我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。
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摘要
摘要
嗅鞘胶质细胞（OEG）分布于从嗅黏膜至嗅球的嗅神经层（ONL）的整个通路。在成体生命过程中，它们对于新生成的嗅觉神经元从固有层延伸轴突至ONL起着关键作用。由于具有促进再生的特性，这些细胞已被用于促进脊髓或视神经损伤模型中的轴突再生。
我们提出了一种体外模型，用于在神经损伤后检测和评估嗅鞘胶质细胞（OEG）的神经再生能力。在该模型中，将可逆永生化的人源OEG（ihOEG）以单层形式培养，从成年大鼠中分离视网膜，并将视网膜神经节细胞（RGN）共培养于OEG单层之上。培养96小时后，通过免疫荧光分析RGN中的轴突及胞体-树突标志物，并定量具有轴突的RGN数量以及每个神经元的平均轴突长度。
与其他依赖胚胎或出生后神经元的体外检测方法相比，该方案的优势在于其能够在成年组织中评估嗅鞘细胞的神经再生特性。此外，该方法不仅可用于评估诱导型人源嗅鞘细胞（ihOEG）的神经再生潜力，还可推广应用于其他来源的嗅鞘细胞或其他胶质细胞。
引言
成年中枢神经系统（CNS）神经元在损伤或疾病后再生能力有限。促进CNS再生的一种常用策略是在损伤部位移植能够诱导轴突生长的细胞类型，例如干细胞、施万细胞、星形胶质细胞或嗅鞘胶质（OEG）细胞1,2,3,4,5。
嗅鞘胶质细胞（OEG）起源于神经嵴6，位于嗅黏膜和嗅球中。在成体中，嗅觉感觉神经元会因环境暴露而定期死亡，并由新分化的神经元所替代。OEG 包绕并引导这些新生的嗅觉轴突进入嗅球，并与中枢神经系统（CNS）内的靶细胞建立新的突触连接7。 由于这些生理特性，OEG 已被应用于中枢神经系统损伤模型，如脊髓或视神经损伤模型，其神经再生和神经保护作用已得到证实8,9,10,11
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方案
注意：动物实验已获得国家和机构生物伦理委员会的批准。
1. ihOEG（Ts12 和 Ts14）培养
注意：该操作需在组织培养生物安全柜内的无菌条件下进行。
- 按所提供的方法制备50 mL ME10 OEG培养基 表1.
- 配制5 mL DMEM/F12-FBS，按所提供的说明进行 表1，置于15 mL锥形管中。
- 将两种培养基在37℃下预热 °在洁净的水浴中，37°C 下孵育 15 分钟。
- 在37℃下解冻Ts12和Ts14细胞冻存管 °在洁净的水浴中
- 重悬细胞并加入步骤2中配制的DMEM/F12-FBS培养基中。
- 离心5分钟，200 x g g.
- 吸除上清液。
- 加入500 µL 的 ME10 培养基重悬沉淀。
- 在60 mm细胞培养皿中加入3 mL ME10培养基，然后逐滴加入细胞悬液。
- 轻轻移动，使细胞均匀分布在培养板上。
- 在 37 ℃ 培养细胞 °5% CO₂ 条件下2.
注意：细胞达到汇合后，必须至少再传代一次，以优化共培养效果。接种于盖玻片....
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结果
在本实验方案中，我们介绍了一种体外模型，用于检测嗅鞘胶质细胞（OEG）在神经元损伤后的神经再生能力。如图1所示，OEG的来源为一种可逆永生化的人源OEG克隆细胞系——Ts14和Ts12，该细胞系源自尸检获取的嗅球组织所建立的原代培养物15,17,18。从成年大鼠视网膜组织中分离视网膜神经节神经元（RGN），经消化处理后，将RGN悬液接种于PLL处理的盖玻片上，或接种于人源OEG单层细胞（Ts14或Ts12）上。培养96小时后固定细胞。通过免疫荧光法分析轴突及胞体-树突标志物，并对轴突再生情况进行定量分析。
通过使用已知在髓鞘化胶质细胞中表达的标志物进行免疫染色来评估Ts14 OEG的身份（图2），这些标志物包括S100 β（图2A）和波形蛋白（v.......
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讨论
由于嗅鞘细胞（OEG）具有持续的促神经再生特性，将其移植至中枢神经系统（CNS）损伤部位被视为一种有前景的CNS损伤治疗策略7,8,9。然而，根据组织来源——嗅黏膜（OM-OEG） versus 嗅球（OB-OEG）——或供体年龄的不同，其促再生能力存在显著差异26,31,33,36。因此，在开展体内研究之前，建立一种简便且可重复的体外模型以评估特定OEG样本的神经再生能力显得尤为重要。在本方案中，将成年大鼠轴突损伤的视网膜神经节细胞（RGN）与OEG单层细胞进行共培养以进行检测，并通过免疫荧光分析RGN轴突及胞体-树突标志物，从而评估RGN轴突的再生情况。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了西班牙科学与创新部项目 SAF2017-82736-C2-1-R 对 MTM-F 的资助，以及弗朗西斯科·德·维多利亚大学基金会对 JS 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 514 | 参考文献 34 | 兔多克隆抗血清，可识别 MAP2A 和 B。 | |
| 抗体 SMI-31 | BioLegend | 801601 | 针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白的单克隆抗体 |
| 抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体 | ThermoFisher | A-21202 | |
| 抗兔 Alexa Fluor 594 抗体 | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-氨基-5-磷酸戊酸 | Sigma | 283967 | NMDA 受体抑制剂 |
| DAPI | Sigma | D9542 | 细胞核荧光染料 |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | 细胞培养基 |
| FBS | Gibco | 11573397 | 胎牛血清 |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | 胎牛血清 |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | 封片剂 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 (NIH-USA) | 图像分析软件 | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 神经元细胞培养基 |
| 木瓜蛋白酶解离系统 | Worthington 生物化学公司 | LK003150 | 用于神经细胞分离 |
| PBS | 自制 | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素 B | Lonza | 17-745E | 抑菌和杀菌剂 |
| 垂体提取物 | Gibco | 13028014 | 牛垂体提取物 |
| 聚-L-赖氨酸 (PLL) | Sigma | A-003-M |
参考文献
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
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重印与许可
