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方法文章

气相色谱-质谱联用结合完全汽化固相微萃取作为法医学工具

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DOI：

10.3791/61880

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2021年5月25日

 , 
1Department of Chemistry & Chemical Biology, Indiana University - Purdue University Indianapolis, 2Forensic & Investigative Sciences Program, Indiana University - Purdue University Indianapolis

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

总汽化固相微萃取（TV-SPME）在将液体样品完全汽化的同时，使分析物吸附到SPME纤维上。这使得分析物仅在溶剂蒸气与SPME纤维涂层之间进行分配。

摘要

气相色谱-质谱联用（GC-MS）是一种常用于分析多种法医学相关分析物的技术，包括管制药物、易燃液体和爆炸物。GC-MS 可与固相微萃取（SPME）联用，该方法将带有吸附涂层的纤维置于样品上方的顶空环境中，或浸入液体样品中。分析物被吸附到纤维上后，将纤维放入加热的 GC 进样口进行解吸。完全汽化固相微萃取（TV-SPME）采用与浸入式 SPME 相同的技术，但将纤维浸入完全汽化的样品提取物中。这种完全汽化过程仅在气相与 SPME 纤维之间形成分配，不受液相或任何不溶性物质的干扰。根据所用溶剂的沸点，TV-SPME 可支持较大的样品体积（例如，高达数百微升）。此外，TV-SPME 还可在纤维上进行衍生化反应。TV-SPME 已被用于分析毛发、尿液和唾液中的药物及其代谢物。这一简单技术还被应用于街头毒品、脂类、燃料样品、爆炸后残留物以及水体中的污染物分析。本文重点介绍 TV-SPME 在极小体积（微升级）酒精饮料样品中检测非法掺杂物的应用。在掺假饮料可能存在的浓度水平下，成功鉴定出γ-羟基丁酸（GHB）和γ-丁内酯（GBL）。通过三甲基硅烷化试剂进行衍生化，可将水相基质和 GHB 转化为其 TMS 衍生物。总体而言，TV-SPME 操作快速、简便，除将样品置入顶空瓶外，无需任何样品前处理步骤。

引言

固相微萃取（SPME）是一种采样技术，该技术将液体或固体样品置于顶空瓶中，然后将涂有聚合物材料的SPME纤维引入样品的顶空部分（或浸入液体样品中）。待测物被吸附到纤维上后，将纤维放入气相色谱进样口进行解吸1,2。完全汽化固相微萃取（TV-SPME）与浸入式SPME类似，但在待测物被吸附到纤维之前，先将液体样品完全汽化。这种方法使得待测物仅在溶剂蒸气与纤维涂层之间进行分配，从而可使更多的待测物吸附到纤维上，获得较高的灵敏度3。目前有多种SPME纤维可供选择，应根据目标待测物、溶剂/基质以及衍生化试剂来选择合适的纤维。有关已建立的TV-SPME待测物，请参见表1。

样品分析物推荐的固相微萃取纤维参考文献
人发尼古丁、可替宁聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）、聚丙烯酸酯（PA）3
无烟火药硝化甘油、二苯胺聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚乙二醇（PEG）7, 8
赛车燃料甲醇、硝基甲烷PEG9
水多环芳烃PDMS10
饮料ɣ-羟基丁酸、ɣ-丁内酯PDMS本研究
固体粉末甲基苯丙胺、苯丙胺PDMS/DVB未发表

表1. 推荐的SPME萃取头及其已确立的TV-SPME分析物。

进行TV-SPME时，将分析物溶解在溶剂中，并取该混合物的一部分 aliquot 置于顶空瓶中。样品无需过滤，因为只有溶剂和挥发性分析物会汽化。必须使用特定体积的液体样品，以确保样品完全汽化。这些体积通过理想气体定律计算，即溶剂的摩尔数乘以该液体的摩尔体积（公式1）。
用于计算摩尔体积的理想气体定律公式示意图，PV/RT，M/ρ，用于教学 公式1

