本方案提供了一种高效的胶原酶消化方法，可在单次操作中从人内脏脂肪中分离出有活力的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞，包括从脂肪细胞中提取高质量RNA的方法，以及通过多种膜结合标志物染色，利用流式细胞术对SVF来源的巨噬细胞进行表型鉴定。
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本文内容
摘要
摘要
内脏脂肪组织（VAT）是一种活跃的代谢器官，主要由成熟的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞构成，可释放多种生物活性分子，调控代谢、激素和免疫过程；目前尚不清楚这些过程在脂肪组织内部是如何被调控的。因此，开发用于评估各细胞群体对脂肪组织病理生理学贡献的方法至关重要。本方案描述了分离步骤，并提供了必要的故障排除指南，可通过单一操作流程利用胶原酶消化技术高效地从人内脏脂肪组织活检样本中分离出具有活性的成熟脂肪细胞和SVF细胞。此外，该方案还经过优化，可用于鉴定巨噬细胞亚群，并对成熟脂肪细胞进行RNA提取以开展基因表达研究，从而支持对这些细胞群体间相互作用的深入分析。简言之，VAT活检组织经洗涤、机械剪碎和酶消化处理后，获得单细胞悬液；离心后，通过漂浮法从SVF沉淀中分离成熟脂肪细胞。RNA提取方案可确保从脂肪细胞中获得高产量的总RNA（包括miRNA），用于后续表达检测。同时，SVF细胞可用于通过流式细胞术分析鉴定巨噬细胞亚群（促炎与抗炎表型）。
引言
白色脂肪组织不仅由脂肪细胞或脂肪细胞构成，还包含一个称为基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）的非脂肪细胞组分，其中含有多种异质性细胞群体，包括巨噬细胞、调节性T细胞（Tregs）等免疫细胞、嗜酸性粒细胞、前脂肪细胞和成纤维细胞，这些细胞被血管和结缔组织所包围1,2。目前认为，脂肪组织（AT）是一种器官，可通过不同细胞产生和释放的脂肪因子、细胞因子和微小RNA，以自分泌、旁分泌和内分泌方式调节与代谢和炎症相关的生理过程3,4。在人体中，白色脂肪组织包括皮下脂肪组织（SAT）和内脏脂肪组织（VAT），二者在解剖结构、分子特征、细胞组成和生理功能方面存在重要差异2,5。SAT可占人体AT总量的80%，而VAT位于腹腔内，主要分布于肠系膜和网膜中，代谢活性更高6。此外，VAT是一种内分泌器官，能够分泌多种介质，对体重、胰岛素敏感性、脂质代谢和炎症具有显著影响。因此，VAT的积聚会导致腹型肥胖以及与肥胖相关的疾病，如2型糖尿病、代谢综合征、高血压和心血管疾病风险增加，是预测肥胖相关死亡率的更佳指标
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方案
本方案已获得中国台湾国家围产期研究所伦理审查委员会（IRB）批准（批准编号：212250-3210-21002-06-15）。参与为自愿性质，所有入选女性均签署了知情同意书。
1. 内脏脂肪组织采集
- 在足月单胎妊娠、无产程的健康成年女性剖宫产术中，通过部分大网膜切除术获取内脏脂肪组织（VAT）活检样本。
- 在子宫关闭并完成止血后，识别大网膜，并将其展平于湿润纱布上。暴露的脂肪组织即为内脏脂肪组织（VAT）。
- 定位最大的血管，并沿大网膜基部划定一个7 x 5 cm的虚拟区域。
- 选择无血管区域，使用Kelly钳在VAT外侧穿孔。
- 使用Ochsner钳夹住VAT穿孔区域的近端和远端，再用Metzenbaum剪刀剪下组织。
- 用1号黑色丝线结扎大网膜。
- 移除Ochsner钳，评估止血情况。
- 将VAT活检样本放入无菌容器中，并立即运送至实验室。
2. 内脏脂肪组织的酶消化及成熟脂肪细胞与基质血管组分细胞的分离
- 称取内脏脂肪组织活检样本，并用1× PBS（pH 7.4）冲洗。
- 取4 g内脏脂肪组织，使用剪刀在解剖托盘中将其剪碎成小块。
- 将剪碎的内脏脂肪组织转移至无菌的50 mL离心管中，加入20 m....
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结果
本方案描述了一种酶解法，通过胶原酶消化结合差速离心，从健康孕妇部分大网膜切除术后获取的内脏脂肪组织活检样本中，单次操作分离出具有活性的成熟脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞。本研究中，我们利用脂肪细胞进行RNA提取，SVF细胞则用于巨噬细胞表型分析。
RNA提取方案能够从成熟脂肪细胞中获得纯度高、完整性好且含有微小RNA的RNA（图1）。通过RNA质量控制分析仪评估RNA完整性，结果显示采用该方案分离的脂肪细胞样本具有极佳的RNA质量（RIN = 9.7）。
VAT-SVF 中存在的有核细胞总数约为 2.8 x 106 个细胞/克 VAT（2.8 x 106 ± 1.7 x 106），通过台盼蓝排斥试验测得细胞活力为 64%（63.9 ± 2.0）。使用荧光染料标记的特异性一抗对 SVF 细胞进行标记，以通过荧光激活细胞分选分析鉴定和表征脂肪组织巨噬细胞。流式细胞术分析生成基于细胞标志物的不同细胞群分.......
