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方法文章

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

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DOI：

10.3791/61863

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2020年11月2日

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

本文内容

摘要

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。

摘要

嗅鞘胶质细胞（OEG）分布于从嗅黏膜至嗅球的嗅神经层（ONL）的整个通路。在成体生命过程中，它们对于新生成的嗅觉神经元从固有层延伸轴突至ONL起着关键作用。由于具有促进再生的特性，这些细胞已被用于促进脊髓或视神经损伤模型中的轴突再生。

我们提出了一种体外模型，用于在神经损伤后检测和评估嗅鞘胶质细胞（OEG）的神经再生能力。在该模型中，将可逆永生化的人源OEG（ihOEG）以单层形式培养，从成年大鼠中分离视网膜，并将视网膜神经节细胞（RGN）共培养于OEG单层之上。培养96小时后，通过免疫荧光分析RGN中的轴突及胞体-树突标志物，并定量具有轴突的RGN数量以及每个神经元的平均轴突长度。

与其他依赖胚胎或出生后神经元的体外检测方法相比，该方案的优势在于其能够在成年组织中评估嗅鞘细胞的神经再生特性。此外，该方法不仅可用于评估诱导型人源嗅鞘细胞（ihOEG）的神经再生潜力，还可推广应用于其他来源的嗅鞘细胞或其他胶质细胞。

引言

成年中枢神经系统（CNS）神经元在损伤或疾病后再生能力有限。促进CNS再生的一种常用策略是在损伤部位移植能够诱导轴突生长的细胞类型，例如干细胞、施万细胞、星形胶质细胞或嗅鞘胶质（OEG）细胞1,2,3,4,5。

嗅鞘胶质细胞（OEG）起源于神经嵴6，位于嗅黏膜和嗅球中。在成体中，嗅觉感觉神经元会因环境暴露而定期死亡，并由新分化的神经元所替代。OEG 包绕并引导这些新生的嗅觉轴突进入嗅球，并与中枢神经系统（CNS）内的靶细胞建立新的突触连接7。 由于这些生理特性，OEG 已被应用于中枢神经系统损伤模型，如脊髓或视神经损伤模型，其神经再生和神经保护作用已得到证实8,9,10,11。已有多种因素被确认为介导这些细胞促再生特性的关键因素，包括细胞外基质蛋白酶的产生，以及神经营养因子和轴突生长因子的分泌12,13,14。

由于原代嗅鞘细胞（OEG）扩增存在技术局限性，我们此前建立并表征了可逆永生化的人源OEG（ihOEG）克隆细胞系，这些细胞系可提供无限量且均一的OEG。这些ihOEG细胞来源于尸检获取的嗅球组织所建立的原代培养物，通过转导端粒酶催化亚基（TERT）和癌基因Bmi-1，并利用SV40病毒大T抗原进行修饰而实现永生化15,16,17,18。其中两个ihOEG细胞系为Ts14，其保留了原始培养物的再生能力；另一个为Ts12，属于低再生能力细胞系，在本实验中作为低再生对照使用18。

为了评估嗅鞘胶质细胞（OEG）在神经损伤后促进轴突再生的能力，已建立了多种体外模型。在这些模型中，将OEG应用于不同来源的神经元培养体系，并检测神经突的形成和延伸（作为与胶质细胞共培养的反应）。此类神经元来源的例子包括新生大鼠皮层神经元19、在大鼠胚胎皮层神经元上制造的划痕损伤20、大鼠视网膜外植体21、大鼠下丘脑或海马区出生后神经元22,23、出生后大鼠背根神经节神经元24、出生后小鼠皮质脊髓束神经元25、人NT2神经元26，以及在反应性星形胶质细胞瘢痕样培养物上培养的出生后脑皮层神经元27。

