小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

摘要

我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、屏蔽照射骨髓移植以及无预处理的骨髓移植方法（过继性BMT），用于小鼠模型中克隆性造血的研究。

摘要

克隆性造血是一种常见的与年龄相关的状态，由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的累积所致。驱动基因的突变可赋予细胞适应性优势，导致HSPC克隆扩增，并持续产生携带该体细胞突变的子代白细胞。由于克隆性造血已被证实与心脏病、中风及死亡率相关，因此建立能够模拟这些过程的实验体系，对于理解这一新型风险因素背后的机制至关重要。在小鼠中，常采用涉及骨髓清除性预处理的骨髓移植技术（例如全身照射，TBI）来研究免疫细胞在心血管疾病中的作用。然而，此类方法不可避免地会对骨髓微环境以及其他关注部位（如心脏和大脑）造成同时损伤。因此，本实验室开发了两种替代方法，以尽量减少或避免TBI可能引起的副作用：1）加用辐射屏蔽的骨髓移植；2）向未经预处理的小鼠进行过继性骨髓移植（adoptive BMT）。在加用屏蔽的器官中，局部微环境得以保留，从而可在不影响组织驻留免疫细胞功能的前提下分析克隆性造血。相比之下，向未经预处理小鼠进行的过继性骨髓移植还具有额外优势，即不仅器官的局部环境，而且造血微环境均得以完整保留。本文中，我们比较了三种不同的造血细胞重建方法，并讨论其在心血管疾病中研究克隆性造血时的优势与局限性。

引言

克隆性造血（clonal hematopoiesis, CH）是一种在老年人群中常见的状态，由携带遗传突变的造血干细胞和祖细胞（HSPC）克隆扩增所致¹。研究表明，到50岁时，大多数个体的每个HSPC中平均已积累五个外显子突变²，但这些突变中的大多数对个体几乎不产生或仅产生轻微的表型影响。然而，如果某个突变偶然赋予HSPC竞争优势——例如促进其增殖、自我更新、存活能力，或上述能力的某种组合——则可能导致该突变克隆相对于其他HSPC优先扩增。随着突变的HSPC不断生成成熟的血细胞，该突变将在造血系统中持续扩散，从而在外周血中形成一个独特的突变细胞群体。尽管已有数十个候选驱动基因的突变被发现与造血系统中的克隆事件相关，其中以DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和十一个易位2（TET2）基因的突变最为常见³。多项流行病学研究发现，携带这些遗传突变的个体患心血管疾病（CVD）、中风以及全因死亡的风险显著升高^3,4,5,6,7。尽管这些研究已证实CH与心血管疾病及中风发生率升高之间存在关联，但我们尚不清楚这种关系是因果性的，还是与衰老过程共存的表象。为了更深入理解这一关联，需要建立能够准确模拟人类CH状态的合适动物模型。

我们课题组及其他研究团队已利用斑马鱼、小鼠和非人灵长类动物建立了多种克隆性造血（CH）动物模型^{8,9,10,11,12,13,14}。这些模型通常采用通过移植基因修饰细胞实现的造血重建方法，有时结合Cre-lox重组系统或CRISPR系统。该策略可针对造血细胞中的特定基因突变进行分析，以评估其在疾病发生中的作用。此外，这些模型常使用同源品系细胞或报告细胞，以区分突变细胞与正常细胞或野生型细胞的效应。在多数情况下，需采用预处理方案以成功植入供体造血干细胞。

