为了原位发现并区分卵巢癌组织与非癌组织中的细菌，进行了免疫组织化学染色以及16S核糖体RNA基因（16S rRNA基因）测序。采用BugBase和基于未观测状态重建的群落系统发育分析（PICRUSt）预测了细菌的组成和功能差异。
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摘要
摘要
关于女性上生殖道“无菌”理论正随着细菌检测技术的进步而面临越来越多的反对。然而，卵巢是否含有细菌至今尚未得到证实。本文介绍了一项检测卵巢组织中细菌的实验。我们选择卵巢癌患者作为癌症组，非癌性疾病患者作为对照组。采用16S rRNA基因测序技术，以区分癌症组与对照组卵巢组织中的细菌。此外，我们利用BugBase和PICRUSt对所鉴定细菌的功能组成进行了预测。近年来，许多器官已被证实含有细菌，因此该方法也可应用于其他内脏和组织。内脏及组织中细菌的存在可能有助于科学家评估癌变组织与正常组织，并可能为癌症治疗提供帮助。
引言
近年来，越来越多的文章证实了细菌存在于腹部实体脏器中，例如肾脏、脾脏、肝脏和卵巢1,2。Geller et al. 在胰腺肿瘤中发现了细菌，这些细菌对化疗药物吉西他滨（gemcitabine）具有耐药性2。S. Manfredo Vieira et al. 得出结论，Enterococcus gallinarum 可迁移至淋巴结、肝脏和脾脏，并可能诱发自身免疫反应3。
由于宫颈在防御中起着作用，女性上生殖道（包括子宫、输卵管和卵巢）中的细菌研究甚少。然而，近年来已提出一些新的理论。在月经周期中，由于黏蛋白的变化，细菌可能进入子宫腔4,5。此外，Zervomanolakis et al. 确认，子宫与输卵管共同构成一个由卵巢内分泌系统调控的节律性蠕动泵，这种结构使得细菌能够进入子宫内膜、输卵管和卵巢6。
由于细菌检测技术的发展，上生殖道已不再是一个谜。Verstraelen et al. 采用条形码配对末端测序方法，针对16S RNA基因的V1-2高变区，成功发现了子宫内的细菌7。Fang et al. 在子宫内膜息肉患者中应用条形码测序技术，揭示了宫腔内存在多种多样的细菌8。此外，Miles et al. 和 Chen et al. 分别通过16S RNA基因分析，在接受过输卵管卵巢切除术和子宫切除术的女性生殖系统中也检测到了细菌的存在5,9。
近年来，肿瘤组织中的细菌受到越来越多的关注。Banerjee 等发现，卵巢癌患者与对照组之间的微生物组特征存在差异10。其中，Anoxynatronum sibiricum 与肿瘤分期相关，而 Methanosarcina vacuolata 可能用于卵巢癌的诊断11。除卵巢癌外，其他癌症如胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌也已被证实与细菌有关12,13,14,15,16,17,18。Poore 等提出了一类基于微生物的肿瘤学诊断方法，展望了早期癌症筛查的可能性19。在本实验方案中，我们通过比较癌变组织与正常卵巢组织中细菌的组成和功能，探究两者之间的差异。
通过免疫组织化学染色和16S rRNA基因测序确认卵巢中细菌的存在。研究了癌变与非癌变卵巢组织中卵巢细菌的差异及其预测功能。结果显示，卵巢组织中存在细菌。Anoxynatronum sibiricum 和 Methanosarcina vacuolata 分别与卵巢癌的分期和诊断相关。比较了两组中46条显著不同的KEGG通路。
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方案
本研究经西安交通大学第一附属医院医学机构伦理委员会批准（编号：XJTUIAF2018LSK-139）。所有纳入患者均签署了知情同意书。
1. 癌症组与对照组的入组标准
- 对于癌症组，纳入经初步诊断为卵巢癌、并在剖腹手术后经病理检查证实为浆液性卵巢癌的患者。
- 对于对照组，纳入经初步诊断为子宫肌瘤或子宫腺肌症、无任何卵巢病变、并已接受子宫切除术及输卵管卵巢切除术的患者。
注：该标准并非绝对。任何未影响卵巢疾病且接受子宫切除术及输卵管卵巢切除术的患者亦可纳入。 - 符合以下任一条件的患者应予以排除：
妊娠或哺乳期女性。
术前2个月内使用过抗生素。
存在发热或炎症标志物升高。
患有任何类型的炎症。
曾接受新辅助化疗。
2. 收集样本
- 手术过程中，将切除的卵巢放入无菌管中，并将试管置于液氮中运输。整个操作过程避免接触其他任何物品。
- 在超净工作台内，使用一把新的无菌镊子将卵巢组织分离成厚度约为 1 cm 的组织样本。分离后，将样本保存于 -80 °C。
注意：所有样本采集步骤均为无菌操作，包括卵巢组织的分离。
3. 扩增测序16S rRNA基因
- 提取 DNA。
- 向一个 2 mL 离心管中加入 1.2 mL 的 inhibit EX 缓冲液，然后将 180–220 mg 样品加入该管中。使样品充分混匀（70 °C 水浴 5 分钟，然后涡旋振荡 15 秒）。
- 在 600 × g 条件下离心 1 分钟。
- 将 550 µL 上清液转移至一个新的 1.5 mL 管中，并在 600 × g 条件下离心 1 分钟。
- 将 400 µL 上清液与 30 µL 蛋白酶 K 一起转移至另一个 1.5 mL 管中。
- 加入 400 µL 缓冲液 AL，并使用涡旋混合器振荡 15 秒。
- 在 70 °C 下孵育 10 分钟。
- 加入 400 µL 96–100% 乙醇，使用涡旋混合器振荡 15 秒。
- 将 600 µL 混合液转移至吸附柱中，在 13,700 × g 条件下离心 1 分钟，更换下方收集管。重复此步骤 11 次。
- 加入 500 µL 缓冲液 AW1，在 13,700 × g 条件下离心 1 分钟，并更换下方收集管。