其中，Vo 为样品体积（mL），P 为溶剂的蒸气压（bar），Vv 为顶空瓶体积（L），R 为理想气体常数（0.083145 理想气体常数表达式 L*bar/k*mol，化学计算公式。），M 为溶剂的摩尔质量（g/mol），T 为温度（K），静态平衡，ΣFx=0，示意图，受力平衡分析，科学教育内容 为溶剂的密度（g/mL）。3

为了使用正确的蒸气压，需采用安托万方程（方程 2）来考虑温度的影响：4
对数公式，方程；log10P=A-(B/(T+C))；教育，数学概念，研究分析 方程 2

其中 T 为温度，A、B 和 C 为溶剂的安托因常数。将方程 2 代入方程 1 可得：
用于计算色谱系统中空体积的方程，显示与温度相关的因素。 方程 3

公式 3 给出了样品（Vo）能够完全汽化的体积，该体积是温度和所用溶剂的函数。

进行TV-SPME衍生化时，首先将SPME纤维暴露于含有衍生化试剂的小瓶中，暴露时间根据分析物的不同而预先确定。随后将SPME纤维置于另一个含有目标分析物的新小瓶中。该小瓶置于加热搅拌器内进行加热。分析物随后与衍生化试剂一同吸附到纤维上。在将纤维插入气相色谱进样口进行解吸之前，分析物和/或基质在纤维上完成衍生化反应。图1展示了带衍生化的TV-SPME过程示意图。

样品制备与萃取方法的示意图，展示静态平衡过程。
图1：带衍生化步骤的TV-SPME过程示意图。SPME纤维首先插入衍生化小瓶，其中的衍生化试剂（黄色圆点）被吸附到纤维上。随后将纤维引入样品（蓝色圆点）并加热。在萃取过程中，目标物的衍生物（绿色圆点）在纤维上形成。请点击此处查看该图的放大版本。

TV-SPME 的优势在于可在萃取过程中同时完成分析物的衍生化，从而缩短分析时间。而其他方法（如液体进样）则需要分析物先在溶液中与衍生化试剂反应，然后才能注入气相色谱仪。TV-SPME 还几乎无需样品前处理。含有分析物的基质可直接放入顶空瓶中进行分析。许多目标化合物均适用于 TV-SPME。这些化合物必须可溶于溶剂，并具有足够的挥发性以实现汽化。此外，化合物还必须具备良好的热稳定性，方可用于 GC-MS 分析。TV-SPME 已被用于分析药物及其代谢物、赛车燃料、多环芳烃以及爆炸物材料3,5,6,7,8,9,10。

