卵巢组织细菌的特征和功能预测

摘要

为了发现和区分原位癌和非癌卵巢组织的细菌，进行了免疫造血染色和16S核糖核化核糖核素（16S rRNA基因）测序。通过利用"未观测状态"（PICRUST）重建对社区的虫基和邻苯二甲酸酯遗传学调查来预测细菌的组成和功能差异。

摘要

由于细菌检测的进步，"无菌"女性上生殖道理论一直遭到越来越多的反对。然而，卵巢是否含有细菌尚未得到证实。在此，引入了检测卵巢组织细菌的实验。我们选择了癌症组的卵巢癌患者和对照组的非癌患者。16S rRNA基因测序用于区分卵巢组织中的细菌与癌症和对照组。此外，我们使用虫基和PICRUSt预测了所识别细菌的功能组成。这种方法也可以用于其他内脏和组织，因为许多器官已被证明含有细菌近年来。内脏和组织中细菌的存在可能有助于科学家评估癌变和正常组织，并可能有助于癌症的治疗。

引言

最近，越来越多的文章发表，证明细菌在腹部固体内脏的存在，如肾脏，脾脏，肝脏和卵巢^1，2。盖勒等人在胰腺肿瘤中发现了细菌，这些细菌对^{化疗药物2}的宝石素具有抗药性。曼弗雷多·维埃拉等人的结论是，肠球菌胆汁可移植到淋巴结、肝脏和脾脏，可以驱动自身免疫^3。

由于子宫颈起到防御作用，对含有子宫、输卵管和卵巢的女性上部生殖道中的细菌的研究很少。然而，近年来已经建立了一些新的理论。由于粘液^4，5的变化，细菌在月经周期内可能进入子宫腔。此外，泽沃马诺拉基斯等人证实，子宫与输卵管一起，是由卵巢内分泌系统控制的内分泌泵，这种排列使细菌能够进入子宫内膜、输卵管和卵巢^6。

由于细菌检测方法的发展，上生殖道不再是一个谜了。Verstraelen等人使用条形码配对端测序方法，通过瞄准16SRNA基因⁷的V1-2超变区域来发现子宫细菌。方等人对子宫内息肉患者采用条形码测序，揭示了宫内细菌^的多样性。此外，通过使用16SRNA基因，迈尔斯等人和陈等人^分别在接受过萨平果卵巢切除术和子宫切除术的妇女的生殖器系统中发现了^细菌。

近年来，肿瘤组织中的细菌越来越受到重视。班纳吉等人发现，卵巢癌患者之间的微生物群特征不同，对照^10。氧纳龙西比里库姆与肿瘤阶段有关，甲基苯丙胺血管瘤可用于诊断卵巢癌^11。除卵巢癌外，胃、肺、前列腺、乳腺癌、子宫颈癌和子宫内膜癌等其他癌症也与12、13、14、15、16、17、18等细菌有关。Poore等人提出了一种新的基于微生物的肿瘤诊断，预见到早期癌症筛查^19。在这个协议中，我们通过比较这两种组织中细菌的组成和功能，调查了癌性卵巢组织和正常卵巢组织之间的差异。

进行了免疫造血染色和16S rRNA基因测序，以确认卵巢中是否存在细菌。研究了卵巢细菌在癌性和非癌性卵巢组织中的差异和预测功能。结果表明卵巢组织中存在细菌。 氧纳龙西比里库姆 和 梅萨诺萨尔西纳真空素 分别与卵巢癌的阶段和诊断有关。比较了两组存在46种明显不同的KEGG通路。

