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方法文章

火虫 Thermobia domestica 中的卵显微注射与高效交配用于基因组编辑

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DOI：

10.3791/61885

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2020年10月20日

 ,  ,  , 
1Department of Applied Biosciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University

本文内容

摘要

我们提供了一种详细的方案，用于饲养火衣鱼（Thermobia domestica），对其卵进行显微注射，并在基因组编辑后高效交配，以建立和维持突变品系。

摘要

火衣鱼 Thermobia domestica 是一种无变态发育、无翅的昆虫物种，适用于研究推动昆虫在地球上成功进化的发育机制。在进化发育生物学（Evo-Devo）研究中，应用基因组编辑等遗传工具是理解导致进化转变的遗传变化的关键。本文介绍了我们目前建立和维持T. domestica突变品系的实验方案。我们报道了一种干法显微注射技术，作为已有文献报道的湿法注射的替代方法，该方法可使注射后的胚胎获得稳定且较高的存活率。此外，我们还报道了一种优化的成虫交配环境设置，能够高效地获得后续世代。我们的方法强调了在将基因组编辑技术成功应用于非传统模式生物时，必须充分考虑每个物种独特的生物学特性。我们预测，这些基因组编辑方案将有助于将T. domestica发展为实验室模式生物，并进一步加速该物种中实用遗传工具的开发与应用。

引言

Thermobia domestica 属于最基础的昆虫目之一——缨尾目（Zygentoma），其保留了原始的无变态且无翅的生活周期。这种基础的系统发育地位和原始特征使该物种成为研究昆虫在地球上取得巨大成功之机制的理想模型，昆虫占据了已描述动物物种的70%以上1。T. domestica 长期被用于研究昆虫生理学的原始特征，因其具备适合作为实验室模型的特性，例如相对较短的生命周期（从胚胎发育至生殖成熟成虫需2.5–3.0个月；图1A）以及易于饲养。在过去三十年中，其应用已扩展至研究多种性状的原始特征，如体轴模式、神经分化和昼夜节律2,3,4。

先进遗传学工具的应用 T. domestica 可能进一步加速广泛研究领域的相关贡献。已有研究报道，在胚胎、若虫和成虫阶段成功实现了RNA干扰（RNAi）介导的基因敲低 T. domestica4,5,6系统性RNAi的效率仍高度依赖于物种——例如，在鞘翅目昆虫中通常效率较高，而在鳞翅目昆虫中则较低7RNAi敲低的效率和持续时间 T. domestica 尚未评估。除了RNAi之外，我们此前已报道过利用CRISPR/Cas9成功实现基因敲除 T. domestica8CRISPR/Cas 系统已广泛应用于昆虫基因组编辑，特别是靶向基因敲除。随着将 CRISPR/Cas 系统组分递送至细胞核的实验方案的建立，该系统的应用范围可进一步拓展至其他领域，例如基因报告子检测、细胞谱系追踪，以及通过敲入外源构建体来调控转录活性。9结合已发表的基因组组装10CRISPR/Cas 基因组编辑技术的广泛应用及其进一步发展 T. domestica 将有助于研究昆虫卓越适应性成功背后的进化机制。本文中，我们描述了一种成虫交配及胚胎显微注射的详细实验方案 T. domestica 利用CRISPR/Cas9技术构建突变菌株。鉴于这一新兴方法，我们探讨了在成功应用这些技术时，考虑非传统模式物种独特生物学特性的重要性。

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方案

1. 实验室种群的维持

  1. 对于野生型和突变型种群的维持，使用一个大型塑料容器（460 mm × 360 mm × 170 mm），内含常规的人工鱼饲料，顶部带有通气孔的塑料杯盛水，折叠的纸张用于昆虫藏匿，以及分层的棉絮用于产卵（图2A）。将所有 T. domestica 培养物置于37 °C培养箱中，并将每个容器内的相对湿度（RH）设定为60%–80%。
    注：由于 T. domestica 可从空气中吸收水蒸气11，因此无需直接提供水源。通过容器内顶部带通气孔的塑料杯或无盖杯中蒸发的水蒸气，即可维持适宜的相对湿度。无需对包含培养物的整个培养箱进行加湿。本方案所述条件下各发育阶段的大致持续时间见图1。可通过调节温度和/或相对湿度来调整发育速度12。
  2. 定期添加食物。在水分干涸前及时补充水。
  3. 至少每3个月将种群转移至一个新的洁净容器中，因为在脏污环境和/或高密度种群条件下，成虫会停止产卵（参见讨论部分）。

