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方法文章

从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分

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DOI：

10.3791/61884

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2020年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

本文内容

摘要

本方案提供了一种高效的胶原酶消化方法，可在单次操作中从人内脏脂肪中分离出有活力的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞，包括从脂肪细胞中提取高质量RNA的方法，以及通过多种膜结合标志物染色，利用流式细胞术对SVF来源的巨噬细胞进行表型鉴定。

摘要

内脏脂肪组织（VAT）是一种活跃的代谢器官，主要由成熟的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞构成，可释放多种生物活性分子，调控代谢、激素和免疫过程；目前尚不清楚这些过程在脂肪组织内部是如何被调控的。因此，开发用于评估各细胞群体对脂肪组织病理生理学贡献的方法至关重要。本方案描述了分离步骤，并提供了必要的故障排除指南，可通过单一操作流程利用胶原酶消化技术高效地从人内脏脂肪组织活检样本中分离出具有活性的成熟脂肪细胞和SVF细胞。此外，该方案还经过优化，可用于鉴定巨噬细胞亚群，并对成熟脂肪细胞进行RNA提取以开展基因表达研究，从而支持对这些细胞群体间相互作用的深入分析。简言之，VAT活检组织经洗涤、机械剪碎和酶消化处理后，获得单细胞悬液；离心后，通过漂浮法从SVF沉淀中分离成熟脂肪细胞。RNA提取方案可确保从脂肪细胞中获得高产量的总RNA（包括miRNA），用于后续表达检测。同时，SVF细胞可用于通过流式细胞术分析鉴定巨噬细胞亚群（促炎与抗炎表型）。

引言

白色脂肪组织不仅由脂肪细胞或脂肪细胞构成，还包含一个称为基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）的非脂肪细胞组分，其中含有多种异质性细胞群体，包括巨噬细胞、调节性T细胞（Tregs）等免疫细胞、嗜酸性粒细胞、前脂肪细胞和成纤维细胞，这些细胞被血管和结缔组织所包围1,2。目前认为，脂肪组织（AT）是一种器官，可通过不同细胞产生和释放的脂肪因子、细胞因子和微小RNA，以自分泌、旁分泌和内分泌方式调节与代谢和炎症相关的生理过程3,4。在人体中，白色脂肪组织包括皮下脂肪组织（SAT）和内脏脂肪组织（VAT），二者在解剖结构、分子特征、细胞组成和生理功能方面存在重要差异2,5。SAT可占人体AT总量的80%，而VAT位于腹腔内，主要分布于肠系膜和网膜中，代谢活性更高6。此外，VAT是一种内分泌器官，能够分泌多种介质，对体重、胰岛素敏感性、脂质代谢和炎症具有显著影响。因此，VAT的积聚会导致腹型肥胖以及与肥胖相关的疾病，如2型糖尿病、代谢综合征、高血压和心血管疾病风险增加，是预测肥胖相关死亡率的更佳指标6,7,8,9。

在稳态条件下，脂肪细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞通过分泌抗炎介质协同维持内脏脂肪组织（VAT）的代谢10。然而，过量的VAT扩张会促进活化T细胞、NK细胞和巨噬细胞的募集。事实上，在瘦个体的VAT中，巨噬细胞的比例为5%，而在肥胖状态下该比例可上升至50%，同时巨噬细胞由抗炎表型极化为促炎表型，从而形成慢性炎症环境10,11。

由于肥胖流行病的影响，大量研究报告相继涌现，涉及不同的内脏脂肪组织（VAT）研究领域，包括脂肪细胞生物学、表观遗传学、炎症、内分泌特性以及细胞外囊泡等新兴领域8,10,12,13然而，尽管内脏脂肪组织（VAT）微环境由脂肪细胞与常驻或浸润的巨噬细胞之间的相互作用所定义，大多数研究仅关注单一细胞群体，关于这些细胞在VAT中的相互作用及其病理生理学后果的信息仍然十分有限。11,14此外，一些有价值的研究利用细胞系探讨了脂肪组织中脂肪细胞与巨噬细胞的相互作用，但这些研究缺乏 体内 启动条件11,14,15. 要解析这些细胞在内脏脂肪组织（VAT）中的相互作用或特定贡献，需从同一样本脂肪活检中分离出这两种细胞类型，以进行后续实验 体外 尽可能模拟真实情况的检测方法 体内 调节 VAT 代谢的特性