目前，将骨髓移植至受体小鼠的方法主要分为两类：1）清髓性预处理和2）非预处理移植。清髓性预处理可通过两种方法实现，即全身照射（TBI）或化疗¹⁵。TBI通过给予受体致死剂量的γ射线或X射线照射，导致快速分裂细胞内的DNA断裂或交联，使其无法修复¹⁶。白消安和环磷酰胺是两种常用的化疗药物，可破坏造血微环境，并同样引起快速分裂细胞的DNA损伤。清髓性预处理的最终结果是造血细胞发生凋亡，从而摧毁受体的造血系统。该策略不仅有助于供体造血干细胞和祖细胞（HSPC）的成功植入，还可通过抑制受体免疫系统防止移植物排斥。然而，清髓性预处理存在严重副作用，包括对组织器官及其驻留免疫细胞的损伤，以及对原有骨髓微环境的破坏¹⁷。因此，已有研究提出替代方法以克服这些不良影响，尤其是在保护目标器官方面。这些方法包括对受体小鼠进行局部屏蔽照射以及向未经预处理的小鼠进行过继性骨髓移植（BMT）^9,17。通过铅板屏蔽胸部、腹腔、头部或其他区域，可使特定组织免受辐射损伤，并维持其驻留免疫细胞群体。另一方面，向未经预处理小鼠进行HSPC的过继性BMT还具有额外优势，即能够保留原有的造血微环境。在本论文中，我们描述了在小鼠中采用多种移植方案后HSPC植入的实验流程与结果，具体包括将HSPC移植至接受TBI处理的小鼠、接受部分屏蔽照射的小鼠以及未经预处理的小鼠。总体目标是帮助研究人员理解每种方法的不同生理效应，以及它们在克隆性造血（CH）和心血管疾病研究背景下对实验结果的影响。

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 预处理前

1. 在照射前约24小时，将受体小鼠置于添加抗生素的饮水中（5 mM 磺胺甲噁唑，0.86 mM 甲氧苄啶）。此步骤是必要的，以预防感染，因为照射后免疫系统将受到抑制，并需在照射后持续维持抗生素饮水2周。此时，应为小鼠补充营养/补水凝胶，以促进进食，并防止照射后体重下降和脱水。

图1：显示各种预处理照射装置的示意图。（A）使用伽马射线（铯-137）的Pie-cage全身照射装置：辐射束从照射仪后方沿y轴方向射出（水平照射）。（B）使用X射线的小鼠笼式全身照射装置：将小鼠笼置于反射腔内。辐射束从照射仪顶部呈圆锥形射出（垂直照射）。辐射源到笼子的距离为530 mm。（C）X射线照射仪中的可调托盘：该装置用于X射线部分屏蔽照射。辐射束从照射仪顶部呈圆锥形射出（垂直照射）。辐射源到托盘的距离为373 mm，半径为250 mm。（D）胸部屏蔽：将麻醉后的小鼠放置于托盘上，仰卧位，四肢完全伸展，彼此呈倒置排列。铅屏蔽的下端与剑突骨对齐，上端与胸腺对齐。（E）腹部屏蔽：将麻醉后的小鼠按胸部屏蔽装置的方式放置，铅屏蔽的下端与肛门对齐，上端位于膈肌下方。（F）使用伽马射线（铯-137）的头部屏蔽照射装置：将麻醉小鼠的前肢固定，小鼠置于圆锥形束缚器中。黑色铅屏蔽（已标记）覆盖小鼠头部和耳朵。辐射束从照射仪后方沿Y轴方向射出（水平照射）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 受体小鼠的预处理（可选）