2. 卵的收集与显微注射

  1. 设计向导RNA（gRNA）
    1. 为每个目标位点设计gRNA序列，并将gRNA序列与基因组组装序列进行BLAST比对，以检测可能的脱靶识别位点。
    2. 根据制造商说明书合成并纯化gRNA8.
      注意：例如，在靶向ATP结合盒转运蛋白的情况下 白色 基因，设计了一段20 bp的靶序列，并订购了两条合成DNA寡核苷酸：5´-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3´ 和 5´-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3´。通过将这两条寡核苷酸退火形成DNA模板，随后进行PCR扩增，再利用T7 RNA聚合酶从该模板体外转录生成gRNA。
  2. 准备卵收集群体
    1. 将约20只雄性和20只雌性成虫转移至一个中等大小的容器（200 mm × 150 mm × 90 mm）中，容器内提供食物、水源、一张折叠的纸以及一小块层状棉絮用于产卵图2B).
    2. 建立多个群体，以在短时间内获得大量处于特定发育阶段的胚胎，用于基因组编辑。
      注意：在37 °C条件下培养8小时后，预计可从一个群体中收集到约20–40枚卵。转移的成虫通常需要数天才开始产卵，这可能是由于其需要适应新环境所致。
  3. 注射当天，将容器内的棉垫更换为新的。
  4. 将一条76 mm × 5 mm双面胶带贴在标准的76 mm × 26 mm玻璃载片上。
  5. 8小时后，用镊子分开棉层，收集其中的卵。
  6. 使用湿润的画笔将卵排列在双面胶带上，卵与卵之间保持2 mm间距。所有卵的摆放方向应使其长轴朝向注射侧。图3A）。用画笔轻轻按压卵子，使其在注射过程中保持稳固。
    注意：在本实验方案中，真菌在潮湿温暖条件下于受损的注射卵中生长迅速。保持卵之间的间距至关重要，以防止真菌的交叉污染和扩散。
  7. 将gRNA和Cas9蛋白混合，终浓度分别为100 ng/µL和500 ng/µL。使用蒸馏水进行稀释。室温孵育混合物10分钟，以促进核糖核蛋白复合物的形成，随后将混合物置于冰上保存。
    注意：可在注射溶液中加入终浓度为1%的中性红，以监测注射量。
  8. 使用微量加样器将2 µL gRNA/Cas9溶液加入玻璃注射毛细管中。注射前确保溶液中无气泡。如有必要，轻敲针头以去除气泡。
    注意：本实验中使用预制针头以获得精细的针尖图3B可使用形状相似的自制针头替代。
  9. 将预先装有gRNA/Cas9溶液的玻璃注射毛细管固定在配备有操纵器的持针器上，并将持针器连接至电子显微注射仪。
  10. 使用镊子轻微折断针尖以优化其形状，防止堵塞，并在一系列注射过程中获得更好的耐用性（合适的针头示例如图所示） 图3C).
    注意：建议在针头堵塞时更换新针头。若用镊子强行将堵塞的针头再次折断后继续使用，虽可继续注射，但针尖变宽会导致卵的损伤增加，从而降低其存活率。 T. domestica 卵子柔软且脆弱，保持精细的针尖是注射后获得高存活率的关键。
  11. 将针头插入卵子纵轴的中点，并注入少量溶液（参见 图3D–H 作为注射量的参考）。根据针尖形状，在注射过程中调整电子显微注射仪的配置。
    注意：建议在注射过程中保持恒定压力，否则粘性卵内容物容易倒流入玻璃针内，可能导致针头堵塞。解决方案可根据注入液体量选择短时脉冲压力注射或恒定压力注射。需注意，若针尖开口过宽，会导致注入卵内的溶液量过多，从而引起胚胎死亡图3F–H）。在这种情况下，通过恒定压力维持稳定的液体流速，然后将针头插入卵子并立即抽出。如果导致过多溢出或卵子破裂，则更换针头。
  12. 将注射后的卵置于适合注射卵数量的容器中（<20 枚卵：小培养皿； >20枚卵：中等大小容器，相对湿度60%–80%，温度37 °C。

