本方案介绍了一种利用在线自由基剂量测定和等离子体光源进行闪光氧化蛋白质足迹分析的方法。该方法取代了具有潜在危险的紫外激光，从而简化了蛋白质快速光化学氧化研究的操作，并提高了其实验重复性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种新兴且前景广阔的高级结构分析技术，可提供有关蛋白质结构变化、蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-配体相互作用的信息。HRPF利用羟基自由基（▪OH）对蛋白质溶剂可及表面进行不可逆标记。由于其内在复杂性、高昂成本以及操作过程中的危险性，HRPF在生物制药领域的广泛应用受到显著限制。这些限制因素包括：1）使用复杂、危险且昂贵的激光器，需要采取大量的安全防护措施；2）由于▪OH被背景物质清除而导致HRPF实验不可重复，限制了比较研究的开展。本出版物提供了一种无需激光的HRPF系统的操作方案。该无激光HRPF系统采用高能、高压等离子体光源闪光氧化技术，并结合在线自由基剂量测定。等离子体光源在生成羟基自由基方面比基于激光的HRPF系统更安全、更易于使用且效率更高，而在线自由基剂量计则提高了实验的可重复性。综上所述，无激光HRPF系统有效解决了基于激光技术所存在的上述缺点与局限性。
引言
蛋白质构象及其相关的高级结构（HOS）是决定其正常生物学功能和异常行为的主要因素1。这一原则同样适用于生物制药，其结构和功能活性依赖于生产过程和环境的多个方面。生物制药HOS的变化已被证实与不良药物反应（ADR）相关，这些反应源于非期望的药理作用以及患者的免疫应答2,3。ADR的出现使生物制药行业意识到蛋白质HOS在生物治疗药物安全性和有效性中的关键作用，并促使业界提出对新型和改进型HOS分析技术的迫切需求4。
羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种用于追踪蛋白质高级结构（HOS）变化的有前景的技术。HRPF通过▪OH对蛋白质表面进行不可逆标记，随后结合质谱（MS）分析，以鉴定蛋白质的溶剂可及表面5,6,7。HRPF已成功用于检测蛋白质高级结构及其功能的缺陷8,9，表征单克隆抗体（mAb）的高级结构10
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 安装毛细管
- 使用石英切割石将内径（ID）为 250 µm 的石英毛细管切割至 27 英寸长。检查毛细管两端是否切口平整、平直。
- 通过烧除聚酰亚胺涂层，制备两个长度约为 15 mm 的窗口。从“下端”开始，第一个光解窗口位于距“下端” 90 mm 处，第二个剂量计窗口位于距“下端” 225 mm 处。
注意：一旦涂层被烧除，毛细管将变得非常脆弱。 - 拧松 5 号端口的螺母和卡套，并将毛细管的“下端”插入，使其略微超过卡套的锥形末端（图 1A）。
- 在光解模块上，将光解池盖直接向外拔出以取下，然后取下磁性固定的金属掩模，该掩模用于固定毛细管。
警告：光解池盖内部有一个曲面镜，切勿让任何物体接触镜面。 - 在剂量计模块上，通过按压左侧的卡舌打开剂量计池，并将剂量计池向右旋转打开。取下用于固定毛细管的磁性固定夹。
- 将毛细管放入光解池底部的带槽通道中，使毛细管窗口与光解池窗口居中对齐。用一只手固定毛细管位置的同时，装上磁性掩模以固定毛细管。将光解池盖重新安装到位。
- 将毛细管放入剂量计池底部的带槽通道中，使第二个毛细管窗口与剂量计池底中心的小孔对齐。用一只手固定毛细管位置的同时，将两个磁性夹安装到位以固定毛细管。关闭剂量计池，直至听到咔嗒声表示已闭合。
- 将毛细管穿过产物收集器毛细管升降装置顶部的滚花螺母（....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
高压等离子源与实时剂量测定相结合，可更精确地控制▪OH的产率，从而更准确地观察蛋白质高级结构的变化。添加腺嘌呤可实现有效的实时自由基剂量监测。腺嘌呤在被氧化后，其在265 nm处的紫外吸收会降低（图2A）。腺嘌呤吸光度的变化与可用于HRPF反应的自由基浓度直接相关，因此可在存在缓冲液、辅料和配体等自由基清除剂的情况下，有效监测自由基浓度的变化（图2B）。
