本实验方案描述了研究两种在人类健康中具有重要作用的模型蛋白质结构与动力学特性的方法。该技术结合了台式生物物理表征与中子自旋回波谱学，可在与蛋白质结构域间运动相关的时间和长度尺度上探测其动力学行为。
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摘要
摘要
大多数人体蛋白质的活性和功能与蛋白质晶体结构中整个亚结构域的构型变化相关。晶体结构是描述蛋白质结构或动力学的任何计算的基础，通常具有较强的几何限制。然而，这些来自晶体结构的限制在溶液中并不存在。由于环区或亚结构域在皮秒到纳秒时间尺度上的重排（即蛋白质内部动力学时间范围），溶液中蛋白质的结构可能与晶体结构不同。本研究描述了如何利用中子散射技术探测数十纳秒时间尺度上的缓慢运动。特别是，通过中子自旋回波谱学（NSE）结合一系列实验室表征方法，对两种主要的人体蛋白质——一种缺乏明确定义的二级结构的内在无序蛋白和一种经典的抗体蛋白——进行了动力学表征。通过数学建模来描述实验中获得的中子数据，并确定扩散运动与蛋白质内部运动之间的转变，从而进一步揭示了蛋白质结构域的动力学特性。从中子自旋回波实验获得的中间散射函数中提取出内部动力学贡献，包括各种运动的时间尺度，有助于进一步理解单个蛋白质的力学性质以及在接近天然环境的拥挤蛋白溶液中蛋白质的柔韧性。
引言
利用中子探测软物质的动力学
研究蛋白质和多肽的动力学特性是生物物理研究的重要组成部分，目前已有多种成熟的方法可用于探索广泛的能量图景1。将实验揭示的蛋白质动力学与其生物学功能相关联则是一项更为艰巨的任务，需要复杂的数学模型和计算机辅助的动力学模拟。中子谱学在分析蛋白质运动方面的重要性已在多项广受认可的研究中被强调1,2,3,4,5。在深入探讨蛋白质内部动力学所涉及的多样化能量图景之前，有必要简要概述软物质中的动力学过程以及中子如何探测这些过程。
中子对同位素构型的敏感性及其与软物质相互作用的类型，使得中子散射成为最通用的探测技术之一6。中子能够探测的关联长度尺度和关联时间范围非常广泛，从核激发和原子振动，到集体运动以及各向同性旋转和扩散运动等缓慢弛豫过程。在研究散射中子的能量转移时，可以区分出三种主要的相互作用：弹性散射，即入射中子与样品中的粒子之间没有能量交换；非弹性散射，中子与粒子之间发生显著且可量化的能量交换；以....
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方案
本研究表征了两种蛋白质：一种常规的人源抗体蛋白IgG，以及一种内在无序的MBP蛋白。这些蛋白质的冻干粉购自商业来源（见材料表）。
1. 蛋白质样品制备
- 通过称量并分别将固体试剂溶解于重水（D2O）中，配制 50 mM 磷酸钠 + 0.1 M 氯化钠缓冲液（参见材料表）。此为IgG的氘代缓冲溶剂。
- 将缓冲液的pH值调节至6.6。
- 通过称量并分别将固体组分溶解于重水（D2O）中，配制 20 mM 磷酸钠 + 6 M 尿素缓冲液。此为MBP的氘代缓冲溶剂。
- 将缓冲液的pH值调节至4.7。
- 使用孔径为0.2 µm的滤膜过滤缓冲溶剂（参见材料表）。
- 将纯化的蛋白冻干粉末称量后，分别溶于对应的氘代溶剂（步骤1.1–1.2）中，配制成高蛋白浓度（约50 mg/mL）的溶液。
- 将蛋白溶液装入带有3.5 K MWCO透析膜的透析篮中，在过滤后的缓冲液中透析24小时，MBP在10 °C下透析，IgG在25 °C下透析（参见材料表），并轻微振荡管子以形成扩散梯度。
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结果
将人血清IgG蛋白和牛MBP蛋白在D2O为基础的缓冲液中重悬至高浓度（约50 mg/mL）。由于蛋白质溶解在高浓度条件下，所得溶液为拥挤的蛋白质溶液。使用中子自旋回波（NSE）研究的蛋白质动力学受到蛋白质所处拥挤环境的影响（结构因子相互作用和流体动力学效应）5,28,39。为校正拥挤效应，对每种蛋白质进行了一系列不同浓度的动态光散射（DLS）测量。通过DLS测得的平移扩散系数随浓度变化进行外推至零浓度，可获得单个蛋白质的平移扩散值。此外，在进行NSE实验前，还必须测定动态黏度随蛋白质浓度的变化，以校正流体动力学相互作用。动态黏度随浓度变化的曲线需外推至零浓度，所得值应与各制备蛋白样品对应缓冲液溶液的实验测得值一致。
在进行任何中子自旋回波（NSE）实验之前，需评估浓溶液中蛋白质的形状和结构，以了解蛋白质的形状因子以及结构因子的强度，这些因素可能影响蛋白质在溶液中的运动方式。小.......
