本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。
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本文内容
摘要
摘要
传统的细胞内微电极技术用于量化心肌细胞电生理学特性时极为复杂、劳动强度大，且通常通量较低。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的快速发展为心血管研究设立了新标准，目前亟需替代方法以提高单细胞水平电生理数据的获取通量。VF2.1Cl 是一种新近开发的电压敏感性染料，可对膜电位变化产生快速、单通道、高强度的响应。其动力学性能优于现有其他电压指示剂，能够提供与传统微电极技术相当的功能性数据。本文中，我们展示了一种简化的、非侵入性动作电位表征方法，利用模块化且成本低廉的光度测量系统，对外部起搏的人源 iPSC 来源心肌细胞进行检测。
引言
心肌细胞的电生理建模以及构建高效的心脏药物筛选平台，对于多种心律失常类疾病的治疗策略开发至关重要。诱导多能干细胞（iPSC）技术的迅速发展，为利用患者来源的分离心肌细胞（iPSC-CM）进行人类疾病建模和药理学研究提供了广阔前景。“金标准”技术——膜片钳（电流钳）可用于这些细胞的电生理表征，能够量化动作电位（AP）的形态和持续时间；然而，该方法极为复杂且通量低，难以适用于高通量数据采集1。已有大量报道指出，与成年原代心肌细胞相比，iPSC-CM通常表现出较高的舒张期膜电位和增大的漏电流2。有研究认为，iPSC-CM较小的细胞尺寸和降低的膜电容可能在使用电流钳技术时引入一定的系统性误差，这或许可以解释上述差异3。为了最大化iPSC-CM平台的应用价值，亟需一种补充性方法，以提高通量并确保在单细胞水平上对iPSC-CM跨膜电压变化进行表征时的数据准确性。
电压敏感性染料（VSD）长期以来被认为是一种可提供比传统技术更快、无创且等效的心脏动作电位（AP）动力学分析的方法4。最近一项研究证明，采用比率型电压敏感探针光度法可准确量化心脏动作电位5。此外，光学光度法易于扩展的特性使该技术适用于药物研发中关键的大规模心脏毒性筛选（例如，CiPA）。在一项....
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方案
1. 细胞制备
注意：本方案中使用的人类诱导多能干细胞（iPSCs）来源于健康供体，通过已报道的小分子完全定义的WNT信号通路调控及乳酸纯化技术在单层培养条件下进行分化12,13,14。iPSC-CMs 每2-3天更换一次下述培养基进行维持培养。
- 配制含有基础培养基（RPMI 1640）和2%添加剂（B27）的培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
- 配制含有基础培养基（RPMI 1640）、2%添加剂（B27）和1:2000 ROCK抑制剂的铺板培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
- 用150 µL无因子基底膜基质（1:60稀释）包被已灭菌的10 mm圆形#0玻璃盖玻片，于4 °C孵育4小时。
注意：需优化盖玻片上液体体积，以确保完全覆盖整个玻璃表面，同时维持足够的表面张力防止溢出。推荐10 mm圆形盖玻片使用150 µL。批次大小、盖玻片类型、盖玻片体积和培养板类型可根据实验需求调整。 - 使用基于EDTA的细胞解离试剂开始iPSC-CM解离。用1,000 µL移液器轻轻冲洗，确保单层细胞完全脱离。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入两倍体积的铺板培养液，....
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结果
图3：分离的原代心肌细胞与人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）的光学动作电位（AP）特征。(A) 单个小鼠心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及APD50和APD90的均值±标准误（n = 7，右侧）。(B) 单个人源iPSC来源心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及APD50和APD90的均值±标准误（n = 48，右侧）。(C) 使用1 µM 尼卡地平对iPSC-CM动作电位进行药理学干预（中间）；尼卡地平处理.......
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讨论
本文介绍了一种基本实验方案，可轻松获取适用于电生理建模和心脏药物筛选的、来自分离的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）的详细动作电位（AP）特征。我们在低密度接种的iPSC-CMs中检测到规律且稳定的动作电位，表明所用指示剂功能正常，且方法具有良好的可靠性。
由于iPSC重编程的商业化方法种类繁多，且心肌分化方案缺乏标准化，基于iPSC的模型在功能和形态上可能表现出极大的变异性16。这也会阻碍心脏毒性研究的有效性。我们发现，在低激发光强度下，该方法对长期实验具有普遍较强的响应性，且指示剂诱导的细胞毒性极低。标准化的基本解离和盖玻片接种步骤对于确保iPSC-CM制备的一致性质量至关重要。可松动的盖玻片能够方便地插入和更换于成像平台内，对于单个心肌细胞的快速数据采集和表征极为有用。然而需要注意的是，我们观察到在玻璃盖玻片上进行长时间（即超过4周）稀疏培养后，细胞活力会出现轻微下降。
第2步中概述的高速光度测量系统的模块化构建对本方案至关重要。目前市面上有许多基于光学的设备可.......
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披露
Cairn Research Ltd 通过承担视频文件的制作费用，支持了本出版物的发表。
致谢
作者谨此感谢Cairn Research Ltd. 的慷慨资助，该资助涵盖了本出版物的制作费用。此外，我们感谢Ines Mueller女士和Stefanie Kestel女士提供的出色技术支持。
作者的研究由德国心血管研究中心（DZHK）、德国研究基金会（DFG，德国研究基金会，VO 1568/3-1、IRTG1816 RP12、SFB1002 TPA13 以及德国卓越战略计划 - EXC 2067/1- 390729940）和Else-Kröner-Fresenius基金会（EKFS 2016_A20）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt 膜电位检测试剂盒 | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK 抑制剂 Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| 设备 | |||
| 495LP 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B 放大器 | Molecular Devices | ||
| 圆形盖玻片，厚度 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED 电源 | Cairn Research | ||
| ET470/40x 激发滤光片 | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| 刻蚀式血细胞计数板 | Hausser Scientific | ||
| 滤光立方体 | Cairn Research | ||
| IX73 倒置显微镜 | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| 多端口适配器 | Cairn Research | ||
| Myopacer 细胞刺激器 | IonOptix | ||
| Optomask 快门 | Cairn Research | ||
| Optoscan 系统控制器 | Cairn Research | ||
| PH-1 温控平台 | Warner Instruments | ||
| 光电倍增管检测器 | Cairn Research | ||
| PMT 放大器插件 | Cairn Research | ||
| PMT 电源插件 | Cairn Research | ||
| RC-26G 开放式浴槽腔室 | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL 显微镜载物台适配器 | Olympus | ||
| T565lpxr 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| T660lpxr 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| TC-20 双通道温度控制器 | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X 物镜 | Olympus | ||
| USB 3.0 彩色相机 | Imaging Source | ||
| 软件 | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
参考文献
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
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重印与许可