方案

本研究获西安交通大学第一附属医院医疗机构伦理委员会批准（第1号）XJTUIAF2018LSK-139）。所有登记的患者都获得了知情同意。

1. 进入癌症组和对照组的标准

1. 对于癌症组，登记主要被诊断为卵巢癌的患者，腹腔切除术后，通过病理学发现，他们证明患有血清卵巢癌。
2. 对于对照组，登记主要被诊断为子宫肌瘤或子宫腺造血的患者，而不出现任何卵巢状况，并接受子宫切除术和注射性卵巢切除术的患者。
   注:此标准尚未确定。不影响接受子宫切除术和唾液卵巢切除术的卵巢的疾病患者也可以登记。
3. 排除有以下一项或多个标准的患者:
   怀孕或哺乳期妇女。
   手术前2个月服用抗生素。
   有发烧或炎症标记升高。
   有任何炎症。
   接受了新疗法化疗。

2. 收集样品

1. 在手术过程中，将切除的卵巢放入无菌管中，并将管子放入液氮中进行运输。在整个过程中避免触摸任何其他内容。
2. 将卵巢分离成约1厘米厚的组织样本，在层压流柜下用一对新的无菌钳子。分离后，将样品保存在 -80 °C 下。
   注:采集样本的所有程序都是无菌的，包括分离卵巢。

3. 序列 16S rRNA 基因

1. 提取DNA。
   1. 在 2 mL 离心机管中加入 1.2 mL 抑制 EX 缓冲。然后，在管中加入180-220毫克的样品。让样品完全混合（70 °C水浴5分钟，然后漩涡15秒）。
   2. 离心管 1 分钟在 600 x g.
   3. 将 550 μL 的超高纳特放入新的 1.5 mL 管中，离心机在 600 x g 下放置 1 分钟。
   4. 将 400 μL 的超高超纳特与 30 μL 蛋白酶 K 转移到另一个 1.5 mL 管中。
   5. 添加 400 μL 缓冲 AL，并使用漩涡搅拌机 15s。
   6. 在 70 °C 下孵育 10 分钟。
   7. 加入 400 μL 的 96-100% 酒精。使用漩涡搅拌机 15s。
   8. 将 600 μL 的混合物转移到吸收柱和离心机中 1 分钟，13700 g。交换下管。重复此步骤 11 次。
   9. 加入 500 μL 缓冲器 AW1，离心机 1 分钟，13，700 x g，并更换下管。
   10. 加入 500 μL 缓冲器 AW2，离心机 3 分钟，13，700 x g，并更换下管。
   11. 离心机 3 分钟，13，700 x g。
   12. 将混合物转移到一个新的 1.5 mL 管中，加入 200 μL 的缓冲 ATE，在室温下孵育 5 分钟，离心机在 13，700 x g 下孵化 1 分钟。
2. 质量测试。使用 1% 塞法罗斯凝胶电泳来测试质量。加入400 ng样品，120 V，30分钟。理想结果:DNA浓度:≥10 ng/μL，DNA纯度:A260/A280 = 1.8-2.0，总DNA:≥300 ng。
3. 根据制造商的协议，使用 16S 元测序套件准备库。
   1. 执行 PCR。简言之，每个 25 μL PCR 反应都包含 12.5 ng 的样本 DNA 作为输入，12.5 μL 的 2 倍 KAPA HiFi HotStartReadMix 和 5 μL 的每个引物在 1 μM。
   2. 使用以下协议执行 PCR:在 95°C 下执行初始变性步骤 3 分钟，然后是 25 周期的变性 （95°C， 30 秒）、退火 （55°C、30 秒） 和扩展 （72°C、 30 秒）， 以及 72°C 下 5 分钟的最终拉长。
   3. 使用制造商的说明，用磁珠从反应组合中清理 PCR 产品。
   4. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2。
   5. 质量测试。请参阅步骤 3.2。
   6. 重复步骤 3.3.3。
   7. 质量测试。使用 1% Sepharose 凝胶电泳来测试杂质，光谱光谱仪测试纯度，荧光仪测试浓度，RNA检测套件测试完整性。按照制造商的协议。使图书馆正常化和汇集;然后使用 600 循环 V3 标准流量单元进行序列（2 x 300 bp 配对端读取设置），产生约 100，000 个配对端 2 x 300 基读数。
      注: 全长引物序列: 16S 安普利康聚合酶链反应 （PCR） 前进引物: 5' TCGTCCGTCTAGAGTAGAG-+CCTAC 格格格格格和 16s 安普利康 Pcr 反向引物: 5' Gtctcgtcggaggtaagagag - [加塔格塔加加格 - [加塔格塔克] 。

