基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

摘要

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。

摘要

受体和酶蛋白是重要的生物分子，可作为生物活性小分子的结合靶点。因此，快速且全面地验证药物-蛋白相互作用，不仅有助于理解治疗效果背后的分子机制，也有助于评估药物在临床应用中的特性，如吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）。本文介绍了一种基于生物传感器的高通量策略，用于筛选T7噬菌体展示的短肽，这些短肽可轻松表达于噬菌体衣壳表面。此外，还展示了利用受体配体接触（RELIC）套件中的生物信息学程序，分析含有药物结合位点短片段（即"断裂残迹"）的肽段氨基酸序列的方法。通过将该方法应用于两种已获批的临床药物——抗肿瘤药伊立替康和抗流感药奥司他韦，本文详细阐述了获取识别药物的肽序列并揭示靶蛋白药物结合位点的具体流程。本研究所描述的策略可适用于任何感兴趣的小分子。

引言

鉴定药物结合靶点对于药物研发以及理解疾病的分子机制至关重要。特别是受体蛋白和酶蛋白是生物活性小分子最重要的分子靶点¹。尽管亲和捕获技术已被广泛用于鉴定药物结合蛋白²，但技术上的局限性（如蛋白质溶解度低）常常阻碍药物靶点的验证²。更重要的是，固定化的小分子会丧失对接所必需的自由度，可能无法接触到大分子靶蛋白内部的结合位点。此外，蛋白质错误折叠、无法分析共结晶条件，以及分子尺寸限制等因素，常常妨碍X射线晶体学、核磁共振（NMR）及其他实验分析方法在药物-蛋白相互作用研究中的应用。

利用T7噬菌体展示生物淘选技术是确定小分子诱饵在蛋白质上结合位点的有效方法³。特别是，通过将合成DNA插入多克隆位点构建的T7噬菌体展示随机肽库具有良好的效果。与展示完整蛋白质的T7噬菌体文库相比，短肽更容易被工程化并展示在T7噬菌体衣壳上，且不受空间位阻限制，因而能够与固定在固相载体上的任何小分子药物发生空间接触²。此外，将石英晶体微天平（QCM）生物传感器引入T7噬菌体展示生物淘选平台，可通过监测QCM频率的降低来识别短肽与药物之间微弱但特异的相互作用^4,5。随后，通过感染宿主Escherichia coli（BLT5615）直接回收结合的T7噬菌体，并测定编码亲和筛选肽的DNA序列，该肽含有识别药物的短片段 。对肽序列群体进行后续分析可提供有关药物识别机制的信息。通过对回收的氨基酸序列进行计算机辅助的两两比对，可推断药物在特定蛋白质组中的生物学靶标。这种高通量识别具有药物亲和力的蛋白片段的方法，可启发式地重构药物结合位点，其原理类似于通过陶器碎片重构古代器物⁶。特别是当传统蛋白质组学方法失效时，这一独特策略尤为有用。

本文介绍了一种基于生物传感器的策略，用于T7噬菌体展示肽的生物筛选，以及针对小分子靶点验证的生物信息学分析。该策略克服了传统方法的技术局限，能够在相同实验流程下，识别任意感兴趣小分子在靶蛋白上的结合位点。

方案

注意：以下是使用石英晶体微天平（QCM）生物传感器筛选识别药物的T7噬菌体，并通过感染大肠杆菌（E. coli，BLT5615）回收筛选出的噬菌体的步骤。有关形成自组装单分子层（SAM）的小分子衍生物的合成方法，以及构建T7噬菌体展示15肽随机肽库的实验方案，可参见其他文献^6,7。