尽管基于机械力破坏AT的非酶解离方法能够实现最小程度的操作干预，但如果研究目标是获取SVF细胞，则这些方法并不适用，因为与酶解法相比，其细胞回收效率较低、细胞活力较差，且需要更大的组织体积16,17。使用胶原酶进行酶消化是一种温和的方法，可有效降解脂肪组织等纤维性组织中的胶原蛋白和细胞外基质蛋白18，在胰蛋白酶无效或对细胞造成损伤时尤为常用19。本方案提供了一套基本的故障排除指南，通过胶原酶消化技术，在单次操作中高效分离出具有活性的人体VAT活成熟脂肪细胞和SVF细胞，并提供了确保从成熟脂肪细胞中获得高产量（数量、纯度和完整性）总RNA（包括microRNA）的技术信息，以满足后续基因表达分析的应用需求。同时，该方案经过优化，可通过多种膜结合标志物的染色，进一步利用流式细胞术对SVF细胞中的巨噬细胞亚群进行鉴定20。

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方案

本方案已获得中国台湾国家围产期研究所伦理审查委员会（IRB）批准（批准编号：212250-3210-21002-06-15）。参与为自愿性质，所有入选女性均签署了知情同意书。

1. 内脏脂肪组织采集

  1. 在足月单胎妊娠、无产程的健康成年女性剖宫产术中，通过部分大网膜切除术获取内脏脂肪组织（VAT）活检样本。
  2. 在子宫关闭并完成止血后，识别大网膜，并将其展平于湿润纱布上。暴露的脂肪组织即为内脏脂肪组织（VAT）。
  3. 定位最大的血管，并沿大网膜基部划定一个7 x 5 cm的虚拟区域。
  4. 选择无血管区域，使用Kelly钳在VAT外侧穿孔。
  5. 使用Ochsner钳夹住VAT穿孔区域的近端和远端，再用Metzenbaum剪刀剪下组织。
  6. 用1号黑色丝线结扎大网膜。
  7. 移除Ochsner钳，评估止血情况。
  8. 将VAT活检样本放入无菌容器中，并立即运送至实验室。

2. 内脏脂肪组织的酶消化及成熟脂肪细胞与基质血管组分细胞的分离

  1. 称取内脏脂肪组织活检样本，并用1× PBS（pH 7.4）冲洗。
  2. 取4 g内脏脂肪组织，使用剪刀在解剖托盘中将其剪碎成小块。
  3. 将剪碎的内脏脂肪组织转移至无菌的50 mL离心管中，加入20 mL PBS，轻轻振荡以去除多余的红细胞。
  4. 弃去PBS，重复该步骤两次。
  5. 将内脏脂肪组织转移至新的无菌50 mL离心管中，加入25 mL消化液（含0.25% II型胶原酶、5 mM葡萄糖、1.5%牛血清白蛋白的PBS溶液）。
  6. 在37 °C、125 rpm条件下于旋转摇床中孵育60分钟。
  7. 将消化后的组织通过三层纱布过滤至新的无菌50 mL离心管中。
  8. 在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。
  9. 离心后出现两相：上层为成熟脂肪细胞，而SVF细胞则保留在沉淀中。使用移液管小心地将上层成熟脂肪细胞转移至新的无菌50 mL离心管中。
  10. 加入20 mL冷PBS，轻轻振荡，然后在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。
  11. 弃去PBS，重复该步骤两次。
  12. 使用移液管小心地将成熟脂肪细胞转移至1.5 mL无DNase和RNase的微量离心管中。
  13. 在4 °C条件下以200 × g离心1分钟，用P200移液器吸除多余PBS。如有必要，重复此步骤。
  14. 小心地将300 μL成熟脂肪细胞悬液转移至1.5 mL无DNase和RNase的微量离心管中。将成熟脂肪细胞在-80 °C保存，直至进行RNA提取。
    注意：脂肪细胞不会形成沉淀。
  15. 在分离脂肪细胞后（步骤2.9），使用移液管吸除大部分消化液，保留底部的SVF细胞沉淀。
  16. 使用移液管将含有SVF细胞的沉淀转移至新的50 mL离心管中。
  17. 轻轻洗涤细胞沉淀，通过反复吹打将其重悬于20 mL冷1× PBS中。
  18. 在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，迅速倾倒弃去上清液。
  19. 重复步骤2.17和2.18进行第二次洗涤。
  20. 向SVF细胞沉淀中加入5 mL室温平衡的红细胞裂解缓冲液，通过反复吹打悬浮细胞。切勿涡旋。
  21. 室温孵育5分钟，然后以800 × g离心5分钟。使用移液管小心吸除上清液并妥善处理。
  22. 为中和裂解缓冲液，加入10 mL冷1× PBS，轻轻混匀直至细胞沉淀完全分散。
  23. 以800 × g离心5分钟获得SVF细胞沉淀，弃去PBS。此时应在管底可见白色沉淀。
  24. 在室温下通过反复吹打将细胞重悬于5 mL 1× PBS中，并通过三层纱布过滤至新的50 mL锥形管中。随后，这些细胞将用于通过流式细胞术对巨噬细胞亚群进行表征。