然而，在这些模型中，再生检测依赖于具有内在可塑性的胚胎期或出生后神经元，而这种可塑性在受损的成年神经元中并不存在。为克服这一缺陷，我们提出了一种成年轴突再生的共培养模型，该模型基于 Wigley 等人最初建立的方法28,29,30,31，并经我们研究团队改进和应用12,13,14,15,16,17,18,32,33，将嗅鞘胶质细胞（OEG）系与成年视网膜神经节神经元（RGNs）进行共培养。简言之，从成年大鼠中提取视网膜组织，并用木瓜蛋白酶消化。将视网膜细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上，或接种于 Ts14 和 Ts12 单层细胞上。培养 96 小时后，固定细胞，并对轴突标志物（MAP1B 和 NF-H 蛋白）34 及胞体-树突标志物（MAP2A 和 B）35 进行免疫荧光染色。轴突再生以具有轴突的神经元占 RGN 总群体的百分比进行量化，轴突再生指数则计算为每个神经元的平均轴突长度。该实验方案不仅可用于评估 ihOEG 的神经再生潜力，还可推广应用于其他来源的 OEG 或其他胶质细胞。

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方案

注意：动物实验已获得国家和机构生物伦理委员会的批准。

1. ihOEG（Ts12 和 Ts14）培养

注意：该操作需在组织培养生物安全柜内的无菌条件下进行。

  1. 按所提供的方法制备50 mL ME10 OEG培养基 表1.
  2. 配制5 mL DMEM/F12-FBS，按所提供的说明进行 表1，置于15 mL锥形管中。
  3. 将两种培养基在37℃下预热 °在洁净的水浴中，37°C 下孵育 15 分钟。
  4. 在37℃下解冻Ts12和Ts14细胞冻存管 °在洁净的水浴中
  5. 重悬细胞并加入步骤2中配制的DMEM/F12-FBS培养基中。
  6. 离心5分钟，200 x g g.
  7. 吸除上清液。
  8. 加入500 µL 的 ME10 培养基重悬沉淀。
  9. 在60 mm细胞培养皿中加入3 mL ME10培养基，然后逐滴加入细胞悬液。
  10. 轻轻移动，使细胞均匀分布在培养板上。
  11. 在 37 ℃ 培养细胞 °5% CO₂ 条件下2.
    注意：细胞达到汇合后，必须至少再传代一次，以优化共培养效果。接种于盖玻片进行共培养前，需达到90%汇合度。一个汇合的p-60培养皿的平均细胞数量为7 x 105 用于Ts14和2.5 x 106 用于 Ts12 细胞系. Ts12 和 Ts14 细胞系应每 2–3 天传代一次。

2. 实验用永生化人嗅鞘胶质细胞（ihOEG，Ts12 和 Ts14）的准备

注意：此步骤必须在视网膜神经节细胞解剖和共培养前 24 小时完成。

  1. 处理 12 mm Ø 带有10的盖玻片 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）孵育 1 小时。
    注意：盖玻片可在PLL溶液中放置过夜。
  2. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗盖玻片，共三次。
  3. 从 p60 细胞培养皿中分离 Ts12 和 Ts14 ihOEG 细胞。
    1. 加入4 mL DMEM/F12-FBS培养基（表1) 转移至15 mL圆锥形离心管中，在37 °在洁净的水浴中
    2. 从培养板中移除培养基，用 1 mL 1x PBS-EDTA 洗涤细胞一次。
    3. 向OEG细胞中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，于37℃孵育3–5分钟 °C，5% CO2.
    4. 用 p1000 移液器收集细胞，并转移至步骤 3.1 中准备好的培养基中。
    5. 离心5分钟，200 x g g.
    6. 吸除上清液。
    7. 加入1 mL ME10培养基，重悬沉淀。
    8. 使用血细胞计数板计数细胞数量。
  4. 将80,000个Ts14细胞或100,000个Ts12细胞接种至24孔板内的盖玻片上，每孔体积为500 μL µME10 培养基 L
  5. 在37℃培养细胞 °C in 5% CO2，孵育24小时。

3. 视网膜组织解剖

注意：使用2月龄雄性Wistar大鼠作为RGN来源。每只大鼠的两个视网膜用于24孔细胞培养板中的20个孔。手术器械使用前需高压灭菌。木瓜蛋白酶解离试剂盒为商业购买产品（材料表）。请按照供应商提供的说明进行重组。将D,L-2-氨基-5-磷酸戊酸（APV）溶解配制成5 mM的储存液，并分装成小份。