1. QCM 传感器芯片的制备

1. 将陶瓷传感器芯片安装在27 MHz石英晶体微天平（QCM）装置的振荡器上，并在小分子固定化之前记录空气相中的本征频率（Hz）。
2. 取下芯片，使用移液器将20 μL的小分子衍生物溶液（1 mM，70%乙醇）滴加到传感器芯片的金电极表面，该小分子衍生物可形成自组装单分子层（SAM）。
   注意：传感器芯片上设有金电极（Au，0.1 mm厚，内径2.5 mm，面积4.9 mm²）的晶体部分极为纤薄，易碎（SiO₂，0.06 mm厚，内径9 mm），因此操作移液时需格外小心。
3. 将芯片置于培养皿中，用湿润的纸巾保持湿度，并避光，在室温（约20 °C）下静置1小时。
4. 用超纯水轻轻清洗电极表面，然后用注射器或气吹工具吹入空气以去除残留水滴。
5. 将传感器芯片重新安装至QCM装置，记录空气相中频率的降低值，以测定已固定的小分子的量。
   ​注意：为确保小分子成功固定，本征频率至少需降低100 Hz（1 Hz对应30 pg）。

2. 使用QCM生物传感器对T7噬菌体文库进行生物淘选（图1）

1. 将带有专用磁力搅拌器的比色皿置于QCM生物传感器上，并向比色皿中加入8 mL反应缓冲液（10 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，pH 7–8）。
2. 将QCM传感器芯片连接至振荡器，并放下振荡臂，使芯片浸入正在以1000 rpm速度搅拌的缓冲液中。
3. 在个人计算机（PC）上开始监测QCM频率，并等待传感器图谱稳定至频率漂移约为3 Hz/min。
4. 向比色皿中注入8 μL T7噬菌体文库（1—2 × 10¹⁰ pfu/mL）（终浓度：1—2 × 10⁷ pfu/mL），并在传感器上标记注射时间点。
5. 监测T7噬菌体结合到固定于金电极表面的小分子所引起的频率下降，持续10分钟。
6. 停止QCM频率监测，将传感器芯片从振荡器上取下，并通过吹入空气和/或用擦拭纸吸除的方式去除残留缓冲液。
7. 将传感器芯片放入湿润的培养皿中，并在金电极表面滴加20 μL处于对数生长期的E. coli（BLT5615）宿主细胞悬液（在37 °C振荡培养后加入IPTG至终浓度1 mM，OD₆₀₀ = 0.5—1.0）。
8. 盖上培养皿盖，并用铝箔包裹以避光。
9. 将培养皿置于37 °C下，在96孔微孔板混匀仪上孵育30分钟（1000–1500 rpm），以促进结合的T7噬菌体恢复。
10. 回收20 μL溶液，并将其悬浮于200 μL LB培养基中。
    注意：此步骤获得的样品可在4 °C保存一周。
11. 根据生产商说明书中的常规操作步骤，制备噬菌体溶液的系列稀释液，用于噬菌斑分离和DNA测序^8,9。
12. 用浸有1%十二烷基硫酸钠溶液的棉签擦拭金电极表面。
13. 用洗瓶中的超纯水清洗金表面，然后用注射器或吹气球吹气去除水滴。
14. 在金表面滴加5 μL piranha溶液（浓H₂SO₄ : 30% H₂O₂ = 3:1），静置5分钟。
15. 再次用水清洗金表面，然后通过吹气和/或擦拭吸除的方式干燥。
16. 重复步骤2.14和2.15。
    警告：Piranha溶液需在使用前立即配制。该液体为极强酸，操作时应格外小心。处理时间超过5分钟会腐蚀传感器芯片。

