本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。
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本文内容
摘要
摘要
传统的细胞内微电极技术用于量化心肌细胞电生理学特性时极为复杂、劳动强度大，且通常通量较低。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的快速发展为心血管研究设立了新标准，目前亟需替代方法以提高单细胞水平电生理数据的获取通量。VF2.1Cl 是一种新近开发的电压敏感性染料，可对膜电位变化产生快速、单通道、高强度的响应。其动力学性能优于现有其他电压指示剂，能够提供与传统微电极技术相当的功能性数据。本文中，我们展示了一种简化的、非侵入性动作电位表征方法，利用模块化且成本低廉的光度测量系统，对外部起搏的人源 iPSC 来源心肌细胞进行检测。
引言
心肌细胞的电生理建模以及构建高效的心脏药物筛选平台，对于多种心律失常类疾病的治疗策略开发至关重要。诱导多能干细胞（iPSC）技术的迅速发展，为利用患者来源的分离心肌细胞（iPSC-CM）进行人类疾病建模和药理学研究提供了广阔前景。“金标准”技术——膜片钳（电流钳）可用于这些细胞的电生理表征，能够量化动作电位（AP）的形态和持续时间；然而，该方法极为复杂且通量低，难以适用于高通量数据采集1。已有大量报道指出，与成年原代心肌细胞相比，iPSC-CM通常表现出较高的舒张期膜电位和增大的漏电流2。有研究认为，iPSC-CM较小的细胞尺寸和降低的膜电容可能在使用电流钳技术时引入一定的系统性误差，这或许可以解释上述差异3。为了最大化iPSC-CM平台的应用价值，亟需一种补充性方法，以提高通量并确保在单细胞水平上对iPSC-CM跨膜电压变化进行表征时的数据准确性。
电压敏感性染料（VSD）长期以来被认为是一种可提供比传统技术更快、无创且等效的心脏动作电位（AP）动力学分析的方法4。最近一项研究证明，采用比率型电压敏感探针光度法可准确量化心脏动作电位5。此外，光学光度法易于扩展的特性使该技术适用于药物研发中关键的大规模心脏毒性筛选（例如，CiPA）。在一项采用微电极阵列和电压感应光学技术的多中心盲法研究中，标准化心脏毒性检测方案的建立已充分体现了该方法的重要价值6。
目前市面上有多种可用的电位敏感染料，且新型探针的合成研究正在不断推进，有望显著提升其在多种心脏和神经组织构建物中的应用效果。理想的电压敏感染料（VSD）应具备更快的动力学响应和更高的灵敏度，同时降低电容负载、光漂白效应及细胞毒性。近期合成的 VF2.1Cl（FluoVolt）在很大程度上得益于其新颖的基于“分子导线”结构的分子设计，该结构也为新近开发的 VoltageFluor（VF）家族其他成员所共有7。与常见的电致变色型电压敏感染料不同——后者通过简单的探针分子与细胞质膜在分子和电学层面直接共轭结合——这种染料采用了一种被动插入、横跨膜结构的合成“分子导线”，将一个富电子给体与经修饰的荧光素荧光团（FITC）配对。其作用机制详见图1。该染料对膜电位波动表现出优异的敏感性，在相同响应速度下，每 100 mV 可产生 27% 的发射光强变化，而其他常见探针仅约为 10%7。此外，基于“分子导线”的PeT系统不直接与细胞电场相互作用，因而几乎不产生电学干扰，对细胞电容负载的影响也可忽略不计。
图1：VF2.1Cl染料的化学、光谱与作用机制参数。（A）VF2.1Cl的化学结构。需注意的分子特征包括苯乙烯基分子导线内部的多个烷基链，有助于插入质膜。连接在FITC探针上的带负电荷的磺酸基团可确保荧光团在细胞外表面的稳定，并促进其相对于脂双层电场方向近乎垂直地插入。（B）VF2.1Cl垂直嵌入靶细胞质膜的简化示意图。（C）VF2.1Cl染料的吸收光谱与发射光谱。其光谱与标准FITC和GFP探针相同。（D）VF2.1Cl作用机制的示意图。在静息状态（超极化）下，细胞内负电压驱动自由电子向头部荧光团移动。电子富集使得光激发后从激发态通过光诱导电子转移（PeT）途径释放能量成为优势路径，从而有效淬灭荧光。相反，在去极化膜电位条件下，电子向下移动受阻，有利于光激发后产生荧光。所产生的荧光响应与膜电位呈线性关系，可用于精确获取细胞电生理动力学的详细时间信息。（E）负载VF2.1Cl的兔心肌细胞的代表性明场（上）和470 nm荧光图像（下）。（F）单个负载染料的心肌细胞的Z轴层扫图像。箭头指示VF2.1Cl在细胞膜上的清晰定位区域。图像使用转盘共聚焦系统采集，该系统包括X-lightv3转盘共聚焦头（50 µm针孔模式）、LDI-7照明器、Prime95B相机和PlanApo Lambda 100x物镜。比例尺：20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