3. 交配

  1. 定期检查注射后的卵，用镊子移除受损的卵，以避免真菌滋生（图3I,J）。若某卵表面真菌生长过多，可用70% EtOH清洁卵的表面。
  2. 在孵化前（产卵后约37 °C条件下10天），将带有注射卵的载玻片浸入滑石粉中，使双面胶表面均匀覆盖滑石粉。此举可防止孵化后的若虫堆叠。将沾有滑石粉的载玻片转移至中等大小的容器中，容器内需提供食物、水以及一张折叠的纸片供昆虫藏匿。
  3. 若虫孵化后，移除载玻片。定期提供食物，直至若虫发育为成虫。
    注意：个体从孵化到成虫约需2.0–2.5个月（图1A）。雌性成虫的判定依据为其具有发育良好的产卵器（图1B）。
  4. 为进行交配，将所需数量的野生型雌性成虫从实验室种群中转移至中等大小的容器中，并在37 °C下培养至少14天，以确保其为处女雌虫。
    注意：无需专门从实验室种群中收集处女雌虫，因为家栖灶马（T. domestica）成虫具有称为“生殖与蜕皮周期”的重复蜕皮和交配周期，在此周期中，雌虫每次蜕皮时会排出精子，并在下一个受精周期中重新交配13。
  5. 将由注射卵发育而来的G0代雄性或雌性成虫与野生型成虫一起转移至含有食物、一张折叠纸片以及一小块棉絮（用于G1代产卵）的小型塑料培养皿（Ø 100 mm x 40 mm）中（图2C’；交配皿）。将交配皿置于较大容器中，保持60%–80%相对湿度（图2C）。
    注意：可在培养皿中放入多只野生型成虫以提高交配成功率，尽管一对一配对也已实现较高的成功率。

4. 基因分型

  1. 为每条gRNA设计PCR引物对，以扩增包含gRNA靶向位点在内的100–200 bp产物。将每条引物序列与基因组组装序列进行BLAST比对，以验证其特异性（示例展示了针对目标位点的扩增） 白色 基因在 图4A).
  2. 检测G0代成虫的种系转化情况。
    1. 在卵产下后第五天，从每对G0代成虫中分别收集单个G1代卵至0.2 mL离心管中（每管一枚卵；收集的样品于-20 °C长期保存）。分离棉层以收集卵。
      注意：建议对每对交配个体产生的至少12只G1若虫进行基因型鉴定，以评估种系传递的成功情况（参见 代表性结果).
    2. 向每管中加入15 µL浓度为0.25 mg/mL的蛋白酶K溶液（溶于Tris-EDTA缓冲液），用牙签短暂混匀样品，于55 °C孵育3至16小时。
    3. 将样本置于 95 °C 下 10 分钟以灭活蛋白酶 K。
    4. 向每支试管中加入90 µL蒸馏水，充分混匀。取2 µL上清液用于含有第4.1步设计引物的10 µL PCR反应体系中。
      注意：建议使用针对粗提模板优化的DNA聚合酶，以获得足够的PCR扩增效果。
    5. 为了分析PCR产物，使用微芯片电泳系统进行异源双链迁移率分析（HMA）图3B；参见 Ohde 等，20188.
      注意：突变可通过两种替代方法进行评估：（1）使用标准凝胶聚合物（如8%聚丙烯酰胺）的HMA14；（2）用T7核酸酶消化PCR产物，随后进行琼脂糖凝胶电泳15.
    6. 仅保留G0代成虫生殖系中带有突变的G1代若虫，丢弃其余个体。
  3. G1若虫/成虫的个体基因分型
    1. 将G1若虫用吸管或毛笔分离至24孔板中。将24孔板置于较大的容器内（例如本方案中使用的中等大小容器），并按上述方法提供水源，以维持60%–80%的相对湿度（图1D）。持续提供人工常规鱼食（图1D’).
      注意：尽管此步骤可在若虫期和成虫期的任何阶段进行，但建议在成虫期达到性成熟后、配对前立即进行>注射后2.5个月； 图1B因为大型容器更易于维持衣鱼的培养，但后续步骤中需要单独饲养以追踪每个G1若虫的基因型。来自同一G0成虫的G1若虫可能具有不同的突变。
    2. 使用镊子夹取若虫/成虫的尾须和尾丝，并将其收集到含有50 µL乙醇的0.2 mL离心管中（长期保存时，将收集的样品置于-20 °C保存）。
      注意：组织样本需采集于乙醇（EtOH）中，因为乙醇可防止这些微小样本因静电而丢失。若需抑制昆虫活动，在采集组织样本时可将若虫或成虫置于冰上进行麻醉。因为 T. domestica 在冰上长期冷却后无法存活，麻醉时间不得超过一分钟，并应立即移回室温环境。切除尾须和尾丝不会导致死亡率升高。
    3. 将样本管敞口置于预热至70 °C的加热块上15分钟，以蒸发乙醇。
    4. 重复步骤 4.2.2–4.2.5 进行基因分型。
    5. 将观察到突变条带模式的PCR产物提交至标准的Sanger测序服务。
    6. 保留具有目标突变的G1若虫/成虫，丢弃其余个体（参见 图4C 以获得具有代表性的测序结果。
  4. 将含有目标突变的成虫在交配皿中进行杂交，获得后代以建立纯合突变品系。