3. 使用受体-配体相互作用分析程序套件（Receptor Ligand Contact，RELIC）进行生物信息学分析（图2）^10,11

1. 在安装有 Microsoft Windows 操作系统的个人电脑上解压独立运行的 RELIC 程序。
2. 将使用药物亲和筛选得到的 15 肽氨基酸序列，或从未筛选的原始文库中随机选取的氨基酸序列，分别在每个文本格式文件（命名为 name.txt）中进行比对。
3. 在每个文本文件中以 FASTA 格式输入单个或多个蛋白质的氨基酸序列，或从任意蛋白质数据库（例如 UniProt（http://www.uniprot.org/）或 DrugBank（https://www.drugbank.ca/））下载 FASTA 格式的数据库文本文件。
4. 将文本文件（以及用于 HETEROalign 的 PDB 文件）放置于运行各个 RELIC 程序所需的文件夹中。
5. 在独立文件夹中点击可执行文件（program.exe），以启动 AADIV、INFO、MOTIF、MATCH、HETEROalign、FASTAcon 和 FASTAskan 程序的 FTN95 个人版本。
6. 在命令提示界面中输入相应的文件名及其扩展名（name.txt），以执行每个程序并生成所需的文本格式文件。
7. 将生成的文本文件导出至电子表格软件（例如 Excel），用于绘制信息含量（INFO）图谱，或基于 BLOSUM62 矩阵计算得到的累积相似性评分（MATCH、HETEROalign）。
   注意：原始 RELIC 服务器（http://relic.bio.anl.gov）已不再可用；可在 Windows 平台上运行的部分独立版 RELIC 程序可向通讯作者索取（邮箱：tkksg@rs.noda.tus.ac.jp）。

结果

两种临床批准药物的代表性结果如图3所示。伊立替康（图3A）是一种天然喜树碱的水溶性前药，用于治疗晚期结直肠癌和非小细胞肺癌，其在肝脏中转化为SN-38，进而抑制癌细胞中的拓扑异构酶I¹²。此外，该化合物可直接抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）^13,14。通过该策略，利用基于石英晶体微天平生物传感器的单循环生物筛选子集，鉴定了29种识别以自组装单分子膜（SAM）形式固定的伊立替康的多肽。随后对这29种多肽与AChE进行成对序列比对，发现Y121、Q225、F290、E327、H440和Y442位点得分最高，并在三维结构中突出了相应区域。这些氨基酸残基与构成AChE中伊立替康结合位点的残基一致。同一组多肽成功识别出羧酸酯酶（CE）催化三联体（S221、E353和H467）附近区域的E99、L100、L252、L305、I387和V474，表明这些氨基酸在伊立替康去酯化过程中构成了识别伊立替康的结构支架¹⁵。由于酶促反应进行顺利，在常规实验条件下无法稳定形成静态复合物，因此使用传统的X射线晶体学或核磁共振（NMR）分析无法直接鉴定催化位点中的这些氨基酸残基。因此，针对某一特定药物所确定的亲和筛选多肽，可用于组合式检测多种蛋白质的药物结合位点，包括药物在代谢反应过程中可能与酶形成的中间复合物中的结合位点。

图3B展示了针对奥司他韦（Osel）获得的其他结果。奥司他韦是一种抗流感药物，可被激活为奥司他韦羧酸盐，后者可抑制流感病毒的神经氨酸酶（NA）¹⁶。覆盖在QCM传感器芯片金电极表面的27条识别奥司他韦的多肽，成功检测到了NA中的奥司他韦结合位点¹⁶。该结合位点由无规卷曲的肽环组成，在与奥司他韦结合时可能发生动态构象变化。T7噬菌体衣壳上识别奥司他韦的多肽在结合固定于QCM传感器芯片金电极表面的奥司他韦时，可能模拟了这种动态结合过程。已有研究发现，流感年轻患者中出现神经精神类不良事件（NPAEs），这些不良反应可能与疾病本身有关，而非药物所致。研究表明，奥司他韦可通过血脑屏障（BBB）中的多药耐药（MDR）蛋白主动从啮齿类动物中枢神经系统（CNS）中转运排出¹⁷。事实上，在本研究中，除其他转运体、神经递质相关酶和受体外，该类MDR蛋白中的一种在DrugBank 1.0蛋白数据库（共4,396种蛋白）中得分较高（位于前5%）¹⁸。这些蛋白在奥司他韦不良反应发生中的药理学意义正在进一步研究中。