- 加入 500 µL 缓冲液 AW2，在 13,700 × g 条件下离心 3 分钟，并更换下方收集管。
- 在 13,700 × g 条件下离心 3 分钟。
- 将混合物转移至一个新的 1.5 mL 管中，加入 200 µL 缓冲液 ATE，在室温下孵育 5 分钟，然后在 13,700 × g 条件下离心 1 分钟。
- 质量检测。使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测质量。上样量为 400 ng，电压 120 V，运行 30 分钟。理想结果：DNA 浓度 ≥ 10 ng/µL，DNA 纯度 A260/A280 = 1.8–2.0，总 DNA 量 ≥ 300 ng。
- 根据生产商说明书，使用 16S 宏基因组测序试剂盒构建文库。
- 进行 PCR 扩增。简而言之，每个 25 µL 的 PCR 反应体系包含 12.5 ng 样品 DNA、12.5 µL 的 2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix 以及各 5 µL 浓度为 1 µM 的引物。
- 按照以下程序进行 PCR 扩增：95°C 预变性 3 分钟；随后进行 25 个循环的变性（95°C，30 秒）、退火（55°C，30 秒）和延伸（72°C，30 秒）；最后在 72°C 延伸 5 分钟。
- 根据生产商说明书，使用磁珠纯化 PCR 产物。
- 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2。
- 质量检测。请参考步骤 3.2。
- 重复步骤 3.3.3。
- 质量检测。使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测杂质，使用分光光度计检测纯度，使用荧光计检测浓度，使用 RNA 检测试剂盒检测完整性。按照生产商说明书操作。对文库进行标准化和混合后进行测序（采用 2 × 300 bp 双端读长模式），使用 600 周期 V3 标准流动池，产生约 100,000 条双端 2 × 300 碱基读长。
注：全长引物序列：16S 扩增子聚合酶链式反应（PCR）正向引物：5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG]；16S 扩增子 PCR 反向引物：5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC]。
4. 分析16S rRNA基因测序数据
- 使用软件包 QIIME 2-201802 根据测序质量对每个样本的原始读长进行过滤20。
- 将三个文件复制到目录中：emp-paired-end-sequences_01
一个包含正向序列读长的 forward.fastq.gz 文件，
一个包含反向序列读长的 reverse.fastq.gz 文件，
一个包含相应条形码读长的 barcodes.fastq.gz 文件 - 执行
qiime tools import \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- 将三个文件复制到目录中：emp-paired-end-sequences_01
- 去除引物和接头序列。
qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-error-rate 0 \
--quality-cutoff 25 \
--o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--verbose - 截短双端测序质量均低于 25 的序列读长。参见上述 --quality-cutoff 25
- 分析测序数据。
- 将序列聚类形成操作分类单元（OTUs），相似性阈值设为 97%。
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sequences 97_otus.qza \
--p-perc-identity 0.97 \
--o-clustered-table table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza - 针对 OTUs，计算每个样本中的相对丰度。丰度信息包含在文件 table-cr-97.qza 中
- 将序列聚类形成操作分类单元（OTUs），相似性阈值设为 97%。
- 采用一种针对 RDP 训练集（版本 9； http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）的原生贝叶斯分类器对所有序列进行分类。映射的分类学信息包含在文件 table-cr-97.qza 中
- 在给定的 OTU 内，分配反映序列主要一致性的分类，并对 OTUs 进行比对。参见文件 table-cr-97.qza 和 rep-seqs-cr-97.qza
- 根据样本分组信息，进行 α 多样性分析（包括 Chao1、ACE、Shannon、Simpson 和均匀度指数）以及基于 UniFrac 的主坐标分析（PCoA）。
qiime tools export \
--input-path table-cr-97.qza \
--output-path exported-feature-table
exported-feature-table
qiime diversity alpha \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metric observed_otus \