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讨论
内脏脂肪组织（VAT）在代谢调控和炎症过程中发挥着关键作用。随着人们对脂肪细胞和免疫细胞在肥胖相关慢性炎症中作用的兴趣日益增加，已开发出多种技术用于分离脂肪组织（AT）中存在的基质血管组分（SVF）和脂肪细胞。然而，大多数技术无法通过单次内脏脂肪活检操作，从同一样本中同时获得可用于后续实验的、具有活性的这两类细胞，而这对研究脂肪细胞与SVF细胞之间的相互作用可能至关重要。因此，我们建立了本实验方案，可详细描述如何从一份内脏脂肪活检样本中分离出具有活性的成熟脂肪细胞和SVF细胞。本方法在组织消化时间、胶原酶浓度，以及细胞分离过程中的离心时间和速度方面与以往报道有所不同，从而能够获得足够的脂肪细胞RNA产量，并实现对巨噬细胞亚群的精细表征。
已提出多种用于分离脂肪组织来源细胞的酶法和非酶法技术，这些方法对分离细胞的生物学特性和功能特性具有不同的影响17,21,22,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由墨西哥国家围产期研究所（资助编号：3300-11402-01-575-17 和 212250-3210-21002-06-15）以及墨西哥国家科学技术委员会、卫生与社会保障行业研究基金（FOSISS）（资助编号 2015-3-2-61661）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR管 | Axygen | PCR-02-C | 无RNase、DNase且无热原 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | 无RNase、DNase且无热原 |
| 10 mL 血清移液管 | Corning | CLS4101-50EA | individually plastic wrapped |
| 10 µL 通用移液器吸头 | Axygen | T-300-L-R | 无RNase、DNase且无热原 |
| 10 µL 通用移液器吸头 | Axygen | T-300-R-S | 无RNase、DNase且无热原 |
| 1000 µL 通用移液器吸头 | Axygen | T-1000-B-R | 无RNase、DNase且无热原 |
| 2.0 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-200-C | 无RNase、DNase且无热原 |
| 200 µL 通用移液器吸头 | Axygen | T-200-Y-R | 无RNase、DNase且无热原 |
| 2100 生物分析仪仪器 | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 生物分析仪PC | Agilent | G2953CA | 预装2100 Expert软件的PC |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管 | Corning | 352003 | 带卡扣盖、无菌 |
| 50 mL 离心管 | Corning | CLS430828-100EA | 聚丙烯材质，锥形底，无菌 |
| 基于酸-胍-苯酚的试剂 | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent或类似产品 |
| Agilent RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent 小RNA试剂盒 | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7抗人CD14抗体 | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 个细胞，表达于单核细胞/巨噬细胞，克隆号HCD14 |
| 烧杯 | - | - | 250 ml，非无菌 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3912-100G | 热激处理组分，pH 5.2，≥96% |
| 芯片上样站 | Agilent | 5065-9951 | - |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101-015 | 粉末 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-100G | 粉末 |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | 随附50 mL TRI试剂 |
| 解剖镊 | - | - | 钢制，带锯齿状钳口和圆头 |
| 解剖托盘 | - | - | 不锈钢 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof，分子生物学级 |
| FACS 流动鞘液 | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS 溶血溶液 | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III 流式细胞仪/细胞分选仪 | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva 软件 | BD Biosciences | 642868 | 预装v6.0版本软件 |
| 血细胞计数板 | Sigma | Z359629-1EA | - |
| 手动细胞计数器 | - | - | - |
| 梅奥解剖剪 | - | - | 不锈钢 |
| 微量离心机 | - | - | 可调温度 |
| Nanodrop分光光度计 | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| 旋转摇床 | - | - | 可调温度和转速 |
| P10 可调体积 微量移液器 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 至 10 μL |
| P1000 可调体积 微量移液器 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 至 1000 μL |
| P2 可调体积 微量移液器 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 至 2 μL |
| P200 可调体积 微量移液器 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 至 200 μL |
| PCR管储存架 | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5抗人HLA-DR抗体 | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 个细胞，表达于巨噬细胞，克隆号L243 |
| PE/Cy7抗人CD45抗体 | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 个细胞，表达于白细胞，克隆号H130 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | 粉末，pH 7.4，用于配制1 L溶液 |
| 移液控制器 | - | - | - |
| 红细胞裂解缓冲液 | Roche | 11 814 389 001 | 用于选择性裂解人全血中的红细胞 |
| 冷冻离心机 | - | - | 配有50 mL锥形管转子 |
| 无菌标本容器 | - | - | - |
| 移液管 | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | 无菌 |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250-061 | 0.4% 溶液 |
| 试管架 | - | - | 适用于不同规格试管 |
| 涡旋微型振荡器 | Cientifica SENNA | BV101 | - |
参考文献
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Ibrahim, M. M.
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重印与许可