4. 分析 16S rRNA 基因测序数据

1. 过滤每个样本的原始读取基于测序质量与软件包QIIME 2-201802^20。
   1. 将三个文件复制到目录中:emp 配对端-sequences_01
      一个 转发.fastq.gz 包含前方序列读取的文件，
      一个 反向.fastq.gz 包含反向序列的文件读取，
      一个 条形码.fastq.gz 包含相关条形码读取的文件
   2. 执行
      奇美工具导入 |
      - 类型 Emp 电子邮件尾声 |
      - 输入路径 emp 配对端sequences_01 ] 输出路径 emp 配对端sequences_02. qza
2. 移除引物和适配器序列。
   奇梅切贴修剪配对 |
   - - - - 去多重序列去多重 - seqs_02. qza ]
   - p - 前 f Gc 塔克格格 |
   - - p - 前 r Gctacgg =
   -p 错误率 0 |
   -质量截止 25 |
   - - o 修剪序列修剪 - seqs_03. qza ]
   -冗长
3. 缩短序列读取，其中两个配对端质量都低于 25。见上文 - 质量截止 25
4. 分析测序数据。
   1. 收集序列以形成具有 97% 的相似性截止的操作分类单元 （OTUs）。
      奇伊姆 vs 搜索去功能序列 |
      - - i 序列修剪 - seqs_03. qza ]
      - 减损表table_04. qza ]
      - 去功能化序列代表 - seqs_04. qza
      ​
      奇梅 vsearch 集群功能 - 封闭参考 |
      - - - i 表table_04. qza ]
      - - i 序列代表 - seqs_04. qza ]
      -i 参考序列97_otus. qza ]
      -p-perc 标识 0.97 |
      - - - 集群表 - cr - 97. qza |
      - - o 集群序列代表 - 塞克斯 - cr - 97. qza ]
      -o 无与伦比的序列无与伦比的 cr - 97. qza
   2. 对于 OTUs，计算每个样本的相对丰度。丰度信息在表 cr-97.qza 中
5. 使用本地贝叶斯分类器，其目标是 RDP 培训集（版本 9;http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/），对所有序列进行排序。映射分类信息在表 cr-97.qza 中
6. 在给定的 OTU 中，分配一个反映序列与 OTU 的主要一致性的分类。然后，对齐 OTUs。请参阅表 -cr-97.qza 和代表 -塞克斯-cr-97.qza
7. 基于样本组信息，执行字母多样性（包括超 1、ACE、香农、辛普森和均匀度索引）和基于 UniFrac 的主要坐标分析 （PCoA）。
   奇美工具出口 |
   - - 输入路径表 - cr - 97. qza |
   --输出路径输出功能表
   导出功能表
   
   奇梅多样性阿尔法 |
   -i 表 - cr - 97. qza |
   -p 指标observed_otus |
   -o - 阿尔法多样性observed_otus_vector. qza
   
   奇梅多样性贝塔 |
   -i 表 - cr - 97. qza |
   - - p - 公制布雷库蒂斯 |
   -o 距离矩阵unweighted_unifrac_distance_matrix. qza

