采用荧光示踪剂的开放式血管窗方法可提供足够的分辨率用于测量耳蜗血流（CoBF）。该方法有助于研究小鼠在正常和病理状态下CoBF的结构和功能变化。
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本文内容
摘要
摘要
声音转导具有较高的代谢需求，耳蜗侧壁微血管系统的正常功能对于维持内耳电位、离子转运和液体平衡至关重要。已有报道指出，多种类型的听力障碍与耳蜗内微循环异常有关。由于缺乏可行的检测手段以及难以接近内耳，研究耳蜗血流（CoBF）病理变化如何影响听力功能具有较大挑战性。通过在耳蜗侧壁建立开放的血管观察窗，结合荧光活体显微技术，已可用于在体研究CoBF的动态变化。, 但主要在豚鼠中应用，直到最近才在小鼠中实现。本文及配套视频介绍了用于观察小鼠耳蜗血流的开放血管窗方法。具体内容包括：1）制备荧光标记的小鼠血细胞悬液；2）在麻醉小鼠体内构建用于活体显微观察的开放血管窗；3）通过离线分析成像记录，测量血流速度和血流量。本方法以视频形式展示，说明如何在小鼠中采用开放窗技术，研究正常和病理状态下耳蜗微循环的结构与功能变化。
引言
耳蜗侧壁微循环（包括大部分螺旋韧带和血管纹中的毛细血管）的正常功能对维持听力至关重要1。耳蜗血流（CoBF）异常参与多种内耳疾病的发生发展，包括噪声性听力损失、耳积水和老年性耳聋2,3,4,5,6,7,8,9。 活体可视化耳蜗血流将有助于更深入理解听力功能与耳蜗血管病理之间的关联。
尽管耳蜗位于颞骨内，其结构复杂且位置深在，难以直接观察和测量耳蜗血流（CoBF），但目前已开发出多种评估CoBF的方法，包括激光多普勒血流仪（LDF）10,11,12、磁共振成像（MRI）13....
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方案
注意：本实验为非存活手术。所有涉及动物使用的操作均经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理与使用委员会审查并批准 & 科学大学（IACUC批准编号：TR01_IP00000968）。
1. 荧光标记血细胞的制备
- 麻醉供体小鼠（约6周龄的雄性C57BL/6J小鼠），通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液（5 mL/kg，参见 材料表).
注意：该麻醉方案非常可靠，且能维持全身血压。 - 将小鼠仰卧放置，打开 用镊子和解剖剪打开皮肤并暴露胸腔。剪开膈肌，用持针钳夹住胸骨基部，剪开肋骨，抬起以暴露心脏。 通过心脏穿刺采集1 mL血液至含肝素（15 IU/mL血液）的容器中，于3,000 × g 4 °C下离心3分钟。采血后通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 移除血浆，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤血细胞沉淀，并以 3000 × g 离心 3 次 g 4 °C 下 3 分钟
- 用1 mL浓度为20 mM的DiO或Dil PBS溶液标记血细胞，在室温下避光孵育30分钟23,24.
- 离心并用 1 mL PBS 洗涤标记的血细胞，以 3000 × g ....
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结果
在手术暴露耳蜗侧壁的毛细血管后（图1），可通过开放的血管窗利用活体高分辨率荧光显微镜观察FITC-葡聚糖标记血管中Dil标记的血细胞。图2A为FIVM下拍摄的代表性图像，显示小鼠耳蜗顶回至中回侧壁的毛细血管。这些血管的管腔因FITC-葡聚糖与血浆混合后产生的荧光而清晰可见。图像中还可清楚观察到分布在血管网络中的单个标记血细胞。根据位置可区分两种不同的毛细血管网络——螺旋韧带毛细血管和血管纹毛细血管（在直立显微镜下，血管纹位于螺旋韧带的光学下方，其毛细血管环更多，血管更细小25）。通过调节光学焦距，可分别评估两者的血流情况。如图2B、C所示，螺旋韧带的血管密度较血管纹稀疏。
噪声暴露小鼠模型的血管.......
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讨论
本文演示了如何在FIVM系统下，通过开放式血管窗制备结合荧光标记方法，对小鼠模型耳蜗侧壁（包括血管纹）中的毛细血管进行可视化观察。小鼠模型因其作为哺乳动物模型在研究中具有广泛应用而被广泛使用和优先选择 人类健康与疾病。本文所述方案是一种可行的方法，利用FIVM系统下开放的血管窗对小鼠外侧壁（特别是血管纹）中的耳蜗血流（CoBF）进行成像和研究。该方法具有足够的分辨率，可通过荧光标记的血细胞作为示踪剂来测定血流速度和血流量（如图所示） 图 3 & 图 4）。该方法可用于多种不同应用，例如血管通透性评估和检查 周细胞收缩力，以及 追踪循环骨髓细胞迁移25. 创伤、感染、噪声、异物、耳毒性药物或其他影响耳蜗侧壁的因素引起的耳蜗血流（CoBF）急性变化也可实时监测25,29.
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）R21 DC016157（X.Shi）、NIH/NIDCD R01 DC015781（X.Shi）和 NIH/NIDCD R01-DC010844（X.Shi）资助。 俄勒冈健康与科学大学（OHSU）医学研究基金会（X.Shi）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠 | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL（配制成1 mL） |
| 1,1′-二辛基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐 | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐（Dio）（3,3′-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐） | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA 监测系统 | Kent Scientific | CODA 监测仪，用于监测血压和心率 | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-542A | |
| 直流温度控制器 | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | 血管直径测量 | |
| 异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（2000 kDa） | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| 肝素钠注射液，USP 多剂量小瓶 | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP 单位/mL |
| Katathesia（100 mg/mL） | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL（配制成1 mL） |
| 显微镜物镜 | Mitutoyo | 378-823-5 | 型号：M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER 相机 | Hamamatsu | 型号：C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine（100 mg/mL，使用时稀释5倍） | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL（配制成1 mL） |
| 变倍体视显微镜 | Olympus | 型号：SZ61，荧光显微镜 |
参考文献
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A.,....
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