使用高内涵成像分析评估心脏重编程

Summary

我们提出了一种方案，使用高内涵成像分析在体外量化直接重编程诱导的心肌细胞样细胞 （iCM）。这种方法使我们能够以自动方式量化心脏重编程的效率，并直接可视化 iCM。

Abstract

该方案的目标是描述一种量化诱导的心肌细胞样细胞 （iCM） 的方法，这些细胞通过重编程技术在体外直接重编程。心脏重编程提供了一种产生新心肌细胞的策略。通过将核心心源性转录因子引入成纤维细胞;成纤维细胞可以转化为 iCM，而无需通过多能干细胞状态进行转换。然而，成纤维细胞向 iCM 的转化率仍然很低。因此，还有许多其他方法可以提高心脏重编程效率。这些研究中的大多数使用流式细胞术评估了心脏重编程效率，同时进行了免疫细胞化学以可视化 iCM。因此，至少需要两组单独的重编程实验来证明 iCM 重编程的成功。相比之下，自动化高内涵成像分析将提供相对较少细胞的 iCM 重编程的定量和鉴定。使用这种方法，可以通过一次重编程实验直接评估 iCM 的数量和质量。这种方法将能够促进未来需要大规模重编程实验的心脏重编程研究，例如筛选遗传或药理学因素以提高重编程效率。此外，高内涵成像分析方案的应用不仅限于心脏重编程。它可应用于其他细胞谱系的重编程以及任何需要免疫染色细胞定量和可视化的免疫染色实验。

Introduction

心脏重编程已被开发为干细胞介导的产生新心肌细胞的方法的替代方法。鉴于它不通过干细胞状态进行转化，因此它很有可能绕过干细胞介导的方法中的一些遗传限制。已经表明，至少三种或四种心源性转录因子的病毒感染成纤维细胞可以通过消除成纤维细胞基因程序并重建成纤维细胞中的心源性转录网络来将成纤维细胞转化为心脏命运 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^， 11,12,13,14,15,16,17。

自从第一项具有里程碑意义的研究证明体外心脏重编程^{以来，心脏}重编程方案已经通过大量研究进行了优化 ^{3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18}.评估心脏重编程后成纤维细胞心脏表型的常见技术方法是流式细胞术分析，用于量化表达特定心肌细胞标志物的细胞，以及免疫细胞化学，用于在单个细胞水平上可视化这些细胞。尽管这两个实验（即流式细胞术和免疫细胞化学）都是为了证明使用相同抗体的心肌细胞标志物的表达，但它们必须单独进行。此外，流式细胞术需要相对更多的细胞，从而增加了实验所需的试剂量。或者，心肌细胞标志物阳性细胞可以通过免疫细胞化学后的手动计数进行定量。但是，它非常耗费人力，而且往往不太准确。

该协议的目的是描述通过使用自动高内涵成像分析的单个免疫染色实验来量化和可视化 iCM 的方法。它需要相对较少的起始细胞，因为该方案是在 24 孔板的孔中进行的。最多可以同时使用三个不同的标记。可以自动定量单、双和三阳性细胞。除了免疫染色细胞的定量外，高内涵成像分析还提供高质量的 2-100 倍客观图像。如有必要，用于高内涵成像分析的相同免疫染色细胞可以重新用于进一步的成像研究，例如共聚焦显微镜检查。该协议的主要优点是它不仅提供了细胞数量少得多的 iCM 的无偏倚定量，而且还提供了 iCM 的可视化。此外，该方案可用于评估非心脏谱系重编程（例如，iPSC、神经元和肝细胞重编程）。