FITC 探针与 VF2.1Cl 偶联，确保其可在标准荧光和 GFP 滤光配置下有效使用，并且仅需单通道采集系统，这两种特性在荧光成像平台中均十分常见。近期已有研究报道使用该染料对高密度人源 iPSC-CM 单层细胞进行分析8,9,10,11。本实验方案与上述研究有所不同，主要体现在我们研究的是单个分离的 iPSC-CM，避免了高密度合胞体单层细胞所产生的电耦合和旁分泌影响；同时，我们采用了一种经济且可定制的光度测量系统，而非复杂的共聚焦或宽场成像装置。
本文描述了我们从分离的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞及原代心肌细胞中快速获取和分析稳定光学动作电位的实验方案（参见补充文件）。我们采用VF2.1Cl探针，并结合可定制的先进单细胞光度测量平台进行检测。上述实验方案已获哥廷根大学医学中心伦理委员会批准（编号：10/9/15）。
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方案
1. 细胞制备
注意：本方案中使用的人类诱导多能干细胞（iPSCs）来源于健康供体，通过已报道的小分子完全定义的WNT信号通路调控及乳酸纯化技术在单层培养条件下进行分化12,13,14。iPSC-CMs 每2-3天更换一次下述培养基进行维持培养。
- 配制含有基础培养基（RPMI 1640）和2%添加剂（B27）的培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
- 配制含有基础培养基（RPMI 1640）、2%添加剂（B27）和1:2000 ROCK抑制剂的铺板培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
- 用150 µL无因子基底膜基质（1:60稀释）包被已灭菌的10 mm圆形#0玻璃盖玻片，于4 °C孵育4小时。
注意：需优化盖玻片上液体体积，以确保完全覆盖整个玻璃表面，同时维持足够的表面张力防止溢出。推荐10 mm圆形盖玻片使用150 µL。批次大小、盖玻片类型、盖玻片体积和培养板类型可根据实验需求调整。 - 使用基于EDTA的细胞解离试剂开始iPSC-CM解离。用1,000 µL移液器轻轻冲洗，确保单层细胞完全脱离。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入两倍体积的铺板培养液，以100 × g离心10分钟。
- 用所需体积（重悬体积）的铺板培养液重悬细胞沉淀，通过手动或电子方式计数细胞。
- 选择每张盖玻片的最佳细胞密度（15,000），以便后续进行单个细胞分析。
- 计算在该目标密度下接种所有盖玻片所需的“活性”细胞悬液体积（A）。应用以下公式，并将计算结果移取至另一离心管中：
- 计算为每张盖玻片提供目标体积所需的额外铺板培养液体积（B）。应用以下公式，并将所得体积加入活性细胞悬液管中：
![盖玻片体积计算公式，B[μl]=(盖玻片数量×盖玻片体积[μl])-A[μl]。](/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg "figure-protocol-2")
- 去除盖玻片上的基质，向每张盖玻片加入体积为“盖玻片体积”的细胞悬液（A+B）。在加样过程中需定期重悬管中液体，以确保细胞分布均匀。
- 于37 °C孵育1小时，随后轻柔地向孔中补加铺板培养液至满。
- 24小时后，更换为常规培养液，并每2–3天更换一次。
2. 实验装置
- 使用配备40倍放大倍率、高数值孔径物镜（N.A: > 0.75）的倒置落射荧光显微镜进行实验。
- 将一个快速切换的暖白光LED连接至显微镜的透射照明端口。在透射光路中插入一个简单的红色660 nm滤光片。
注意：在光度测定实验过程中可开启此光源，以观察样品，而不会干扰绿色荧光信号。 - 安装一个用于光度记录的快速切换470 nm LED光源。在显微镜的落射荧光端口插入470/40激发滤光片，以净化LED产生的光线。
注意：为实现最佳信号定量，建议使用具有高速反馈控制光学输出的照明系统。 - 在显微镜镜组转盘内插入包含495 nm长通分光镜的显微镜滤光立方体。
- 在显微镜C接口端口安装带有可调视场光阑的检测臂，以便选择感兴趣区域。
- 分别将光电倍增管检测器（PMT）和USB相机连接至显微镜，构成发射光检测系统的基础。
- 在PMT端口插入包含565 nm长通分光镜和535/50发射滤光片的滤光立方体，以将发射光分配至两个检测器。
注意：连接在发射检测系统透射端口的相机可在整个实验过程中检测明场下的透射光。 - 将PMT连接至电源和PMT放大器。将PMT放大器输出端连接至数据采集系统的模拟输入端口。
- 对来自PMT的模拟信号以1 kHz或更高频率进行滤波。
- 以至少为模拟信号中最高频率两倍的频率（2 kHz或更高）对数据进行数字化，以满足奈奎斯特采样定理，防止混叠现象。
3. 使用 VF2.1Cl 进行细胞负载
注意：所有涉及该染料的步骤均须在避光条件下进行。
- 配制 Tyrode 浴液（单位：mM）：140 NaCl，10 HEPES，10 葡萄糖，4 KCl，1 MgCl2, 2 CaCl2，pH = 7.35，预热至 37 °C.