--o-alpha-diversity observed_otus_vector.qza
qiime diversity beta \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metric braycurtis \
--o-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. 预测细菌功能
- 使用 BugBase 预测细菌特征的相关表型表达21. 使用以下命令准备用于 BugBase 的输入 OTU 表。
biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU 表" --to-json
注意：该预测基于六种表型类别（Ward 等 未发表）（https://bugbase.cs.umn.edu/）：革兰氏染色、氧耐受性、生物膜形成能力、移动元件含量、致病性以及氧化应激耐受性。 - 利用标记基因数据和包含参考基因组的数据库，通过PICRUSt预测宏基因组的功能组成22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG通路" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions.L1.txt - 借助 STAMP 分析各组间功能的差异23,24请参考相关文献以操作该软件。
6. 数据
- 使用统计学软件计算研究结果的显著性，统计学显著性以P < 0.05 为标准。
- 采用 Student t 检验评估年龄和产次的差异，采用卡方检验评估绝经状态、高血压及糖尿病病史的差异，采用 Mann-Whitney U 检验评估卵巢细菌分类群数量的差异。
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结果
患者
本研究共纳入16例符合条件的患者。对照组包括10例被诊断为良性子宫肿瘤的女性（其中3例诊断为子宫肌瘤，7例诊断为子宫腺肌症）。同时，癌症组包括6例被诊断为浆液性卵巢癌的女性（其中2例为II期，2例为III期）。对照组与癌症组患者在以下特征上无显著差异：年龄、绝经状态、胎次、高血压病史及糖尿病病史（表1）。
表1：患者统计信息 请点击此处下载该表格。
两组卵巢细菌物种的丰富度与多样性
通过免疫组织化学染色显示了细菌的存在，如图1所示。采用微生物α多样性分析作为检测卵巢细菌物种丰富度与多样性的方法。卵巢癌组织中观察到的物种数量少于对照组，但差异无统计学意义。细菌物种的丰富度...
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讨论
卵巢癌对女性生育能力具有显著影响25。大多数卵巢癌患者在晚期才被确诊，其5年生存率低于30%18。已有研究报道在包括肝脏、胰腺和脾脏在内的腹部实体脏器中检测到细菌的存在。由于宫颈并非完全封闭，细菌可存在于女性上生殖道中2,3,4,5。然而，作为腹部实体脏器的卵巢是否无菌，目前尚未明确。此外，卵巢中是否存在细菌及其与卵巢癌之间的关系也是一个重要的科学问题。
我们发现的不同组别之间的细菌存在显著差异。上述所有操作均严格保持无菌，包括仪器、试剂、设备以及整个实验方案的操作过程。更重要的是，我们采用患有良性子宫疾病的患者的卵巢作为对照组，以排除可能的污染。然而，在本实验方案中，污染无法完全避免。因此，由于癌症组与对照组是在相同的实验环境中进行...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国西安交通大学第一附属医院临床研究基金（XJTU1AF-2018-017，XJTU1AF-CRF-2019-002）、陕西省科学技术厅自然科学重大基础研究项目（2018JM7073，2017ZDJC-11）、陕西省科学技术厅重点研发计划项目（2017ZDXM-SF-068，2019QYPY-138）、陕西省协同技术创新项目（2017XT-026，2018XT-002）以及西安市社会发展指导计划医学研究项目（2017117SF/YX011-3）的资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
感谢西安交通大学第一附属医院妇产科的同事们在样本采集工作中所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2200 TapeStation 软件 | Agilent 美国 | ||
| AmpliSeq for Illumina 文库制备、索引和辅助试剂 | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| LPS 核心单克隆抗体，克隆号 WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus 磁珠 | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96试剂盒 | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva 数据库 | 马克斯·普朗克海洋微生物研究所与雅各布斯大学 | ||
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) 抗兔 (DAB) 试剂盒 | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
参考文献
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重印与许可