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结果

在我们的操作中，当注射毛细管具有合适的尖端时，单根毛细管可成功注射约100枚卵（图3C）。在产卵后8小时内向胚胎注射gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物，可在gRNA靶向位点产生插入或缺失（indels）。这将导致注射世代（G0）部分细胞发生双等位基因突变，因此通常在G0代获得嵌合突变表型。例如，当使用本方案注射靶向white基因的gRNA时，32.6%的G0若虫在复眼和背部区域表现出色素部分缺失（图5）8。

采用目前所述的干法注射技术，当注射80–120枚卵时，注射胚胎的存活率可高达40%–60%。相比之下，此前的湿法注射技术需在琼脂糖平板上进行卵的注射和培养，其胚胎存活率有时甚至低于10%。

通过基因组PCR结合HMA分析G0代成虫和突变G1代个体的生殖系转化情况。在HMA中，野生型和突变等位基因以所有可能的组合发生退火，通常在凝胶电泳中产生...

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讨论

为了利用CRISPR/Cas9技术成功获得目标 T. domestica 突变体，首先需要收集足量的处于合适发育阶段的胚胎用于显微注射。为了持续获得足量的 T. domestica 卵，关键在于选择合适大小的饲养容器以降低种群密度，因为较低的密度有助于顺利完成一系列复杂的交配行为，而这些行为在每次成虫蜕皮后都会重复发生13。雄性 T. domestica 成虫通过精荚将精子间接传递给雌性。Sweetman（1938年）报道，雄性成虫从开始交配行为到完成精荚放置需要20至35分钟12。其他个体对正在交配的成对个体的干扰很可能阻碍成功受精，而在种群密度较高的环境中，此类干扰发生的频率更高。

尽管在本实验方案中，为了收集足够数量的卵，通常在更换容器内棉塞后8小时收集卵，但若在更短的时间内（例如产卵后4小时内）收集并注射卵，可能会获得更高的基因组编辑效率，因为此时注射材料更有可能递送至较大部分的细胞核。为了在更短时间内注射足够数量的卵，可采取...

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

TO 和 TD 分别得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金项目 19H02970 和 20H02999 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板Corning83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 V3，100 µgIntegrated DNA Technologies1081060
防静电清洁剂HozanZ-292用于去除24孔板上的静电
Barrier Box 20.7LAS ONE4-5606-01大型容器
FemtoJet 4iEppendorf5252000013电子显微注射仪
Femtotip II 注射毛细管Eppendorf5242957000玻璃注射毛细管
High Pack 2440mLAS ONE5-068-25中型容器
培养箱PanasonicMIR-554-PJ用于37 °C 培养。培养箱内无需加湿。
KOD Fx NeoToyoboKFX-101用于基因分型的PCR酶。适用于粗提模板的扩增。
磁力架NarishigeGJ-8用于固定显微操作仪
MicroloaderEppendorf5242956003
显微操作仪NarishigeMM-3
显微镜OlympusSZX12用于显微注射。放大倍数超过35倍即可满足显微注射需求
MultiNAShimadzuMCE-202微芯片电泳系统
NiceTacNichibanNW-5双面胶带，用于将卵固定在载玻片上
画笔（马毛）PentelZBS1-0
植物培养皿SPL Life Sciences310100用于大型和中型容器的交配皿及供水
蛋白酶K，重组型，PCR级，来自毕赤酵母的冻干粉Roche3115836001
SZX 12 显微镜OlympusSZX 12放大倍数超过35倍即可满足显微注射需求
滑石粉Maruishi877113
Tetra Goldfish Gold GrowthSpectrum Brands人工常规鱼饲料

参考文献

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