血管环更多，血管更细小²⁵）。通过调节光学焦距，可分别评估两者的血流情况。如图2B、C所示，螺旋韧带的血管密度较血管纹稀疏。

噪声暴露小鼠模型的血管...

讨论

本文演示了如何在FIVM系统下，通过开放式血管窗制备结合荧光标记方法，对小鼠模型耳蜗侧壁（包括血管纹）中的毛细血管进行可视化观察。小鼠模型因其作为哺乳动物模型在研究中具有广泛应用而被广泛使用和优先选择  人类健康与疾病。本文所述方案是一种可行的方法，利用FIVM系统下开放的血管窗对小鼠外侧壁（特别是血管纹）中的耳蜗血流（CoBF）进行成像和研究。该方法具有足够的分辨率，可通过荧光标记的血细胞作为示踪剂来测定血流速度和血流量（如图所示） 图 3 & 图 4）。该方法可用于多种不同应用，例如血管通透性评估和检查  周细胞收缩力，以及  追踪循环骨髓细胞迁移²⁵. 创伤、感染、噪声、异物、耳毒性药物或其他影响耳蜗侧壁的因素引起的耳蜗血流（CoBF）急性变化也可实时监测^25,29. 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠	Hospira	NDC 0409-1966-02	0.6 mL（配制成1 mL）
1,1′-二辛基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐	Sigma Aldrich	468495	20 µM
3,3′-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐（Dio）（3,3′-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐）	Sigma Aldrich	D4292	20 µM
CODA 监测系统	Kent Scientific		CODA 监测仪，用于监测血压和心率
盖玻片	Fisher Scientific	12-542A
直流温度控制器	FHC	40-90-8D
Fiji/ImageJ	NIH		血管直径测量
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（2000 kDa）	Sigma Aldrich	FD2000s	40 mg/mL
肝素钠注射液，USP 多剂量小瓶	Mylan	NDC 67457-374-12	5000 USP 单位/mL
Katathesia（100 mg/mL）	Henry Schein	NDC 11695-0702-1	0.2 mL（配制成1 mL）
显微镜物镜	Mitutoyo	378-823-5	型号：M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER 相机	Hamamatsu		型号：C4742-80-12AG
PBS	Gibco	2085387
Xyzaine（100 mg/mL，使用时稀释5倍）	Lloyd	LPFL04821	0.2 mL（配制成1 mL）
变倍体视显微镜	Olympus		型号：SZ61，荧光显微镜