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讨论
中子自旋回声（NSE）谱学能够提供蛋白质动力学的独特且详细的视图，这是其他光谱技术无法实现的。如本文所述，通过在较长时间尺度上的测量，可以同时观测到蛋白质的平动扩散和转动扩散。区段动力学及其他内部振荡在短时间尺度上表现为相干散射函数 S(Q, t) 的显著衰减，并且与整体扩散松弛过程有良好的分离。NSE 技术的主要局限性在于测量时间较长以及需要较大的样品体积，以获得良好的统计信号。这对于浓度较低、寿命较短的可移动物种相关的生物大分子体系的测量可能构成挑战。
IgG的内部动力学
IgG蛋白具有抗体特异性的Y形结构，可近似为由柔性连接区相连的三个大片段。针对此类结构，假设了一个由处于谐振势中的三个大颗粒组成的数学模型。连接区被近似为弹性弹簧，其提供固定的平衡位置，但允许以布朗运动形式发生的波动。每个片段在其相对平衡位置周围具有三个自由度28。方程2中由Fint(Q, t)表示的内部动力学通过Ornstein-Uhlenbeck过程进行描.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益和利益冲突。本文内容基于作者在2019年至2021年期间于HANDS-中子散射在结构生物学中的应用学校所作的讲座。
致谢
本研究使用了橡树岭国家实验室运营的美国能源部科学用户设施——散裂中子源（Spallation Neutron Source）的资源（束线15、束线6，生物学与化学实验室）。本研究还使用了德国加兴MLZ-FRM2反应堆（KWS-2、Phoenix-J-NSE）以及德国于利希研究中心有限公司（Forschungszentrum Jülich GmbH）JCNS1的资源。作者感谢Ralf Biehl博士和Andreas Stadler博士在建模方面的帮助，以及他们在IgG和MBP蛋白研究中的贡献；感谢Piotr A. Żołnierczuk博士在中子自旋回声（NSE）数据约化方面的支持；感谢Changwoo Do博士在小角中子散射（SANS）测量方面的支持；并感谢Rhonda Moody和Kevin Weiss博士在SNS生物化学实验室提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛MBP蛋白溶液 | Sigma-Aldrich | M1891 | 冻干粉末用...重悬 D2O |
| D2O - 重水 | Sigma-Aldrich | 产品编号 151882 | 液体 |
| 去离子水 | 自主研发 | - | 用于洗涤/清洁细胞 |
| DLS 仪器 | Zetasizer Nano ZS，FZ-Jü地衣 | - | 动态光散射仪 |
| 弹性散射标准品 | SNS-NSE，ORNL | - | Al2O3 和石墨粉 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 65350-M | 用于清洁细胞的70%乙醇 |
| IgG 蛋白溶液 | Sigma-Aldrich | I4506 | 冻干粉末用...重悬 D2O |
| KWS-2 仪器 | 位于MLZ的JCNS分站， 德国加兴 | - | 小角中子散射仪 |
| Liquinox 洗洁精 | Alconox | - | 无磷酸盐液体实验室玻璃器皿清洗剂 |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 产品编号 S9390 | 七水合磷酸氢二钠盐 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 产品编号 S9888 | 氯化钠盐 |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 产品编号 S9638 | 一水合磷酸二氢钠盐 |
| Nanodrop 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 货号： ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c 分光光度计 |
| 中子对准相机 | 中子光学，格勒诺布尔 | NOG210222 | 100 x 100 毫米相机，配备 Sony IMX249 CMOS 传感器 |
| Parafilm M - 石蜡封口膜 | 贝米斯 | Parafilm M - 5259-04LC PM996 | 带纸板分配器的通用实验室保鲜膜 |
| Phoenix-J-NSE 谱仪 | 位于MLZ的JCNS分站， 德国加兴 | - | 中子谱仪 |
| SasView | https://www.sasview.org/ | ||
| SAXSpace，安东帕仪器 | FZ-Jü地衣 | - | 小角X射线仪器 |
| Slide-A-Lyzer透析膜 | 赛默飞世尔科技 | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer 超滤管（3.5 K 截留分子量） |
| SNS 远程分析集群 | 中子科学远程分析（sns.gov） | https://analysis.sns.gov | |
| SNS-NSE 谱仪 | 美国田纳西州橡树岭橡树岭国家实验室 | - | 中子谱仪 |
| 无菌注射器滤器 | VWR | N.A. 货号：28145-501 | 0.2 µm 孔径滤膜 |
| 温度诱导系统（TFS） | SP Scientific | 部件编号 100004055 | 样品环境设备 |
| 尿素-d4 | Sigma-Aldrich | 产品编号 176087 | 氘代尿素盐 |
| 粘度计 | FZ-Jü地衣 | - | 落球粘度计 |
参考文献
- Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
- Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Jap....
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重印与许可