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方案

1. 通用 TV-SPME 样品制备与 GC-MS 分析

注意：如果样品已溶解在基质中，则跳至步骤 1.2。

  1. 用足够的溶剂（水、甲醇、丙酮等）提取或溶解固体样品，以达到所需浓度。液体样品可直接使用。
    注意：所用固体样品的量取决于样品的目标浓度。建议浓度低于 1 ppm（w/v），以避免过载气相色谱柱。分析物应可溶于所选的有机溶剂。
    1. 确保样品已完全溶解。
  2. 根据选定温度，使用公式 3 计算使样品完全汽化所需的体积。例如，若实验在 60 °C 下进行，则计算在 60 °C 下完全汽化溶剂所需的体积。
    1. 将该体积的样品转移至顶空瓶中，并拧紧瓶盖。在微升级别下转移液体样品的可接受方法包括：使用玻璃注射器手动转移、电子玻璃注射器，或具备液体转移功能的自动进样机器人用于样品制备。
  3. 若需对样品进行衍生化，可通过将约 1 mL 衍生化试剂加入顶空瓶中来配制适当的衍生化试剂。
    1. 根据所需的衍生化类型（烷基化、酰基化或硅烷化）选择合适的衍生化试剂。本例中，针对 GHB 分子上的羧酸和醇官能团，推荐使用的衍生化试剂为 O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）。该衍生化试剂可直接使用，无需稀释。1 mL 衍生化试剂足以确保 SPME 纤维的完全饱和。
      警告：衍生化试剂具有毒性，应在通风橱中操作。
  4. 根据步骤 1.2 的计算结果，设定合适的孵育/萃取温度。该温度可确保溶剂完全汽化、充分的样品萃取以及完全的衍生化（如需要）。
    1. 根据目标化合物的类别设定 GC-MS 参数（柱温箱程序升温、载气流速、进样口温度等）。参见步骤 3 中的示例参数设置。
    2. 确保气相色谱进样口内安装了合适的进样衬管（例如，内径为 2 mm 或更小）。
  5. 在开始分析前，确保 SPME 纤维已正确活化并处于良好工作状态。
    1. 根据所使用的 SPME 纤维类型调整活化参数。请参考 SPME 纤维的使用说明，获取正确的活化温度和时间。通常情况下，连续分析多个 SPME 空白样品直至结果可重现，即可认为 SPME 纤维已充分活化。

2. γ-羟基丁酸（GHB）和γ-丁内酯（GBL）样品制备

  1. 配制浓度低于 1 ppm 的 GHB 和/或 GBL 水溶液样品。
  2. 使用 1.2.1 中描述的方法之一，取 1 µL 该样品加入一个 20 mL 顶空瓶中。
    1. 注意：分析水相样品时需使用最小的进样体积。例如，在 60 °C 条件下，1 µL 水样会在 20 mL 顶空瓶中完全汽化。
    2. 立即盖紧瓶盖。
  3. 在另一个 20 mL 顶空瓶中加入约 1 mL 的 BSTFA + 1% 三甲基氯硅烷（TMCS），并盖紧瓶盖。
    注意：GBL 无需衍生化。但衍生化步骤仍有必要，以确保水溶剂被衍生化，从而避免对样品产生干扰。
    警告：BSTFA 具有毒性，应在通风橱中操作。

3. 水中GHB和GBL的GC-MS参数与设置

  1. 使用以下气相色谱-质谱（GC-MS）参数建立方法：
    初始柱温：60 °C，保持1分钟。
    升温程序：15 °C/分钟。
    最终柱温：280 °C，保持1分钟。
    载气流速：2.5 mL/分钟（适用于内径0.25 mm色谱柱的速度优化流速）。
    进样口温度：250 °C。
    传输线温度：280 °C。
  2. 确保气相色谱（GC）进样口内已安装窄径（内径2 mm或更小）的固相微萃取（SPME）进样衬管。
  3. 确保在分析前，PDMS/DVB SPME萃取头已正确活化且处于良好工作状态。
    注意：PDMS/DVB SPME萃取头应在气相色谱进样口于250 °C下活化30分钟。活化后的PDMS/DVB SPME萃取头应呈乳白色。
  4. 对样品进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。

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结果

进行了一项GBL体积研究，以比较TV-SPME与顶空和浸入式SPME的灵敏度。配制了水中100 ppmv的GBL样品，并分装至20 mL顶空小瓶中，体积分别为1、3、10、30、100、300、1000、3000和10,000 µL。样品的相体积比适用于TV-SPME（1–3 µL）、顶空SPME（10–3,000 µL）和浸入式SPME（10,000 µL）。所有样品均进行三份重复分析，将平均峰面积对样品体积作图。总体而言，适用于TV-SPME的样品体积在检测水中GBL时表现出比顶空或浸入式SPME更高的灵敏度，如图2所示。各方法色谱图的比较见图3。