1. 全身照射
   1. 将受体小鼠放入均匀分割的扇形笼中，或放入反射腔内经计算半径范围内的小鼠笼中，以确保接受相同的照射剂量；但建议每个扇形笼最多放置8只小鼠，每个小鼠笼最多放置5只小鼠，以保证照射均匀（图1A,B）。
   2. 为实现完全的骨髓清除，需确保受体小鼠接受总剂量为11 Gy的辐射，分两次给予，每次5.5 Gy，两次间隔时间为4–24小时。
      注：虽然在两次照射之间采用4小时间隔可获得最佳移植效果，但该间隔可延长至24小时，这在人力和/或照射设备不可用时可能更为实用。
2. 部分屏蔽照射
   1. 通过腹腔注射给予受体小鼠氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）进行麻醉。在屏蔽过程中，固定小鼠体位至关重要，以确保照射均匀并有效保护目标器官。
   2. 对于胸部和腹部屏蔽，将X射线照射仪的辐射束垂直对准小鼠（图1C）。
      1. 将麻醉后的小鼠置于平板上，辐射源位于上方居中位置。将小鼠以仰卧位倒置放置，四肢完全伸展（图1D,E）。
         注：本实验所用X射线照射设施允许每次最多两只小鼠置于可实现均匀照射的有效半径范围内。有效半径基于辐射源与托盘之间的距离计算，可同时照射的动物数量取决于具体的照射设备。
      2. 使用胶带将小鼠的脚掌固定在平板上，以确保在照射过程中小鼠保持不动。放置铅屏蔽材料，覆盖需要保护的区域。
      3. 对于胸部屏蔽，通过测量小鼠剑突至胸腺的长度，并计算足以抵御辐射源的铅屏蔽厚度来制备铅屏蔽。放置铅屏蔽时，使其下端与剑突对齐，上端则靠近胸腺（图1D）。
      4. 对于腹部屏蔽，通过测量小鼠肛门至膈肌的长度，并计算足以抵御辐射源的铅屏蔽厚度来制备铅屏蔽。放置铅屏蔽时，使其下端与肛门对齐，上端位于膈肌下方（图1E）。
         注：在各实验组间保持铅屏蔽定位的一致性，可能减少因小鼠体型差异带来的变异。
   3. 对于头部屏蔽，将铯照射仪的辐射束水平对准小鼠。
      1. 小心地用胶带将麻醉小鼠的前肢固定于腹部。这可确保前肢完全接受照射剂量，不会被屏蔽材料遮挡。
      2. 进行头部屏蔽时，将小鼠放入适配于铅屏蔽装置内的锥形固定器中。将小鼠置入锥形固定器后，将其滑入铅屏蔽装置内的插槽中（图1F）。铅屏蔽应完全覆盖小鼠头部和耳朵（约3.2 cm），其余身体部分暴露以便接受照射。可通过将固定器进一步推入或拉出铅屏蔽装置，调节其在屏蔽装置内的位置，以适应不同体型的动物。
      3. 将小鼠放入照射仪中，使其身体垂直于辐射源进行照射。
   4. 使小鼠接受两次5.5 Gy的照射（总剂量为11 Gy），两次照射间隔时间为4–24小时。
   5. 每次照射后，将装有麻醉小鼠的笼子置于加热垫上或红色加热灯下，以防止低体温并促进麻醉恢复。
      注：使用加热灯时必须注意避免过度加热麻醉小鼠，因其无法自主逃离热源。如上所述，动物的摆放位置及铅屏蔽厚度可能因照射设备的具体特性（如辐射类型、射束方向等）而在不同研究间有所差异。研究人员需根据实际情况调整实验设置。

3. 骨组织分离

注意：供体小鼠与受体小鼠的年龄应尽量相近，最好在 8–12 周龄之间。为减少异质性（即使使用相同基因型的小鼠），建议使用至少 3 只小鼠作为供体（而非单只供体）。通常，从一只小鼠的六块骨骼（两只股骨、两只胫骨和两只肱骨）中可获得约 4000 万未分选的骨髓细胞。向每只受体小鼠移植 500 万骨髓细胞通常可确保成功植入。

1. 通过颈椎脱位法处死供体小鼠（首选方法，以避免细胞受到化学物质污染），并将每只小鼠放置于吸水垫上。
2. 使用70%乙醇喷雾对皮肤进行消毒。
3. 在肋骨下方的皮肤处做一个小的横向切口，用手紧握切口两侧的皮肤，向头部和足部方向反向撕开。将四肢的皮肤全部剥离。
4. 在肩部和肘关节处剪开，借助Kimwipe纸去除附着的肌肉和结缔组织，以获取肱骨。
5. 小心地脱位股骨与髋骨之间的髋关节。使用钝头剪刀沿股骨头剪开，分离下肢。在膝关节处剪开，分离股骨和胫骨，并借助Kimwipe纸小心去除附着的肌肉和结缔组织，以收获股骨和胫骨。
   注意：此步骤中需特别注意保持骨骺完整。因无菌性受损而导致的断裂骨骼应予以丢弃。除股骨、胫骨和肱骨外，还可收集髋骨和脊柱骨。如需收集脊柱骨，可使用研钵和研杵将骨骼压碎成小块，以收获骨髓细胞。
6. 将相同基因型小鼠的分离骨骼放入相应标记的50 mL锥形管中，每管加入20 mL预冷的无菌PBS，并置于冰上保存，待后续使用。需特别注意将骨骼正确放入对应基因型的管中。
7. 对每只供体动物重复上述步骤，每处理一只小鼠后更换手套，并使用70%乙醇清洁剪刀及其他器械。