迄今为止，利用我们的策略已成功鉴定出六种小分子药物在靶蛋白上的单个及多个小分子结合位点（图4）。对于Brz2001和罗红霉素（RXM），尽管所使用的肽段文库在数量和氨基酸序列上完全不同，但仍鉴定出靶蛋白上相同的药物结合位点^7,19。此外，针对伊立替康（Iri）、RXM和奥司他韦（Osel）获得的单一肽段文库，分别鉴定出每种药物在不同蛋白上的多个结合位点，例如Iri作用于AChE和CE（图3A）²⁰，RXM作用于血管动蛋白（angiomotin）和CYP3A4^19,21，Osel作用于神经氨酸酶（NA）和多药耐药相关蛋白。对于抗肿瘤化合物阿霉素，鉴定出其未知的分子靶点FANCF²²，而抗血管生成大环内酯类抗生素RXM的靶点为血管动蛋白（angiomotin）¹⁹。

图1：基于QCM生物传感器的T7噬菌体展示肽文库生物筛选示意图。将展示随机肽的T7噬菌体文库注入含有缓冲液（持续搅拌）的比色皿中，QCM生物传感器芯片浸没于其中且频率已稳定。当监测到因T7噬菌体与固定在传感器芯片金电极表面的小分子结合而导致的频率下降后，将传感器芯片从振荡器上取下。结合的T7噬菌体DNA在感染宿主E. coli（BLT5615）后直接回收。通过噬菌斑形成分离获得的T7噬菌体，最终根据通用的噬菌体展示方法确定在T7噬菌体衣壳上展示的药物亲和筛选肽的氨基酸序列。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：药物筛选肽与单个或多个蛋白质之间序列比对的定量评估示意图。将药物筛选获得的肽序列分别与单个或多个蛋白质的一级氨基酸序列进行比对，通过改进的 BLOSUM62 矩阵对每组 3—5 个氨基酸的相似性进行成对比对并累计评分。所得图谱或示意图可指示构成蛋白质上潜在药物结合位点的残基或区域。利用适当的 RELIC 程序进一步分析，可在三维结构上突出显示结合位点（若有 PDB 文件），或对可能的结合靶标蛋白进行排序（HETEROalign 程序目前不可用）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3： 肽段富集及后续生物信息学分析的代表性结果。（A）伊立替康（抗肿瘤前药，拓扑异构酶I抑制剂）。通过监测QCM频率在10分钟内的降低来检测T7噬菌体的结合。回收结合的T7噬菌体DNA并进行测序，以确定相应的氨基酸序列。使用单轮生物淘选子集获得的29条15-肽的氨基酸序列，揭示了乙酰胆碱酯酶（AChE）中伊立替康结合位点的组成氨基酸 [PDB ID 1U65]。进一步利用这29条肽段的评估结果，揭示了羧酸酯酶（CE）催化三联体邻近的氨基酸残基（脱酯化作用的支架残基），CE是一种肝脏酶，可将伊立替康转化为SN-38（活性形式）[PDB ID: 1K4Y]。这些得分已减去从未筛选的亲本文库中随机选取的103条肽段的相似性得分^7,19，以消除文库偏差。这些图示经Elsevier许可，转载自参考文献20。（B）奥司他韦（抗流感药物）。包含奥司他韦识别氨基酸的27条肽段揭示了神经氨酸酶（NA）（病毒酶）奥司他韦结合位点中的无序区域 [PDB ID: 2HT7]。通过对这27条肽段与DrugBank 1.0数据库中4,396种蛋白质的序列相似性进行全局验证¹⁸，发现NA位于前5%的范围内，此外还包括与中枢神经系统功能相关的人类宿主蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

图4： 通过本策略鉴定出结合靶点的小分子汇总。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种基于QCM生物传感器的药物识别肽生物筛选策略，随后通过生物信息学分析，利用所鉴定的肽段验证药物-蛋白质相互作用。设计用于在生物传感器金电极表面固定的 小分子衍生物 是关键步骤，因为引入的连接臂可能阻碍识别药物的肽段的结合与富集。为避免这一问题，可制备连接臂位于不同位置的衍生物²³。另外，对于疏水性小分子的固定，可将传感器芯片浸入盛有大量水的10 cm培养皿中，然后将20 μL小分子溶液（10 mM二甲基亚砜溶液）滴加至生物传感器的金电极表面，覆盖整个电极，并孵育5分钟。该方法可使小分子保持亚百赫兹的固有频率，并在生物筛选过程中至少维持10分钟。事实上，采用此种固定方式，经Osel亲和筛选获得的肽段清晰地揭示了神经氨酸酶（NA）中的Osel结合位点（图3）。

