我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、屏蔽照射骨髓移植以及无预处理的骨髓移植方法（过继性BMT），用于小鼠模型中克隆性造血的研究。
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本文内容
摘要
摘要
克隆性造血是一种常见的与年龄相关的状态，由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的累积所致。驱动基因的突变可赋予细胞适应性优势，导致HSPC克隆扩增，并持续产生携带该体细胞突变的子代白细胞。由于克隆性造血已被证实与心脏病、中风及死亡率相关，因此建立能够模拟这些过程的实验体系，对于理解这一新型风险因素背后的机制至关重要。在小鼠中，常采用涉及骨髓清除性预处理的骨髓移植技术（例如全身照射，TBI）来研究免疫细胞在心血管疾病中的作用。然而，此类方法不可避免地会对骨髓微环境以及其他关注部位（如心脏和大脑）造成同时损伤。因此，本实验室开发了两种替代方法，以尽量减少或避免TBI可能引起的副作用：1）加用辐射屏蔽的骨髓移植；2）向未经预处理的小鼠进行过继性骨髓移植（adoptive BMT）。在加用屏蔽的器官中，局部微环境得以保留，从而可在不影响组织驻留免疫细胞功能的前提下分析克隆性造血。相比之下，向未经预处理小鼠进行的过继性骨髓移植还具有额外优势，即不仅器官的局部环境，而且造血微环境均得以完整保留。本文中，我们比较了三种不同的造血细胞重建方法，并讨论其在心血管疾病中研究克隆性造血时的优势与局限性。
引言
克隆性造血（clonal hematopoiesis, CH）是一种在老年人群中常见的状态，由携带遗传突变的造血干细胞和祖细胞（HSPC）克隆扩增所致1。研究表明，到50岁时，大多数个体的每个HSPC中平均已积累五个外显子突变2，但这些突变中的大多数对个体几乎不产生或仅产生轻微的表型影响。然而，如果某个突变偶然赋予HSPC竞争优势——例如促进其增殖、自我更新、存活能力，或上述能力的某种组合——则可能导致该突变克隆相对于其他HSPC优先扩增。随着突变的HSPC不断生成成熟的血细胞，该突变将在造血系统中持续扩散，从而在外周血中形成一个独特的突变细胞群体。尽管已有数十个候选驱动基因的突变被发现与造血系统中的克隆事件相关，其中以DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和十一个易位2（TET2）基因的突变最为常见3。多项流行病学研究发现，携带这些遗传突变的个体患心血管疾病（CVD）、中风以及全因死亡的风险显著升高3,4,5,6,7。尽管这些研究已....
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 预处理前
- 在照射前约24小时，将受体小鼠置于添加抗生素的饮水中（5 mM 磺胺甲噁唑，0.86 mM 甲氧苄啶）。此步骤是必要的，以防止感染，因为照射后免疫系统将受到抑制，并需在照射后持续维持2周。此时，应为小鼠补充营养/补水凝胶，以促进进食，并防止照射后体重下降和脱水。
图 1：显示不同预处理装置的图像。（A）使用伽马射线（铯-137）的全身照射 pie-cage 装置：辐射束从照射仪后方沿 y 轴方向射出（水平照射）。（B）使用 X 射线的小鼠笼全身照射装置：将小鼠笼置于反射室内。辐射束从照射仪顶部以锥形射出（垂直照射）。辐射源到笼子的距离为 530....
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结果
为了比较三种BMT/预处理方法对供体细胞植入效果的影响，通过流式细胞术分析了移植后1个月外周血和心脏组织中供体细胞的比例。分离的细胞经特异性白细胞标记物染色，以鉴定不同亚群的白细胞。在这些实验中，野生型（野生型 C57BL/6（CD45.2）供体骨髓细胞被输注至 WT B6.SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ（CD45.1）受体小鼠以区分供体细胞与受体细胞。所用流式细胞术设门策略此前由Wang等描述。9 在 补充图1.
接受全身照射（TBI）处理的组别在两次间隔4小时、每次5.5 Gy的总致死性辐射剂量（合计11 Gy）后，接受了5 × 106个骨髓细胞。在受体小鼠的外周血中，单核细胞、中性粒细胞和B细胞几乎完全被清除，并被供体骨髓来源细胞的子代细胞所取代。此外，受体小鼠心脏中驻留的单核细胞和中性粒细胞群体也几乎完全被供体来.......
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讨论
在克隆性造血研究中，我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、部分屏蔽照射骨髓移植，以及一种较少使用的无需预处理的骨髓移植方法（过继性BMT）。这些方法已被用于评估克隆性造血对心血管疾病的影响。研究人员可根据其研究的具体目的对这些方法进行相应修改。
克隆性造血模型
克隆性造血是指突变的造血细胞与野生型细胞竞争，并随时间推移获得克隆优势的现象。为了建立这种竞争的模型，可将含有遗传背景不同细胞混合物的骨髓移植给小鼠。通常，该混合物包含经荧光标记或不同全白细胞标记物（如 CD45.1 和 CD45.2）标记的突变型细胞和野生型细胞。例如，在构建模拟 Tet2 介导的克隆性造血（CH）的模型时，我们对致死剂量辐照的受体小鼠进行竞争性骨髓移植，通常将来自 CD45.1 Tet2+/+ 供体的 90% 细胞与来自 CD45.2 Tet2-/-、Tet2+/-.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院向 K. Walsh（资助号：HL131006、HL138014 和 HL132564）、向 S. Sano（资助号：HL152174）提供的资助，美国心脏协会向 M. A. Evans（资助号：20POST35210098）提供的资助，以及日本心脏基金会向 H. Ogawa 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 ml 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-121 | 常规耗材 |
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 常规耗材 |
| 1/2 cc 低剂量胰岛素注射器 | EXELINT | 26028 | 常规耗材 |
| 无水乙醇（200 proof） | Fisher chemical | 200559 | 常规耗材 |
| BD 1 ml 结核菌素注射器，25G，5/8 英寸针头 | Becton Dickinson | 309626 | 常规耗材 |
| BD PrecisionGlide 针头，18G（1.22 mm × 25 mm） | Becton Dickinson | 395195 | 常规耗材 |
| 铯-137 照射仪 | J. L. Shepherd | Mark IV | 设备 |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | 常规耗材 |
| Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿 | Life Sciences | 353003 | 常规耗材 |
| Falcon 50 ml 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 352098 | 常规耗材 |
| Fisherbrand 70 μm 无菌细胞筛 | Fisher Scientific | 22363548 | 常规耗材 |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11051-10 | 常规耗材 |
| 硬化精细剪刀 | Fine Science Tools | 14090-09 | 常规耗材 |
| Isothesia（异氟烷）溶液 | Henry Schein | 29404 | 溶液 |
| 氯胺酮 | Zoetis | 043-304 | 注射剂 |
| Kimwipes 精密擦拭纸 | Kimtech Science | KCC34155 | 常规耗材 |
| PBS pH 7.4（1X） | Gibco | 10010023 | 溶液 |
| RadDisk – 啮齿类动物照射盘 | Braintree Scientific | IRD-P M | 常规耗材 |
| RPMI 1640 培养基（1X） | Gibco | 11875-093 | 培养基 |
| 磺胺甲噁唑和甲氧苄啶 | TEVA | 0703-9526-01 | 注射剂 |
| 赛拉嗪 | Akorn | 139-236 | 注射剂 |
| X 射线照射仪 | Rad source | RS-2000 | 设备 |
参考文献
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.....
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重印与许可
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