3. 从成熟脂肪细胞中提取RNA

  1. 准备一个洁净的操作区域，使用RNase去污染喷雾以避免RNA降解。使用专用于RNA操作的一套移液器。所使用的所有离心管和枪头均应为无RNase的。
  2. 若成熟脂肪细胞悬液（第2.14节）曾储存于-80 °C，请在4 °C下解冻。
    注意：避免多次冻融循环。
  3. 通过加入1,000 μL基于酸性胍-苯酚的裂解试剂，用P1000移液器充分混合以实现细胞裂解和均质化。
  4. 在室温下孵育5分钟，以促进核蛋白复合物的解离。
  5. 在室温下以12,000 × g离心5分钟。将形成三个相：上层（黄色）为脂肪细胞脂质，中层（粉红色）为核酸，下层为沉淀（细胞碎片）。
  6. 使用P200移液器小心移除脂质层。
  7. 将中层转移至新的2 mL离心管中，注意避免残留脂质或扰动沉淀（约700 μL）。

4. 总RNA（包括microRNA）的纯化

注意：采用基于柱层析的总RNA纯化方法以获得高质量的总RNA。

  1. 向第 3.7 节的样品中加入等体积的乙醇（95%–100%），约 700 μL，用手倒置离心管混匀 10 秒。
  2. 将 700 μL 混合液转移至插入收集管的柱子中，离心后弃去穿流液。
  3. 重新将混合液加载到同一柱子中，并重复步骤 4.2。
  4. 将柱子转移至新的收集管中。
  5. 向柱子中加入 400 µL 预洗缓冲液，离心后弃去穿流液，并重复此步骤一次。
  6. 向柱子中加入 700 µL 洗涤缓冲液，离心 2 分钟。
  7. 小心将柱子转移至无核酸酶的离心管中。
  8. 向柱子的膜基质上直接加入 50 µL 无核酸酶水，通过离心洗脱 RNA，并使用 200 µL 微量离心管分装成 10 µL 的等份样品。
  9. 立即将分装的样品置于冰上，并取其中一份用于测定 RNA 浓度和纯度。
  10. 准备一份 5 µL 的总 RNA 样品，调整浓度至 100 ng/µL，用于检测 RNA 完整性及微小 RNA（miRNA）浓度。
  11. 储存于 -80 °C，直至使用。

5. 成熟脂肪细胞RNA浓度、纯度和完整性的测定；microRNA定量分析

注意：使用紫外-可见分光光度计测定RNA浓度和纯度；使用RNA质量控制分析仪检测RNA完整性及miRNA定量。

  1. 用分子生物学级水清洗样品检测仪，并擦拭干净。
  2. 加入 2 µL 洗脱水（空白样），将设置更改为 RNA，然后点击 空白 按钮。
  3. 加入 2 µL 样品，然后点击 测量 按钮。
  4. 读数完成后，记录 A260/A280 和 A260/A230 比值以及 RNA 含量（ng/µL）（图 1A）。
    注意：OD260/OD280 和 OD260/OD230 比值约为 2.0 的 RNA 被认为是纯净的。
  5. 使用 RNA 完整性检测试剂盒，按照制造商说明书测定 RNA 完整性数（RIN）（图 1B）。
    注意：RIN = 10 表示 RNA 完整，而 RIN ≤ 3.0 表示 RNA 严重降解。进行表达谱芯片或 RT-qPCR 实验时，应使用 RIN ≥ 6.0 的 RNA。
  6. 使用小 RNA 检测试剂盒，按照制造商说明书测定 microRNA 的浓度和占比（图 1C）。
    注意：为避免对小 RNA 和 microRNA 的浓度高估，应使用 RIN ≥ 6.0 的 RNA 样品。

