为了原位发现并区分卵巢癌组织与非癌组织中的细菌，进行了免疫组织化学染色以及16S核糖体RNA基因（16S rRNA基因）测序。采用BugBase和基于未观测状态重建的群落系统发育分析（PICRUSt）预测了细菌的组成和功能差异。
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本文内容
摘要
摘要
关于女性上生殖道“无菌”理论正随着细菌检测技术的进步而面临越来越多的反对。然而，卵巢是否含有细菌至今尚未得到证实。本文介绍了一项检测卵巢组织中细菌的实验。我们选择卵巢癌患者作为癌症组，非癌性疾病患者作为对照组。采用16S rRNA基因测序技术，以区分癌症组与对照组卵巢组织中的细菌。此外，我们利用BugBase和PICRUSt对所鉴定细菌的功能组成进行了预测。近年来，许多器官已被证实含有细菌，因此该方法也可应用于其他内脏和组织。内脏及组织中细菌的存在可能有助于科学家评估癌变组织与正常组织，并可能为癌症治疗提供帮助。
引言
近年来，越来越多的文章证实了细菌存在于腹部实体脏器中，例如肾脏、脾脏、肝脏和卵巢1,2。Geller et al. 在胰腺肿瘤中发现了细菌，这些细菌对化疗药物吉西他滨（gemcitabine）具有耐药性2。S. Manfredo Vieira et al. 得出结论，Enterococcus gallinarum 可迁移至淋巴结、肝脏和脾脏，并可能诱发自身免疫反应3。
由于宫颈在防御中起着作用，女性上生殖道（包括子宫、输卵管和卵巢）中的细菌研究甚少。然而，近年来已提出一些新的理论。在月经周期中，由于黏蛋白的变化，细菌可能进入子宫腔4,5。此外，Zervomanolakis et al. 确认，子宫与输卵管共同构成一个由卵巢内分泌系统调控的节律性蠕动泵，这种结构使得细菌能够进入子宫内膜、输卵管和卵巢6。
由于细菌检测技术的发展，上生殖道已不再是一个谜。Verstraelen
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方案
本研究经西安交通大学第一附属医院医学机构伦理委员会批准（编号：XJTUIAF2018LSK-139）。所有纳入患者均签署了知情同意书。
1. 癌症组与对照组的入组标准
- 对于癌症组，纳入经初步诊断为卵巢癌、并在剖腹手术后经病理检查证实为浆液性卵巢癌的患者。
- 对于对照组，纳入经初步诊断为子宫肌瘤或子宫腺肌症、无任何卵巢病变、并已接受子宫切除术及输卵管卵巢切除术的患者。
注：该标准并非绝对。任何未影响卵巢疾病且接受子宫切除术及输卵管卵巢切除术的患者亦可纳入。 - 符合以下任一条件的患者应予以排除：
妊娠或哺乳期女性。
术前2个月内使用过抗生素。
存在发热或炎症标志物升高。
患有任何类型的炎症。
曾接受新辅助化疗。
2. 收集样本
- 手术过程中，将切除的卵巢放入无菌管中，并将试管置于液氮中运输。整个操作过程避免接触其他任何物品。
- 在超净工作台内，使用一把新的无菌镊子将卵巢组织分离成厚度约为 1 cm 的组织样本。分离后，将样本保存于 -80 °C。
注意：所有样本采集步骤均为无菌操作，包括卵巢组织的分离。
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结果
患者
本研究共纳入16例符合条件的患者。对照组包括10例被诊断为良性子宫肿瘤的女性（其中3例诊断为子宫肌瘤，7例诊断为子宫腺肌症）。同时，癌症组包括6例被诊断为浆液性卵巢癌的女性（其中2例为II期，2例为III期）。对照组与癌症组患者在以下特征上无显著差异：年龄、绝经状态、胎次、高血压病史及糖尿病病史（表1）。
表1：患者统计信息 请点击此处下载该表格。
两组卵巢细菌物种的丰富度与多样性
通过免疫组织化学染色显示了细菌的存在，如图1所示。采用微生物α多样性分析作为检测卵巢细菌物种丰富度与多样性的方法。卵巢癌组织中观察到的物种数量少于对照组，但差异无统计学意义。细菌物种的丰富度.......
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讨论
卵巢癌对女性生育能力具有显著影响25。大多数卵巢癌患者在晚期才被确诊，其5年生存率低于30%18。已有研究报道在包括肝脏、胰腺和脾脏在内的腹部实体脏器中检测到细菌的存在。由于宫颈并非完全封闭，细菌可存在于女性上生殖道中2,3,4,5。然而，作为腹部实体脏器的卵巢是否无菌，目前尚未明确。此外，卵巢中是否存在细菌及其与卵巢癌之间的关系也是一个重要的科学问题。
我们发现的不同组别之间的细菌存在显著差异。上述所有操作均严格保持无菌，包括仪器、试剂、设备以及整个实验方案的操作过程。更重要的是，我们采用患有良性子宫疾病的患者的卵巢作为对照组，以排除可能的污染。然而，在本实验方案中，污染无法完全避免。因此，由于癌症组与对照组是在相同的实验环境中进行.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国西安交通大学第一附属医院临床研究基金（XJTU1AF-2018-017，XJTU1AF-CRF-2019-002）、陕西省科学技术厅自然科学重大基础研究项目（2018JM7073，2017ZDJC-11）、陕西省科学技术厅重点研发计划项目（2017ZDXM-SF-068，2019QYPY-138）、陕西省协同技术创新项目（2017XT-026，2018XT-002）以及西安市社会发展指导计划医学研究项目（2017117SF/YX011-3）的资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
感谢西安交通大学第一附属医院妇产科的同事们在样本采集工作中所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2200 TapeStation 软件 | Agilent 美国 | ||
| AmpliSeq for Illumina 文库制备、索引和辅助试剂 | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems，Leica Microsystems 的部门 | ||
| LPS 核心单克隆抗体，克隆号 WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus 磁珠 | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96试剂盒 | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva 数据库 | 马克斯·普朗克海洋微生物研究所与雅各布斯大学 | ||
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) 抗兔 (DAB) 试剂盒 | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
参考文献
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistanc....
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重印与许可