在100 mM H2O2 和 1 mM 腺嘌呤存在下，肌红蛋白脱辅基蛋白（aMb）在四种逐渐升高的等离子体电压条件下进行了修饰（图3）。检测到六个肽段的氧化程度随腺嘌呤在265 nm处紫外吸收值的变化呈线性增加。腺嘌呤的紫外吸收是有效▪OH浓度的替代指标。氧化程度与自由基浓度变化之间的线性关系证实了标记过程中蛋白质高级结构未发生人为假象的改变。此外，使用高压等离子体源.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在任何氢自由基标记实验（HRPF）中，为确保蛋白质标记的准确性，有几个关键步骤需要注意。首先，需选择适当的流速和光源闪光频率，以确保样品的每个流份仅被照射一次。这可以保证蛋白质仅暴露于一次新生成的▪OH自由基脉冲中。一旦蛋白质被氧化，其高级结构可能发生改变。为了确保探测的是蛋白质的天然结构，每个蛋白质分子必须在单一瞬间内完成修饰。可通过剂量学方法来验证是否探测到了天然蛋白质结构：如果探测的是天然结构，则随着羟基自由基浓度的增加，氧化程度呈线性上升；然而，若高浓度的羟基自由基导致蛋白质在标记过程中发生部分去折叠，则氧化程度将显著增加，从而提供一种有效手段来确认实验是否在天然结构条件下进行。
确保适当终止反应也至关重要。这包括在标记过程中将适当的自由基清除剂与蛋白质混合。在本方法中，腺嘌呤不仅用于剂量测定，还能清除▪OH，从而限制自由基的寿命，同时实现对蛋白质的标记。通过限制自由基的寿命，可以更有把握地确认天然蛋白质结构正在被修饰。在完成标记过程后，重要的是将样品收集至含有过氧化氢酶和甲硫氨酸酰胺的淬灭溶液中，以分解过量的H2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
E.E.C.、J.S.S. 和 S.R.W. 披露其在 GenNext Technologies, Inc. 拥有重大经济利益，该公司是一家致力于将高阶蛋白质结构分析技术商业化的早期企业。所提供的代表性数据已由无财务利益冲突的 S.K.M. 审核。
致谢
本工作由美国普通医学科学研究所资助（R43GM125420 和 R44GM125420）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-959-53A | 任何品牌均可满足要求 |
| 50 µL SGE 耐压注射器 | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 纳米柱（0.75 mm × 150 mm，2 µm） | Thermo Scientific | ||
| 含 0.1% 甲酸（v/v）的乙腈，LC/MS 级 | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| 脱辅基肌红蛋白 | Sigma-Aldrich | ||
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| 离心机 | Eppendorf | 022625501 | |
| 精密任务擦拭纸 | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 过氧化氢 | Fisher Scientific | H325-100 | 任何 30% 的过氧化氢均可满足要求 |
| 甲硫氨酸酰胺 | Chem-Impex | 03109 | |
| 微量离心机 | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪 | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | 其他高分辨仪器（例如 Q Exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）也可使用 |
| Pierce 胰蛋白酶，MS 级 | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro 切割石，1" × 1" × 1/32” | Molex | 1068680064 | 任何毛细管切割器均可满足要求 |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| 含 0.1% 甲酸（v/v）的水，LC/MS 级 | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| 水，LC/MS 级 | Fisher Scientific | W6-4 |
参考文献
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