用于构建肽库的T7噬菌体经过基因工程改造，采用了编码20种标准氨基酸的NNK₁₅盒，该盒包含32个密码子，并抑制两种终止密码子（UAA、UGA）的出现，仅保留UAG（图1）^6,7。这一设计对于展示15个氨基酸长度的全长肽段并提高文库多样性具有重要意义。T7噬菌体展示系统的技术展示上限为10⁷—10⁹个T7噬菌体。然而，理论上15肽文库的多样性可达20¹⁵（3.27 × 10¹⁹），因此无法实现完整的文库构建。尽管如此，通过相似性搜索或保守基序挖掘，即使在文库肽段多样性有限的情况下，仍可识别出构成蛋白质药物结合位点的氨基酸。此外，文库中肽段内3—5个氨基酸的短序列（出现频率介于1/20³至1/20⁵之间，可通过T7噬菌体展示系统实现）即可参与小分子药物的识别；因此，并不要求肽序列与目标蛋白药物结合位点的15个氨基酸序列完全匹配。事实上，每种测试药物通过亲和筛选获得的约30条肽序列，均成功凸显了目标蛋白的结合位点（图4）。因此，所使用的亲代T7噬菌体文库的多样性（1.7 × 10⁷ pfu/mL）足以用于启发式地重构药物结合位点。

通常，在随机挑选的16个噬菌斑中，会出现3—5个T7噬菌体克隆，其展示的序列与含有药物识别氨基酸片段的15肽氨基酸序列相同，表明按照本实验方案进行的亲和筛选已成功。这说明在分离出的96个噬菌斑（该数量与微孔板的格式相关）中，可收集到18—30种不同的药物识别肽序列，随后通过DNA测序并推导出相应的氨基酸序列来鉴定这些序列。在本策略中，将8 μL的T7噬菌体文库注入含有8 mL缓冲液的比色皿中（即文库稀释1000倍），有助于减少T7噬菌体的非特异性结合。为了提高亲和筛选肽的多样性，重复进行单轮筛选多次，并在每次筛选中分离16或32个噬菌斑，比单次从一个溶液中分离更为有效。例如，为了有效收集约30种不同序列的亲和筛选肽，需进行3—6轮单轮筛选，每次实验分离16或32个噬菌斑。若在全部16或32个T7噬菌体噬菌斑中均出现相同序列，则提示可能为背景信号的偶然检测，或存在交叉污染。相反，若未发现具有相同序列的T7噬菌体，或出现大量短于15肽长度的肽序列，则表明群体中的T7噬菌体极有可能是非特异性地出现。由于即使在这些情况下，QCM频率的降低程度也相似，因此筛选是否成功应通过对分离的T7噬菌体进行DNA测序，并进一步对肽的氨基酸序列进行生物信息学分析，综合评估。此外，与传统的T7噬菌体展示技术不同，重复多轮筛选的效果较差，因为即使重复进行扩增和筛选步骤，T7噬菌体的种类和数量变化仍较小，且无法有效富集²³。

重要的是，该方法适用于挖掘人类、致病病毒甚至植物蛋白质组中的小分子结合位点。有趣的是，T7噬菌体衣壳表面展示的短肽可能具有无固定结构的特性，其分子动力学特征可模拟蛋白质肽段与小分子对接过程中的动态行为，从而反映动态结合状态²⁴。相较于传统方法的技术局限，该策略可应用于针对小分子的标准化实验流程，不仅有望拓展可成药蛋白质组的范围，还能在药物-蛋白质相互作用分析中提供更高的精细度。

