卵子微弹射和有效交配的基因组编辑在火布拉特 热比亚家

Summary

我们为卵子的饲养、微喷射和在基因组编辑后生成和维持突变菌株的火布拉特 热比亚家用菌 株的有效交配提供了详细的协议。

Abstract

火布拉特 热比亚家是 一种无翼的无翼物种，适合研究昆虫的发展机制，导致它们在地球上成功的进化辐射。基因工具（如基因组编辑）的应用是理解基因变化的关键，这些变化是 Evo-Devo 方法中负责进化过渡的关键。在这篇文章中，我们描述了我们目前的协议，以产生和维持 T.国内突变菌株。我们报告一种干注射方法，作为报告的湿注射方法的替代品，使我们能够获得注射胚胎的稳定高存活率。我们还报告了一个优化的环境设置，以配合成人，并获得后代的高效率。我们的方法强调了将每个物种独特的生物学考虑在非传统模型生物中成功应用基因组编辑方法的重要性。我们预测，这些基因组编辑协议将有助于实施 T.家用作为 实验室模型，并进一步加快该物种中有用的遗传工具的开发和应用。

Introduction

热比娅家居属于最基础的昆虫之一，Zygentoma，它保留了祖先的代谢和无翼生命周期。这种基底植物遗传位置和祖先特征为研究地球上昆虫成功背后的机制树立了有吸引力的模型，昆虫覆盖了描述的动物物种¹的70%以上。长期以来，由于其作为实验室模型的合适特征，如从胚胎到生殖成人的寿命相对较短（2.5-3.0个月），因此主要用于研究昆虫生理的祖先特征:图1A）和一个简单的繁殖。在过去的三十年里，它的使用已经扩大，以研究各种特征的祖先特征，如身体计划，神经分化，昼夜节律^2，3，4。

先进的遗传工具在T.家政的应用可以进一步加速这种贡献，在广泛的研究领域。成功的RNA干扰（RNAi）介制的基因敲击在胚胎，仙女和成人已经报告在T.家庭^4，5，6。系统性RNAi的效率仍然高度依赖物种-例如，它通常是高在科洛普泰拉，而它是低在麻风病顺序

Protocol

1. 实验室菌落的维护

1. 为了维持野生类型和突变种群，使用大型塑料容器（460 毫米 x 360 mm x 170 mm）与常规人工鱼食、顶部有通风孔的塑料杯中的水、用于隐藏昆虫的折叠纸和用于产卵的分层棉花（图 2A）。将所有 T. 家用 文化保留在 37 °C 孵化器内，并将每个容器内的相对湿度 （RH） 设置为 60%-80%。
   注:由于 T.家政 从大气中吸收水蒸气^11，因此不需要直接供水。适当的 RH 是由于每个容器内装有通风孔的塑料杯或无盖杯中存在水蒸气而保持的。无需在包含培养物的整个孵化器内加湿。在此协议中描述的条件下，每个发育阶段的大致持续时间显示在 图 1中。发展速度可以通过改变温度和/或RH¹²来调整。
2. 定期添加食物。在水干涸之前加水。
3. 鉴于成年人停止在肮脏的环境中产卵和/或人口稠密，至少每3个月将人口转移到一个新的清洁容器（见 讨论）。

2. 鸡蛋收集和微弹射

1. 设计指南RNA（gRNA）
   1. 为每个所需目标设计一个 gRNA 序列，并将 gRNA 序列与基因组组装对比，....

Results

在我们手中，大约100个鸡蛋可以很好地注射一个单一的注射毛细亚时，它有足够的尖端（图3C）。在产卵后的前8小时内在胚胎中注射gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物，导致在gRNA靶点产生因德尔。这会导致注射一代 （G0） 的某些细胞发生胆汁突变，因此在 G0 中通常获得突变马赛克表型。例如，当本协议用于注射旨在瞄准 白色 基因的 gRNA 时，32.6% 的 G0 仙女在其复合眼睛和背部区域（图 5）⁸中显示色素素局部损失。

使用目前描述的干注射方法，当注射80-120个卵子时，注射胚胎的存活率高达40%-60%。这与以前的湿注射方法形成鲜明对比，即鸡蛋被注射并维持在阿加罗斯板上，偶尔导致存活率低于10%。

对G0成人和变异G1个体的生殖系转化的评估由基因组PCR完成，然后是HMA。在HMA中，野生型和突变等位基因在每个可能的组合中都具有退色性，这.......

Discussion

对于成功生成所需的 T.家 用突变体CRISPR/Cas9，首先重要的是收集足够数量的分阶段胚胎进行注射。对于足够数量的 T.家蛋 的不断收集，关键是选择一个适当的大小的容器，以具有较低的人口密度，因为它将有助于成功完成一系列复杂的交配行为，这是重复后，每个成人摩尔^13。男性 T.家庭 成人通过精子间接地将其精子转移给女性。斯威特曼（1938年）报告说，从开始交配行为到放置精子磷^12，男性成年人需要20至35分钟。其他人对交配对之间相互作用的干扰可能会阻止成功的受精，这在密集的环境中可能更频繁地发生。

虽然鸡蛋在更换容器内的棉花后8小时收集，以收集足够的鸡蛋在我们的协议，更高的基因组编辑效率可以通过收集鸡蛋，并在较短的时间内注射（例如，4小时后产卵），当注射材料有更多的机会被送到大部分核。如果空间允许，可以（1）增加容器的数量或大小，或（2）重复相同的程序，以获得足够数量的注射卵子，从而在较短的时间内注射足够数量的鸡蛋。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 孔板	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 V3,100 &微量;g	集成 DNA 技术	1081060
防静电清洁剂	Hozan	Z-292	用于去除 24 孔板中的静电
阻隔盒 20.7 升	合一	4-5606-01	大容器
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	电子显微注射器
Femtotip II，注射毛细管	Eppendorf	5242957000	玻璃注射毛细管
高包装 2440 毫升	AS ONE	5-068-25	中型容器
培养箱	Panasonic	MIR-554-PJ	用于 37 °C 孵育。无需在培养箱内加湿。
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR 酶。针对粗模板的扩增进行了优化。
磁力架	Narishige	GJ-8	用于固定显微作器
Microloader	Eppendorf	5242956003
显微作器	Narishige	MM-3
显微镜	Olympus	SZX12	用于显微注射。超过 35 倍的放大倍数足以进行显微注射
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	微芯片电泳系统
NiceTac	Nichiban	NW-5	将鸡蛋放在载玻片上的双面胶带
油漆刷（马毛）	Pentel	ZBS1-0
植物培养皿	SPL 生命科学	310100	用于大型和中型容器的交配皿和水供应
毕赤酵母的蛋白酶 K，重组，PCR 级冻干	罗氏	3115836001
SZX 12 显微镜	奥林巴斯	SZX 12	超过 35 倍的放大倍数足以进行显微注射
滑石粉	丸石	877113
利乐金鱼黄金增长	光谱品牌		人工普通鱼食