Protocol

所有动物程序均经范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准进行。

1. 逆转录病毒生成和体外心脏重编程

1. 在补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、1 μg/mL 嘌呤霉素和 10 μg/mL 杀稻瘟菌素的 DMEM 中培养铂 E 细胞，直到铂 E 细胞汇合度达到 70%–80%。
2. 在第 1 天，将 ~0.55 x 10⁶ 个细胞（第一个孔）和 ~0.18 x 10⁶ 个细胞（第二个孔）接种到第一个转染前一天，用 1 mL 补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 接种到 12 孔板的两个单独孔中。
   注:根据实验所需的病毒培养基量，可以使用不同大小的培养皿。有关其他实验规模，请参阅 表 1 。
3. 第 2 天，将编码先前研究⁹ 中描述的 Mef2c、Gata4、Tbx5 和 Hand2 的四顺反子 M-G-T-H 逆转录病毒构建体或空载体转染到第一个孔的铂 E 细胞中。向 30 μL 减血清培养基中加入 3 μL 转染试剂。5 分钟后，将 1 μg 逆转录病毒构建体或空载体加入转染试剂和减血清培养基的混合物中。在室温下孵育 20 分钟后，将混合物添加到 Platinum E 细胞中。
4. 在第 3 天，转染后 16-20 小时，去除培养基并补充补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的新鲜 DMEM。
5. 在第 3 天，即第一次转染后 24 小时，将第二次转染到第二个孔中，如步骤 1.3 所述，在第 1 天接种铂 E 细胞。
6. 第 3 天，将从 Titin-GFP 报告基因敲入小鼠¹⁹ 中分离的 ~5 x 10⁴ 个冷冻小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 接种到 24 孔板的孔中。总共需要两个 24 孔板孔（即，未感染的对照和 M-G-T-H 感染）。
   注:铺板的 MEF 数量可能需要调整，因为冷冻 MEF 的回收率可能因细胞冷冻条件而异。接种细胞后每天约 10% 的汇合度足以进行重编程。使用新鲜的未冷冻 MEF 可以提高重编程效率。
7. 在第 4 天，即第二次转染后 16-20 小时，去除培养基并补充补充有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的新鲜 DMEM。
8. 第 4 天，第一次转染后 48 小时，使用 5 mL 注射器在 Platinum E 细胞的第一个孔中收集病毒培养基，并通过 0.45 μm 聚醚砜 （PES） 膜过滤器过滤。去除 MEF 上的成纤维细胞生长培养基，并用补充有 6 μg/mL 聚凝胺的病毒培养基替换它们（第一次感染）。
9. 在第 5 天，第二次转染后 48 小时，按照步骤 1.8 中的说明，使用第二个孔中的病毒培养基进行第二次感染。
10. 在第 6 天，第二次感染后 24 小时，将病毒培养基替换为由 DMEM/199 （4:1）、10% FBS、5% 马血清、1% 青霉素/链霉素、1% 非必需氨基酸、1% 必需氨基酸、1% B-27、1% 胰岛素 - 硒 - 转铁蛋白、1% 维生素混合物和 1% 丙酮酸钠、1 μM SB431542和 0.5 μm A83-01 组成的心脏诱导培养基。每三天更换一次心脏诱导培养基，直到收获细胞。

2. 免疫染色

1. 感染后 14-15 天，将细胞固定在含 2% 多聚甲醛的 24 孔板上 15 分钟。
2. 用透化缓冲液（PBS 中的 0.05% Triton-X）透化固定细胞，每 5 分钟用透化缓冲液洗涤细胞 3 次。
3. 将细胞与通用封闭缓冲液孵育 45 分钟。
4. 在室温下将细胞与小鼠 α-肌动蛋白（1:400 稀释）和鸡 GFP 抗体（1:400 稀释）孵育 1.5 小时。
   注:约 150 μL 抗体溶液可覆盖 24 孔板的整个孔区域。
5. 用透化缓冲液洗涤细胞 5 分钟 3 次。
6. 在室温下将细胞与抗小鼠 Alexa-555 和抗鸡 Alexa-488 二抗（1:400 稀释）孵育 1 小时
7. 用透化缓冲液洗涤细胞 5 分钟 3 次。
8. 将 2.5 μL DAPI 溶液添加到 250 μL 透化缓冲液中。