4. 骨髓细胞的分离

注意：以下步骤需在生物安全二级柜中进行。

1. 准备离心管套装：使用18 G针头在无菌0.5 mL微量离心管底部打一个小孔，然后将其放入含有100 μL冰上预冷的无菌PBS的无菌1.5 mL微量离心管中。
   注意：由于仅能将六根骨骼放入0.5 mL微量离心管中，建议准备足够数量的管套装，以便同时处理所有骨骼。
2. 吸除PBS，并将分离出的骨骼转移至无菌100 mm细胞培养皿中。用精细镊子夹住每根骨骼，使用经高压灭菌的小剪刀小心剪去两端的骨骺，然后将剪好的骨骼放入已准备好的管套装中。
3. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心35秒。
4. 离心后，确认骨髓已成功从骨骼中脱离。骨骼应呈现白色半透明状，而1.5 mL微量离心管底部应有相对较大的红色沉淀物。弃去0.5 mL微量离心管。
   注意：若目视检查未能在1.5 mL管底部观察到骨髓，则需再次剪切骨骼并重复步骤4.3。
5. 用1 mL冰上预冷的PBS重悬骨髓，然后将相同基因型的细胞悬液转移至对应的50 mL锥形管中。
6. 使用10 mL注射器连接18 G针头，将细胞悬液反复吹打10次以解离细胞。
7. 将单细胞悬液通过70 μm细胞筛过滤。加入额外的冰上预冷PBS至终体积为10 mL，并借助移液器辅助装置轻柔地重悬细胞。
8. 在4 °C条件下，以310 × g离心10分钟。
9. 吸除上清液，用10 mL无血清RPMI培养基重悬细胞沉淀。保留30 μL用于细胞计数。
10. 使用细胞计数仪测定细胞浓度，并计算移植所需的细胞悬液体积。以100% BMT为例，每只受体小鼠需要5 × 10⁶个骨髓细胞。
    注意：对于竞争性BMT，需准备总共5 × 10⁶个骨髓细胞，其中包含供体细胞（例如CD45.2⁺）和竞争细胞（例如CD45.1⁺）的混合物。强烈建议多准备部分骨髓细胞。例如，若每实验组有10只受体小鼠，通常应准备足够用于12只受体小鼠的细胞量。
11. 将计算好的细胞悬液体积转移至新的50 mL锥形管中，在4 °C条件下以310 × g离心10分钟。
12. 吸除上清液，用计算好的无血清RPMI培养基重悬细胞，以达到适当的细胞密度和体积。通常，200 μL为经眶后注射的最佳体积。

5. 将骨髓细胞移植到经辐照的小鼠体内

1. 用 5% 异氟烷麻醉受体小鼠。
2. 在小鼠麻醉期间，使用胰岛素注射器和 28–30 G 针头，将 200 μL 骨髓细胞缓慢注射到眶后静脉中。
   1. 或者，可通过尾静脉静脉注射和股骨髓内注射的方式递送供体细胞，最大体积分别为 0.2 mL 和 25 μL。
3. 细胞注射完成后，在眼球表面滴加一滴含丙帕卡因的眼药水以缓解疼痛。随后可让动物恢复意识。