  1. 在检测当天，准备以下培养基。
    1. 用5 mL冷的EBSS（ papain 解离试剂盒中的第1管）准备一个p60细胞培养皿。
    2. 用重组的木瓜蛋白酶解离试剂盒第2管（木瓜蛋白酶）50 μL制备一个p60细胞培养皿 µL-APV  然后，加入250 µL 重悬后的第 3 瓶（DNase 加 5 µL-APV）
    3. 在无菌管中，将2.7 mL的小瓶1与300 µ第4管（白蛋白-卵黏蛋白蛋白酶抑制剂）的L。加入150 µ瓶3（DNase）的L加上30 µL-APV
    4. 配制20 mL Neurobasal-B27培养基（NB-B27），按说明书提供成分准备 表1.
  2. 通过 CO₂ 窒息法处死一只大鼠2.
  3. 使用断头器断头后取下头部，将其放入100 mm培养皿中，并在放入超净工作台前用70%乙醇喷洒头部。
  4. 用剪刀剪掉大鼠的胡须，以免影响眼部操作。
  5. 用镊子夹住视神经，将眼球向外拉出足够长度，以便使用手术刀在眼球上做切口。
  6. 移除晶状体和玻璃体，取出视网膜（呈橙色样组织），而眼球的其余层次结构（包括色素上皮层）保留在原位。
  7. 将视网膜置于第3.1.1步中准备好的p60细胞培养皿中。
  8. 将视网膜转移至第3.1.2步中准备好的p60细胞培养皿中，并用手术刀将其切成大小约 < 1 mm
  9. 转移至15 mL塑料管中。
  10. 在37℃湿润培养箱中孵育组织30分钟 °5% CO₂ 条件下 37°C培养2，每10分钟振荡一次。
  11. 使用玻璃巴斯德吸管反复吹打以分散细胞团块。
  12. 将细胞悬液在200 x g 5 分钟。
  13. 弃去上清液，为灭活木瓜蛋白酶，将细胞沉淀重悬于步骤 3.1.3 配制的溶液中（每 2 只眼球使用 1.5 mL）。
  14. 小心地将此细胞悬液用移液管转移至5 mL重悬的4号小瓶中。
  15. 200 x g 离心 g 5 分钟。
  16. 离心时，将OEG 24孔细胞板（步骤2中预先制备）中的ME-10培养基完全吸除，并替换为500 µ每孔加入 NB-B27 培养基 L
  17. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL NB-B27培养基中。
  18. 接种 100 µ每孔加入 L 视网膜细胞悬液至 m24 培养板中经 PLL 处理或接种有 OEG 单层的盖玻片上。
  19. 在37℃下维持培养 °C，含5% CO2 在NB-B27培养基中培养96小时。

4. 免疫染色

  1. 96 小时后，向培养基（600 µL）中加入等体积的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS，固定细胞 10 分钟（PFA 最终浓度为 2%）。
  2. 移除 24 孔板中的培养基和 PFA，再次加入 500 µL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS，于室温孵育 10 分钟。
  3. 弃去固定液，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  4. 用含 0.1% Triton X-100 和 1% FBS 的 PBS（PBS-TS）封闭 30–40 分钟。
  5. 在 PBS-TS 缓冲液中配制一抗，具体如下：SMI31 单克隆抗体（针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白），稀释比例为 1:500；514 兔多克隆抗血清（识别 MAP2A 和 B 蛋白），稀释比例为 1:400。
  6. 将一抗加入共培养体系中，于 4 °C 孵育过夜。
  7. 次日，弃去一抗，用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
  8. 在 PBS-TS 缓冲液中配制二抗，具体如下：针对 SMI-31 使用抗小鼠 Alexa Fluor 488（1:500）；针对 514 使用抗兔 Alexa-594（1:500）。
  9. 在室温避光条件下，用相应的荧光标记二抗孵育细胞 1 小时。
  10. 在避光条件下，用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 最后，用封片剂（材料表）封片，并于 4 °C 保存。
    注意：如需进行细胞核荧光染色，可使用 DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）。封片前，在避光条件下用含 DAPI（10 µg/mL）的 1× PBS 孵育细胞 10 分钟，随后用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，最后用封片剂封片。