应考虑该方法的某些技术局限性。小分子在生物传感器芯片金电极表面的固定需要通过有机合成来实现。对于非有机化学专业人员，可使用市售的某些固定试剂，通过偶联反应将小分子机械地固定在表面。此外，在T7噬菌体复制过程中，某些肽段的无义区域可能导致检测到与药物结合无关的蛋白质部分，从而产生假阳性结果。这种情况在经验上对应于富含亮氨酸或缬氨酸残基的β-折叠或富含亮氨酸的结构域，这些残基所对应的密码子数量多于其他标准氨基酸。控制文库中肽段的长度可能有助于减少假阳性的发生。相反，也存在这样的情况：通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）分析已证实参与药物对接的药物结合位点中的氨基酸残基未被检测到。这一问题可通过收集更多识别药物的肽段，或改变小分子在金电极表面的固定方向来解决。

许多与药物使用的主要作用和次要作用相关的药物-蛋白质相互作用可能在蛋白质组中尚未被识别；此外，负责药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性的酶及转运蛋白也可能仍未被完全鉴定。蛋白质结合并不总是药物生物活性的原因。因此，结合来自生物学检测的其他信息将有助于更准确地识别与药物主要作用及不良反应相关的关键药物靶点。对该简明技术的进一步改进将提高其实用性和通量，从而更有效地挖掘多种小分子药物的蛋白质结合位点。本文所述方法将不仅极大地促进相关领域的基础研究，还有助于阐明临床用药中治疗效果或其他生物学效应背后的分子机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCM2008-STKIT	包含玻璃比色皿、搅拌磁子、配备 Windows PC 的操作与分析软件
AADIV	东北大学 （Lee Makowski）	AADIV.exe	计算每种20种氨基酸在各个重组插入位点的出现频率，以及该组肽序列中每种氨基酸的整体位置无关频率。同时基于从文库中随机抽样的有限数量成员所获得的序列，采用统计抽样方法粗略估计展示文库的序列多样性。
陶瓷传感器芯片	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCMST27C	每包含4个传感器芯片
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich （美国密苏里州圣路易斯）	D8418
乙醇	Merck (美国新泽西州凯尼尔沃思)	09-0850
FASTAcon	东北大学 （Lee Makowski）	FASTAcon.exe	从群体中识别具有短保守序列的蛋白质。
FASTAskan	东北大学 （Lee Makowski）	FASTAskan.exe	列出与肽群体高度相似的蛋白质。
AFFINIX 固定化试剂盒	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCMIMKT	自组装单分子层（SAM）试剂和胺偶联试剂
INFO	东北大学 （Lee Makowski）	INFO.exe	提供一种数学度量，用于评估通过随机机会（即非特异性结合）而非针对特定性质（如对小分子的亲和力）的选择机制观察到特定肽序列的概率。
液体LB培养基	Sigma-Aldrich （美国密苏里州圣路易斯）	L3522	高压灭菌20分钟
MATCH	东北大学 （Lee Makowski）	MATCH.exe	识别特定蛋白质内与亲和筛选肽群具有显著相似性的氨基酸残基片段。输出结果为基于改进的BLOSUM62矩阵（使用短窗口，长度为5–6个氨基酸）计算得到的聚类图和累积相似性图。
MOTIF1	东北大学 （Lee Makowski）	MOTIF1.exe	在肽群体中搜索三个连续氨基酸的序列基序。
MOTIF2	东北大学 （Lee Makowski）	MOTIF2.exe	搜索三个氨基酸的模式，不允许保守性氨基酸替换，但允许相同的间隔长度。
NaCl	Merck (美国新泽西州凯尼尔沃思)	S3014
受体配体相互作用分析（RELIC）	阿贡国家实验室 （美国伊利诺伊州莱蒙特）	https://www.relic.anl.gov	目前不可用 （独立程序可根据请求向通讯作者索取使用）
Tris	Merck (美国新泽西州凯尼尔沃思)	252859