5. 预测细菌功能

1. 要预测细菌特征的相关表现，请使用 BugBase^21。BugBase 的输入 OTU 表使用以下命令编制。
   生物转化 - i otu_table. 生物 - o otu_table.txt - 到 tsv
   生物转换 - i otu_table.txt - o otu_table_json. biom - 表类型 = "Otu 表" - 到 json
   注:该预测基于六个表型类别（Ward等人 未发布）（https://bugbase.cs.umn.edu/）:Gram 染色、耐氧性、形成生物膜的能力、移动元素含量、致病性和氧化应激耐受性。
2. 使用标记基因数据和包含参考基因组²²的数据库，预测PICRUSt的元基因组的功能组成。
   make_otu_table.py - i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt - t /mnt/nas_bioinfo/参考/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt - o otu_table.biom |
   normalize_by_copy_number.py - i otu_table. 生物 - o normalized_otus. 生物
   predict_metagenomes.py - i normalized_otus. 生物 - o metagenome_predictions. 生物
   categorize_by_function.py - i metagenome_predictions. biom - c "KEGG_Pathways" - l 1 - o picrust_L1. 生物
   categorize_by_function.py - f - i metagenome_predictions. biom - c KEGG_Pathways - l 1 - o metagenome_predictions。L1.txt
3. 在 STAMP^23、24的帮助下^分析每组功能的差异。请参阅操作软件的引文。

6. 数据

1. 使用统计软件计算调查结果的重要性。统计意义的表示应设定为P<0.05。
2. 通过学生 t 测试评估年龄和均等的差异。通过奇方测试评估更年期状况、高血压史和糖尿病的差异。通过曼-惠特尼 U 测试评估卵巢细菌分类数量的差异。

结果

病人
共有16名合格的患者参与了这项研究。对照组包括10名诊断为良性子宫肿瘤的妇女（其中3名患者被诊断为子宫肌瘤，7名患者被诊断为子宫腺瘤）。同时，癌症组包括6名诊断为血清卵巢癌的妇女（其中2名患者被诊断为II期，2名被诊断为III期）。以下特征表明对照组和癌症组的患者之间没有差异:年龄、更年期状况、均等、高血压史和糖尿病史（表1）。

表1:患者统计请点击这里下载此表。

两组卵巢细菌物种的丰富性和多样性
图1显示，使用免疫造血术染色的细菌的存在。微生物的α多样性被分析为检测卵巢细菌物种的丰富性和多样性的方法。卵巢癌组织中观察到的物种数量小于对照组，没有显著差异。细菌物种的丰富性（...

讨论

卵巢癌对^{女性生育能力}有显著影响。大多数卵巢癌患者在晚期被诊断出来，5年生存率低于^30%18。腹部固体内脏（包括肝脏、胰腺和脾脏）中的细菌确认已经发表。上部女性生殖道中细菌的存在是因为子宫颈没有封闭^{2，3，4，5。}然而，卵巢，这是腹部固体内脏，是否无菌或尚未确定。此外，卵巢中的细菌是否与卵巢癌有关也是一个重要问题。

我们发现的细菌的显著差异被比较了不同的组。上述所有程序均严格无细菌，包括仪器、试剂、设备和整个协议的操作。更重要的是，我们使用良性子宫疾病患者的卵巢作为对照组来对抗可能的污染。但是，在此协议中，无法避免污染。因此，由于癌症组和对照组是在同一实验环境中分析的，仅通过比较这两组的差异，就可以获得卵巢癌微生物起源的主要证据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2200 TapeStation 软件	Agilgent 美国
AmpliSeq for Illumina 文库制备、索引和附件	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
徕卡 ASP 300S	徕卡生物系统部 徕卡显微系统
徕卡 EG 1150	徕卡生物系统部徕卡显微系统
徕卡 RM2235	徕卡生物系统部门 徕卡显微系统
LPS 核心单克隆抗体，克隆 WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus 磁珠	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind 通用病原体 96 试剂盒	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva 数据库	Max Planck 海洋微生物学研究所和雅各布斯大学
QuantiFluor dsDNA 系统	Promega	E2670
Trimmomatic	Björn Usadel
ZytoChem Plus （HRP） 抗兔 （DAB） 试剂盒	Zytomed 系统	HRP008DAB-RB