5. 轴突再生的定量分析

注意：样品需在落射荧光显微镜的40倍物镜下进行定量。每种处理条件至少应随机选取30个视野拍摄图像，包含不少于200个神经元用于定量分析。每个实验至少应重复三次。

  1. 量化具有轴突（SMI31阳性突起）的神经元占视网膜神经节细胞（RGN）总群体的百分比（通过MAP2A/B 514阳性免疫荧光标记神经元胞体和树突来鉴定）。
  2. 量化轴突再生指数或平均轴突长度（µm/神经元）。该参数定义为所有已识别轴突长度（单位：µm）的总和除以计数的神经元总数（无论其是否具有轴突）。轴突长度使用图像分析软件ImageJ（NIH-USA）中的NeuronJ插件测定。
  3. 使用适当的软件计算均值、标准差及统计学显著性。

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结果

在本实验方案中，我们介绍了一种体外模型，用于检测嗅鞘胶质细胞（OEG）在神经元损伤后的神经再生能力。如图1所示，OEG的来源为一种可逆永生化的人源OEG克隆细胞系——Ts14和Ts12，该细胞系源自尸检获取的嗅球组织所建立的原代培养物15,17,18。从成年大鼠视网膜组织中分离视网膜神经节神经元（RGN），经消化处理后，将RGN悬液接种于PLL处理的盖玻片上，或接种于人源OEG单层细胞（Ts14或Ts12）上。培养96小时后固定细胞。通过免疫荧光法分析轴突及胞体-树突标志物，并对轴突再生情况进行定量分析。

通过使用已知在髓鞘化胶质细胞中表达的标志物进行免疫染色来评估Ts14 OEG的身份（图2），这些标志物包括S100 β（图2A）和波形蛋白（v...

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讨论

由于嗅鞘细胞（OEG）具有持续的促神经再生特性，将其移植至中枢神经系统（CNS）损伤部位被视为一种有前景的CNS损伤治疗策略7,8,9。然而，根据组织来源——嗅黏膜（OM-OEG） versus 嗅球（OB-OEG）——或供体年龄的不同，其促再生能力存在显著差异26,31,33,36。因此，在开展体内研究之前，建立一种简便且可重复的体外模型以评估特定OEG样本的神经再生能力显得尤为重要。在本方案中，将成年大鼠轴突损伤的视网膜神经节细胞（RGN）与OEG单层细胞进行共培养以进行检测，并通过免疫荧光分析RGN轴突及胞体-树突标志物，从而评估RGN轴突的再生情况。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了西班牙科学与创新部项目 SAF2017-82736-C2-1-R 对 MTM-F 的资助，以及弗朗西斯科·德·维多利亚大学基金会对 JS 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体 514参考文献 34兔多克隆抗血清，可识别 MAP2A 和 B。
抗体 SMI-31BioLegend801601针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白的单克隆抗体
抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体ThermoFisherA-21202
抗兔 Alexa Fluor 594 抗体ThermoFisherA-21207
B-27 添加剂Gibco17504044
D,L-2-氨基-5-磷酸戊酸Sigma283967NMDA 受体抑制剂
DAPISigmaD9542细胞核荧光染料
DMEM-F12Gibco11320033细胞培养基
FBSGibco11573397胎牛血清
FBS-HycloneFisher Scientific16291082胎牛血清
FluoromountSouthern Biotech0100-01封片剂
ImageJ美国国立卫生研究院 (NIH-USA)图像分析软件
L-谷氨酰胺LonzaBE17-605F
Neurobasal 培养基Gibco21103049神经元细胞培养基
木瓜蛋白酶解离系统Worthington 生物化学公司LK003150用于神经细胞分离
PBS自制
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
青霉素/链霉素/两性霉素 BLonza17-745E抑菌和杀菌剂
垂体提取物Gibco13028014牛垂体提取物
聚-L-赖氨酸 (PLL)SigmaA-003-M

参考文献

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