6. 基质血管组分细胞的计数与活力检测

  1. 取10 μL SVF细胞悬液（第2.24节），加入90 μL 0.4%台盼蓝溶液中（最终稀释倍数为1:10），混匀后取10 μL加入标准血细胞计数板中。
  2. 仔细计数计数室四个角落方格内的活细胞，排除死细胞。
  3. 计算原始悬液中的细胞浓度：细胞浓度 =（四个方格总细胞数 / 4）× 稀释倍数（10）× 10,000 = 细胞数/mL。
  4. 为计算获得的细胞得率（每克组织的细胞数），将细胞浓度乘以原始样品总体积（单位为mL），再除以消化组织的重量（单位为克）。
  5. 按以下公式计算细胞活力：细胞活力（%）=（活细胞数 / 总细胞数）× 100。

7. 从基质血管部分表征巨噬细胞亚群

  1. 总共转移 1 × 106 将每毫升SVF细胞加入5 mL圆底聚丙烯试管中用于流式细胞术，并在800 × g条件下离心以收集细胞沉淀 g 4°C下，5分钟 °C.
  2. 轻轻涡旋以松动沉淀，并将细胞重悬于 100 μ室温下1x PBS L
  3. 加入经预滴定的最佳浓度的每种针对细胞表面抗原的荧光染料偶联单克隆抗体；轻轻混匀，在室温避光孵育15分钟。
  4. 加入过量的冷的 1x PBS（≈ 1 mL）并以400 × g离心SVF g 4°C 下 5 分钟 °C.
  5. 通过倾倒迅速弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  6. 加入 500 μ1x 裂解液中孵育15分钟，室温避光。
  7. 离心后去除上清液，离心条件为 400 x g 4 ℃下 5 分钟 °℃，并保存于2–8℃ °避光保存至数据采集完成。
  8. 以低速充分涡旋振荡细胞，以减少聚集，然后再进行检测。
  9. 将SVF沉淀物在5 mL鞘液中重悬，室温下操作，随后经三层纱布过滤至新的5 mL圆底聚丙烯试管中，再进行流式细胞术分析，以减少堵塞细胞分选仪管路。
  10. 分析前，将每根试管短暂涡旋振荡。
  11. 采集目标样本的数据。进行流式分析时，至少记录 10,000 个事件。
    注意：如果使用细胞分选流式细胞仪，应将巨噬细胞分离用于后续研究。

8. 设门策略

  1. 绘制前向散射（FSC）的高或宽对面积的图，以确定单细胞群体（图 2A）。
  2. 选择侧向散射（SSC）面积对 FSC 作图的细胞，排除细胞碎片（图 2B）。
  3. 从所选细胞中，鉴定表达 CD45 的细胞群为造血细胞（图 2C），CD45/CD14 双阳性细胞为巨噬细胞（图 2D）。
  4. 从 CD45+/CD14+ 巨噬细胞中，检测 HLA-DR 阴性和阳性细胞（图 2E）。
    注：应包括抗体组合的补偿对照，并在适用于该组合的多色流式细胞仪上调整光谱重叠。我们使用配备三种激光器（405 nm 紫色激光、488 nm 蓝色激光和 640 nm 红色激光）以及对应荧光染料检测器的流式细胞仪进行分析。

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结果

本方案描述了一种酶解法，通过胶原酶消化结合差速离心，从健康孕妇部分大网膜切除术后获取的内脏脂肪组织活检样本中，单次操作分离出具有活性的成熟脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞。本研究中，我们利用脂肪细胞进行RNA提取，SVF细胞则用于巨噬细胞表型分析。

RNA提取方案能够从成熟脂肪细胞中获得纯度高、完整性好且含有微小RNA的RNA（图1）。通过RNA质量控制分析仪评估RNA完整性，结果显示采用该方案分离的脂肪细胞样本具有极佳的RNA质量（RIN = 9.7）。

VAT-SVF 中存在的有核细胞总数约为 2.8 x 106 个细胞/克 VAT（2.8 x 106 ± 1.7 x 106），通过台盼蓝排斥试验测得细胞活力为 64%（63.9 ± 2.0）。使用荧光染料标记的特异性一抗对 SVF 细胞进行标记，以通过荧光激活细胞分选分析鉴定和表征脂肪组织巨噬细胞。流式细胞术分析生成基于细胞标志物的不同细胞群分...