3. 高内涵成像

1. 打开成像系统。
2. 打开关联的软件。
3. 登录系统。
4. 在任务栏上，选择 Run a Plate（运行 Plate）。
5. 单击 "开门-弹出板 "打开机器上的门并放入板。确保板的方向正确。单击 Close Door-Load Plate 以关闭门。
6. 单击 Load Plate Settings。选择模板协议，然后单击 Load From DB。
7. 单击 Acquisition Setup。
8. 在 Plate Acquisition Setup 对话框中，单击 Configure。
9. 在 Objective and Camera （物镜和相机） 选项卡中，选择 10x 物镜。
10. 在 Plate （板 ） 选项卡中，选择一个 24 孔板。
11. 在"站点选项"的"要访问的站点"选项卡中，选择"固定站点数"，通过选择列和行中的数字来确定成像站点的数量。通过在列中选择 6 个，在行中选择 6 个，总共使用 36 个成像站点。选择每个成像部位之间的间距（即 500 μm）。
12. 在 Acquisition 选项卡中，将波长数设置为 3。
13. 在 Illumination 的 Wavelengths 选项卡中，为每个波长分别选择 DAPI、FITC 或 Texas Red。
14. 单击 "运行 "选项卡，然后为板设置"文件夹名称"和"板名称"。 单击板图上的孔进行成像，然后单击 Calculate 以设置每个波长的焦点偏移。首先设置 DAPI 的 foucs 偏移量。单击 Auto Expose 以自动设置每个波长的曝光时间。然后，单击 Acquire Plate 开始对所选位点进行成像。

4. 高内涵成像分析

1. 完成高内涵成像后，单击 "筛选 "菜单，然后选择 "查看板数据" 以选择要分析的板。
2. 单击 Select Plate。在 Select Plate for Review 对话框中，打开文件夹并选择保存在数据库中的板，然后单击 Select。
   注意:要显示图像，请在 Wavelengths 字段中选择 DAPI、FIT 和 Texas Red。在 Sites 字段中，选择 All Sites。单击所选 36 个站点中的一个站点，将其显示在每个波长图像窗口中，然后单击 Look-Up Table（查找表）为波长选择颜色。使用键盘上的 Print Screen 键并将图像粘贴到照片编辑软件（例如 Paint 和 Photoshop）中以保存它。
3. 单击 Run Analysis，然后选择模板设置。
4. 单击 Configure Settings ，然后单击 Number of Wavelengths。选择三个波长（即， DAPI 用于细胞核染色， Teaxs Red 用于α-肌动蛋白， FITC 用于Titin-GFP）。
5. 使用工具栏中的 线条 工具，测量单元格短轴上的宽度。根据测得的细胞宽度，设置"近似最小宽度"和"近似最大宽度"以包括所选成像部位中的大多数细胞。
6. 单击 Preview 以检查是否选择了几乎所有的原子核。选定的细胞核呈白色，而未选择的细胞核保持蓝色（DAPI 染色）。如有必要，请调整"Approximate min width（近似最小宽度）"和"Approximate max width（近似最大宽度）"。
7. 要设置 Intensity Above Local Background，请将鼠标光标放在单元格内部和外部。强度值显示在窗口底部。略微降低暗淡细胞的强度，以均匀地显示每个细胞的整个区域的强度。将此强度值定义为 Intensity Above Local Background 值。需要为每个通道单独设置此值。
8. 单击 Screening 菜单，然后选择 Plate Data Utilities。在 Plate Data Utilities 对话框中，单击 Run Analysis 以选择板。
9. 在 Settings 字段中，选择保存的分析设置;选择 Add to Auto Run List（添加到自动运行列表），然后单击 OK（确定 ）以运行分析。
10. 分析完成后，单击 Screening 菜单并选择 Plate Data Utilities。然后，在 Plate Data Utilities 对话框中，单击 Export Measurements 以导出分析结果。
11. 单击 Cell and Image Measurements（细胞和图像测量）， 然后单击 OK（确定）。
12. 在 Export Measurements Wizard - Step 1 页面上，选择板，然后单击 Next。
13. 在 Export Measurements Wizard - Step 2 页面上，单击 Finish。
14. 在"配置数据导出"页面上，选择数据类型（即井名称、总细胞数、^DAPI+ 的小计细胞数、Texas Red⁺ 的小计细胞数、FITC⁺ 的小计细胞数、^DAPI+Texas Red⁺ 的小计细胞数、DAPI⁺FITC⁺ 的小计细胞数、DAPI^+FITC+Texas Red⁺ 的小计细胞数、DAPI⁺ 细胞百分比、 DAPI⁺Texas Red⁺ 细胞的百分比、DAPI⁺FITC⁺ 细胞的百分比和 DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺ 细胞的百分比），然后单击确定。
15. 在 Export as text file 页面上，选择保存文件的目标，然后单击 OK。
16. 在 Microsoft Excel 中打开文件。结果将由每个站点呈现（表 2）。每孔有 36 个站点。使用分析工具 Pivot Table 汇总 36 个位点的数据（即所有 36 个位点中细胞数的总和和指示细胞百分比的平均值）（表 3）。