- 在微量离心管中，通过混合配制一份上样溶液 5 µL 1,000x VF2.1Cl 的 50 µL 20% 增溶性泊洛沙姆溶液
- 应用 5 µL 将上样液加入至20 mm培养皿中5 mL预热的Tyrode's溶液内（终浓度为0.1x染料浓度）。
注意：最终染料浓度为 0.1x，即 1/10。th 如制造商建议的方案。该方法可节约资源，确保细胞毒性可忽略不计，并且重要的是，仍能从负载细胞中获得具有高信噪比的清晰光学信号。 - 将一张iPSC-CM盖玻片加入培养皿中，并在 37 °C 20 分钟。
- 组装加热的活细胞成像室，安装到显微镜载物台上并灌注 500 µL 新鲜的Tyrode's溶液。
- 用新鲜的Tyrode溶液冲洗盖玻片 37 °C.
- 使用精细尖头镊子将iPSC-CM盖玻片小心地移至预热的灌流槽中。
注意：确保灌流室及其内容物始终维持在生理温度下加热。如有需要，可先用预热的台罗德溶液持续灌流。
4. 电场刺激
注意：对iPSC-CM进行外部刺激是可选的，但有助于标准化细胞动态和实验参数。这可以简化分析过程，并允许研究频率依赖性效应。
- 将一个带有两个铂电极的刺激插件（电极间距为 5 mm）安装到记录室中。
- 将外部刺激器连接至刺激插件，设置为 0.5 Hz 的双相场脉冲，脉宽 5 ms。
- 通过从 1 V 逐步增加刺激电压来确定最佳刺激电压。阈值刺激定义为细胞开始收缩时的最低电压。施加的电压约为该阈值的 1.25 倍。正常电压范围在 1 V 至 30 V 之间。
- 通过外部刺激器设定刺激频率，或由采集软件触发刺激。
5. 光学动作电位采集
注意：本方案使用商业软件进行数据采集与分析。
- 使用透射光路和USB相机，在明场下观察心肌细胞。
- 选择一个孤立的细胞，并用视场光阑紧密裁剪其光学路径，确保仅监测来自目标细胞的光信号。
- 启动PMT放大器，并将PMT电源电压设为750 V。
- 运行刺激程序（见步骤4），同时启动采集软件并激活470 nm激发光。后者可通过远程控制面板操作，或通过TTL信号以固定强度自动触发。
- 调节PMT放大器的增益和偏移，确保信号不饱和，并优化至记录系统的检测范围。
- 记录10次扫描，确保检测到稳定的动作电位。
- 继续记录，立即移动显微镜载物台，短暂采集无细胞区域的背景信号。随后关闭激发光。
注：该背景值（Foffset）将用于校正任何背景荧光。 - 如需要，可局部灌注参考药物（如1 µM硝苯地平），以鉴定细胞对药理学干预的反应。
- 依次重复步骤5.2–5.7，每次选择一个新的细胞。如需要，可更换盖玻片，以确保单次实验中获得较高的样本通量。
注：加样与图像采集流程详见图2。
6. 数据分析
- 使用分析软件打开已保存的记录文件，对单个细胞中包含刺激诱发动作电位的10次扫描信号进行平均。
- 取代表Foffset的基线信号均值，并从平均后的轨迹中减去该值。
- 使用以下公式计算∆F/F0（其中F为测得的荧光强度，F0为舒张期荧光强度）：
- 确定轨迹的基线（舒张期）和感兴趣区域（动作电位，AP），并测量所需的心脏动作电位参数。包括但不限于50%（APD50）和90%（APD90）复极化的衰减时间。
- 将该单个细胞的数据导出至电子表格软件中。
- 对所有记录重复步骤6.1–6.5。采用适当的非配对检验或方差分析评估结果。
图2：加载与图像采集方案。（A）iPSC-CM 和原代心肌细胞完整加载 VF2.1Cl 的流程图。（B）本方案中用于激发和检测 VF2.1Cl 发射光以响应跨膜电压变化的分光镜（BS）与滤光片配置的简化示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
图3：分离的原代心肌细胞与人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）的光学动作电位（AP）特征。(A) 单个小鼠心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及APD50和APD90的均值±标准误（n = 7，右侧）。(B) 单个人源iPSC来源心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及APD50和APD90的均值±标准误（n = 48，右侧）。(C) 使用1 µM 尼卡地平对iPSC-CM动作电位进行药理学干预（中间）；尼卡地平处理...
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讨论
本文介绍了一种基本实验方案，可轻松获取适用于电生理建模和心脏药物筛选的、来自分离的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）的详细动作电位（AP）特征。我们在低密度接种的iPSC-CMs中检测到规律且稳定的动作电位，表明所用指示剂功能正常，且方法具有良好的可靠性。