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讨论

与液体进样气相色谱相比，TV-SPME 具有一些优势，例如可在无需改装仪器的情况下使用较大样品量（如 100 µL）。TV-SPME 还具备与顶空 SPME 相似的部分优点。顶空 SPME 无需进行任何萃取或过滤步骤，因为所有非挥发性化合物将保留在顶空瓶中，不会被吸附到萃取纤维上，从而获得洁净的样品。由于该方法为两相系统（顶空与纤维），而非标准顶空 SPME 的三相系统（样品、顶空和纤维），因此有助于消除基质效应。TV-SPME 与浸入式 SPME 相似之处在于，浸入式 SPME 同样属于两相系统。在浸入式 SPME 中，将纤维浸入含有待测物的液体（通常为水相）样品中，而非从其蒸气中萃取待测物。TV-SPME 与浸入式 SPME 的不同之处在于，浸入式 SPME 需要极性/水相基质，以提供足够的驱动力使待测物从溶液相中脱离并吸附至纤维涂层上。此外，浸入式 SPME 需要更大的样品体积（例如 mL 级别）。

TV-SPME 可使用多种溶剂，包括甲醇、丙酮、水和乙腈。SPME 萃取纤维不应接触或浸入氯仿中，因为这些溶剂可能损坏纤维涂层。已发现 20 mL 螺口玻璃顶空小瓶在 TV-SP...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国司法科学研究所资助（项目编号：2015-DN-BX-K058 ＆ 2018-75-CX-0035）。文中表达的观点、研究成果和结论均为作者个人观点，并不一定反映资助机构的立场。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 µL 注射器Gerstel100111-014-00
BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM)Regis Technologies Inc.50442882
eVol XR 样品分配系统套件ThermoFisher Scientific66002-024
figure-materials-1-丁内酯 (GBL)Sigma-AldrichB103608-26G
figure-materials-2-羟基丁酸 (GHB)Cayman Chemicals9002506
顶空用螺纹瓶，18 mmRestek23083
磁性螺纹盖，18 mmRestek23091
用于高效液相色谱的 Optima 水Fisher ChemicalW71
固相微萃取纤维组件 聚二甲基硅氧烷 (PDMS)Supelco57341-U
固相微萃取纤维组件 聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯 (PDMS/DVB)Supelco57293-U
Topaz 2.0 mm 内径直型进样衬管Restek23313

参考文献

  1. Pawliszyn, J. B. Method and Device for Solid Phase Microextraction and Desorption. United States patent. , (2005).
  2. Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
  3. Rainey, C. L., Bors, D. E., Goodpaster, J. V. Design and optimization of a total vaporization technique coupled to solid-phase microextraction. Analytical Chemistry. 86 (22), 11319-11325 (2014).
  4. Sinnott, R. Chemical Engineering Design: Chemical Engineering. 6, Elsevier. (2005).
  5. Davis, K. Detection of Illicit Drugs in Various Matrices Via Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME). , Indiana University - Purdue University Indianapolis. Master of Science thesis (2019).
  6. Ash, J., Hickey, L., Goodpaster, J. Formation and identification of novel derivatives of primary amine and zwitterionic drugs. Forensic Chemistry. 10, 37-47 (2018).
  7. Sauzier, G., Bors, D., Ash, J., Goodpaster, J. V., Lewis, S. W. Optimisation of recovery protocols for double-base smokeless powder residues analysed by total vaporisation (TV) SPME/GC-MS. Talanta. 158, 368-374 (2016).
  8. Bors, D., Goodpaster, J. Mapping smokeless powder residue on PVC pipe bomb fragments using total vaporization solid phase microextraction. Forensic science international. 276, 71-76 (2017).
  9. Bors, D., Goodpaster, J. Chemical analysis of racing fuels using total vaporization and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). Analytical Methods. 8 (19), 3899-3902 (2016).
  10. Beiranvand, M., Ghiasvand, A. Design and optimization of the VA-TV-SPME method for ultrasensitive determination of the PAHs in polluted water. Talanta. 212, 120809(2020).

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