Results

在重编程实验之后，我们使用如上所述的高内涵成像分析对 iCM 进行了定量。 图 1 显示了用于高内涵成像分析的 36 个成像位点的合成图像。在这些实验中，iCMs 被定义为双阳性细胞 （α-肌动蛋白⁺Titin-eGFP⁺）。高内涵成像分析显示，~26% 的细胞在 M-G-T-H 转导后表现出两种心脏标志物，而 ~1% 的空载体转导对照细胞显示双阳性细胞。单个 iCM 在高内涵成像系统拍摄的 10 倍图像中可视化（图 2）。

图 1:自动高内涵成像分析的代表性合成图像。 从 Titin-GFP 敲入小鼠中分离的 MEFs 用 M-G-T-H 构建体或空载...

Discussion

之前的重编程研究使用流式细胞术评估了重编程效率，并在两个独立的实验中使用免疫细胞化学证明了 iCM 的结构质量。流式细胞术分析需要大量起始细胞，从而增加了实验规模。相比之下，高内涵成像分析可以通过对相对较少的细胞进行单次实验来评估 iCM 重编程的质量和数量。因此，这种新方法可以为未来的重编程研究提供一个高效的新技术平台。特别是，这种新方法将用于筛选新的遗传或药理因子的重编程实验。为了测试大量因子，可以将分析格式缩小到 384 孔格式。

转导效率与重编程效率直接相关。在以前的研究中，我们已经表明，确保所有重编程因子在成纤维细胞中的表达对于实现高重编程效率非常重要 ^8,9。由于相对较少的成纤维细胞通过转导单个病毒载体表达所有重编程因子，因此使用包含所有重编程因子的单个多顺反子载体有利于提高重编程效率 ^7,9

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
抗鸡 Alexa 488	Thermofisher	A11039
抗 GFP 抗体	Invitrogen	A10262
抗小鼠 Alexa 555	Thermofisher	A21422
抗 α-肌动蛋白抗体	Sigma	A7811
DAPI 溶液	Vector 实验室	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
胰岛素-转铁蛋白-硒 G 补充剂	Invitrogen	41400-045
培养基 199	Invitrogen	11150059
MEM 维生素溶液	Invitrogen	11120-052
MetaXpress 软件	分子装置
Micro XL自动化细胞成像系统	分子装置
最低必需氨基酸溶液	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES 过滤器（0.45 µm）	Thomas scientific	1159T84
Platninum E 细胞	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
通用封闭缓冲液	BiogeneX	HK083-50K