由于iPSC重编程的商业化方法种类繁多，且心肌分化方案缺乏标准化，基于iPSC的模型在功能和形态上可能表现出极大的变异性16。这也会阻碍心脏毒性研究的有效性。我们发现，在低激发光强度下，该方法对长期实验具有普遍较强的响应性，且指示剂诱导的细胞毒性极低。标准化的基本解离和盖玻片接种步骤对于确保iPSC-CM制备的一致性质量至关重要。可松动的盖玻片能够方便地插入和更换于成像平台内，对于单个心肌细胞的快速数据采集和表征极为有用。然而需要注意的是，我们观察到在玻璃盖玻片上进行长时间（即超过4周）稀疏培养后，细胞活力会出现轻微下降。
第2步中概述的高速光度测量系统的模块化构建对本方案至关重要。目前市面上有许多基于光学的设备可...
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披露
Cairn Research Ltd 通过承担视频文件的制作费用，支持了本出版物的发表。
致谢
作者谨此感谢Cairn Research Ltd. 的慷慨资助，该资助涵盖了本出版物的制作费用。此外，我们感谢Ines Mueller女士和Stefanie Kestel女士提供的出色技术支持。
作者的研究由德国心血管研究中心（DZHK）、德国研究基金会（DFG，德国研究基金会，VO 1568/3-1、IRTG1816 RP12、SFB1002 TPA13 以及德国卓越战略计划 - EXC 2067/1- 390729940）和Else-Kröner-Fresenius基金会（EKFS 2016_A20）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt 膜电位检测试剂盒 | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK 抑制剂 Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| 设备 | |||
| 495LP 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B 放大器 | Molecular Devices | ||
| 圆形盖玻片，厚度 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED 电源 | Cairn Research | ||
| ET470/40x 激发滤光片 | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| 刻蚀式血细胞计数板 | Hausser Scientific | ||
| 滤光立方体 | Cairn Research | ||
| IX73 倒置显微镜 | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| 多端口适配器 | Cairn Research | ||
| Myopacer 细胞刺激器 | IonOptix | ||
| Optomask 快门 | Cairn Research | ||
| Optoscan 系统控制器 | Cairn Research | ||
| PH-1 温控平台 | Warner Instruments | ||
| 光电倍增管检测器 | Cairn Research | ||
| PMT 放大器插件 | Cairn Research | ||
| PMT 电源插件 | Cairn Research | ||
| RC-26G 开放式浴槽腔室 | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL 显微镜载物台适配器 | Olympus | ||
| T565lpxr 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| T660lpxr 二向色分光镜 | Chroma Technology | ||
| TC-20 双通道温度控制器 | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X 物镜 | Olympus | ||
| USB 3.0 彩色相机 | Imaging Source | ||
| 软件 | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
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