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讨论

内脏脂肪组织（VAT）在代谢调控和炎症过程中发挥着关键作用。随着人们对脂肪细胞和免疫细胞在肥胖相关慢性炎症中作用的兴趣日益增加，已开发出多种技术用于分离脂肪组织（AT）中存在的基质血管组分（SVF）和脂肪细胞。然而，大多数技术无法通过单次内脏脂肪活检操作，从同一样本中同时获得可用于后续实验的、具有活性的这两类细胞，而这对研究脂肪细胞与SVF细胞之间的相互作用可能至关重要。因此，我们建立了本实验方案，可详细描述如何从一份内脏脂肪活检样本中分离出具有活性的成熟脂肪细胞和SVF细胞。本方法在组织消化时间、胶原酶浓度，以及细胞分离过程中的离心时间和速度方面与以往报道有所不同，从而能够获得足够的脂肪细胞RNA产量，并实现对巨噬细胞亚群的精细表征。

已提出多种用于分离脂肪组织来源细胞的酶法和非酶法技术，这些方法对分离细胞的生物学特性和功能特性具有不同的影响17,21,22,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由墨西哥国家围产期研究所（资助编号：3300-11402-01-575-17 和 212250-3210-21002-06-15）以及墨西哥国家科学技术委员会、卫生与社会保障行业研究基金（FOSISS）（资助编号 2015-3-2-61661）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR管AxygenPCR-02-C无RNase、DNase且无热原
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C无RNase、DNase且无热原
10 mL 血清移液管CorningCLS4101-50EA individually plastic wrapped
10 µL 通用移液器吸头AxygenT-300-L-R无RNase、DNase且无热原
10 µL 通用移液器吸头AxygenT-300-R-S无RNase、DNase且无热原
1000 µL 通用移液器吸头AxygenT-1000-B-R无RNase、DNase且无热原
2.0 mL 微量离心管AxygenMCT-200-C无RNase、DNase且无热原
200 µL 通用移液器吸头AxygenT-200-Y-R无RNase、DNase且无热原
2100 生物分析仪仪器AgilentG2939BA-
2101 生物分析仪PCAgilentG2953CA预装2100 Expert软件的PC
5 mL 圆底聚苯乙烯试管Corning352003 带卡扣盖、无菌
50 mL 离心管CorningCLS430828-100EA聚丙烯材质，锥形底，无菌
基于酸-胍-苯酚的试剂Zymo ResearchR2050-1-200TRI Reagent或类似产品
Agilent RNA 6000 Nano试剂盒Agilent5067-1511-
Agilent 小RNA试剂盒Agilent5067-1548-
APC/Cy7抗人CD14抗体BioLegend3256200.4 mg/106 个细胞，表达于单核细胞/巨噬细胞，克隆号HCD14
烧杯--250 ml，非无菌
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA3912-100G热激处理组分，pH 5.2，≥96%
芯片上样站Agilent5065-9951-
II型胶原酶Gibco17101-015粉末
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG8270-100G粉末
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051随附50 mL TRI试剂
解剖镊--钢制，带锯齿状钳口和圆头
解剖托盘--不锈钢
乙醇Sigma-AldrichE7023-500ML200 proof，分子生物学级
FACS 流动鞘液BD Biosciences342003-
FACS 溶血溶液BD Biosciences349202-
FACSAria III 流式细胞仪/细胞分选仪BD Biosciences648282-
FASCDiva 软件BD Biosciences642868预装v6.0版本软件
血细胞计数板SigmaZ359629-1EA-
手动细胞计数器---
梅奥解剖剪--不锈钢
微量离心机--可调温度
Nanodrop分光光度计Thermo ScientificND2000LAPTOP-
旋转摇床--可调温度和转速
P10 可调体积 微量移液器 Thermo Scientific-Finnpipette46420401 至 10 μL
P1000 可调体积 微量移液器 Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 至 1000 μL
P2 可调体积 微量移液器 Thermo Scientific-Finnpipette46420100.2 至 2 μL
P200 可调体积 微量移液器 Thermo Scientific-Finnpipette464208020 至 200 μL
PCR管储存架AxygenR96PCRFSP-
PE/Cy5抗人HLA-DR抗体BioLegend3076080.0625 mg/106 个细胞，表达于巨噬细胞，克隆号L243
PE/Cy7抗人CD45抗体BioLegend3040160.1 mg/106 个细胞，表达于白细胞，克隆号H130
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP3813-10PAK粉末，pH 7.4，用于配制1 L溶液
移液控制器---
红细胞裂解缓冲液Roche11 814 389 001用于选择性裂解人全血中的红细胞
冷冻离心机--配有50 mL锥形管转子
无菌标本容器---
移液管Thermo Scientific-Samco204-1S无菌
台盼蓝Gibco15250-0610.4% 溶液
试管架--适用于不同规格试管
涡旋微型振荡器Cientifica SENNABV101-

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从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分
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