6. 非预处理小鼠的骨髓细胞移植

1. 通过吸入5%异氟烷对受体小鼠进行麻醉。
2. 使用28–30 G胰岛素注射器，将5 × 10⁶个未分选的骨髓细胞（来自任一基因型）经眶后途径注射至未经辐照的受体小鼠体内。
3. 连续3天重复步骤6.1和6.2，使受体小鼠总共接受1.5 × 10⁷个骨髓细胞的移植。
   注意：由于在无预处理条件下进行的过继性骨髓移植需要连续3天实施骨髓细胞注射，每次注射应交替使用不同眼睛。
4. 注射后，向受影响的眼睛滴加一滴含有丙帕卡因的眼药水。

结果

为了比较三种BMT/预处理方法对供体细胞植入效果的影响，通过流式细胞术分析了移植后1个月外周血和心脏组织中供体细胞的比例。分离的细胞经特异性白细胞标记物染色，以鉴定不同亚群的白细胞。在这些实验中，野生型（野生型（WT） C57BL/6（CD45.2）供体骨髓细胞被输注至 WT B6.SJL-Ptprc^aPrpc^b/BoyJ（CD45.1）受体小鼠以区分供体细胞与受体细胞。所用流式细胞术设门策略此前由Wang等描述。⁹ 在 补充图1.

接受全身照射（TBI）处理的组别在两次间隔4小时、每次5.5 Gy的总致死性辐射剂量（合计11 Gy）后，接受了5 × 10⁶个骨髓细胞。在受体小鼠的外周血中，单核细胞、中性粒细胞和B细胞几乎完全被清除，并被供体骨髓来源细胞的子代细胞所取代。此外，受体小鼠心脏中驻留的单核细胞和中性粒细胞群体也几乎完全...

讨论

在克隆性造血研究中，我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、部分屏蔽照射骨髓移植，以及一种较少使用的无需预处理的骨髓移植方法（过继性BMT）。这些方法已被用于评估克隆性造血对心血管疾病的影响。研究人员可根据其研究的具体目的对这些方法进行相应修改。

克隆性造血模型
克隆性造血是指突变的造血细胞与野生型细胞竞争，并随时间推移获得克隆优势的现象。为了建立这种竞争的模型，可将含有遗传背景不同细胞混合物的骨髓移植给小鼠。通常，该混合物包含经荧光标记或不同全白细胞标记物（如 CD45.1 和 CD45.2）标记的突变型细胞和野生型细胞。例如，在构建模拟 Tet2 介导的克隆性造血（CH）的模型时，我们对致死剂量辐照的受体小鼠进行竞争性骨髓移植，通常将来自 CD45.1 Tet2^+/+ 供体的 90% 细胞与来自 CD45.2 Tet2^-/-、Tet2^+/-...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 ml 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-121	常规耗材
1.5 ml 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129	常规耗材
1/2 cc 低剂量胰岛素注射器	EXELINT	26028	常规耗材
无水乙醇（200 proof）	Fisher chemical	200559	常规耗材
BD 1 ml 结核菌素注射器，25G，5/8 英寸针头	Becton Dickinson	309626	常规耗材
BD PrecisionGlide 针头，18G（1.22 mm × 25 mm）	Becton Dickinson	395195	常规耗材
铯-137 照射仪	J. L. Shepherd	Mark IV	设备
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	常规耗材
Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿	Life Sciences	353003	常规耗材
Falcon 50 ml 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352098	常规耗材
Fisherbrand 70 μm 无菌细胞筛	Fisher Scientific	22363548	常规耗材
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11051-10	常规耗材
硬化精细剪刀	Fine Science Tools	14090-09	常规耗材
Isothesia（异氟烷）溶液	Henry Schein	29404	溶液
氯胺酮	Zoetis	043-304	注射剂
Kimwipes 精密擦拭纸	Kimtech Science	KCC34155	常规耗材
PBS pH 7.4（1X）	Gibco	10010023	溶液
RadDisk – 啮齿类动物照射盘	Braintree Scientific	IRD-P M	常规耗材
RPMI 1640 培养基（1X）	Gibco	11875-093	培养基
磺胺甲噁唑和甲氧苄啶	TEVA	0703-9526-01	注射剂
赛拉嗪	Akorn	139-236	注射剂
X 射线照射仪	Rad source	RS-2000	设备