人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

摘要

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。

摘要

传统的细胞内微电极技术用于量化心肌细胞电生理学特性时极为复杂、劳动强度大，且通常通量较低。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的快速发展为心血管研究设立了新标准，目前亟需替代方法以提高单细胞水平电生理数据的获取通量。VF2.1Cl 是一种新近开发的电压敏感性染料，可对膜电位变化产生快速、单通道、高强度的响应。其动力学性能优于现有其他电压指示剂，能够提供与传统微电极技术相当的功能性数据。本文中，我们展示了一种简化的、非侵入性动作电位表征方法，利用模块化且成本低廉的光度测量系统，对外部起搏的人源 iPSC 来源心肌细胞进行检测。

引言

心肌细胞的电生理建模以及构建高效的心脏药物筛选平台，对于开发多种心律失常疾病的治疗策略至关重要。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的快速发展，为利用患者来源的心肌细胞（iPSC-CM）进行人类疾病建模和药理学研究提供了广阔前景。“金标准”技术——膜片钳（电流钳）可对这些细胞进行电生理表征，定量分析动作电位（AP）的形态和持续时间。然而，该方法极为复杂且通量低，不适合高通量数据采集¹。已有文献经常报道，与成年原代心肌细胞相比，iPSC-CM具有较高的舒张期膜电位和增大的漏电流²。有研究认为，iPSC-CM细胞体积较小且膜电容降低，可能在使用电流钳技术时引入系统性误差，从而解释上述差异³。为了最大化iPSC-CM平台的应用价值，亟需一种补充性方法，以提高通量并确保在单细胞水平上对iPSC-CM跨膜电压变化进行准确表征。

电压敏感性染料（VSD）长期以来被认为是一种可提供比传统技术更快、无创且等效的心脏动作电位（AP）动力学分析的方法⁴。最近一项研究证明，采用比率型电压敏感探针光度法可准确量化心脏动作电位⁵。此外，光学光度法易于扩展的特性使其适用于大规模的心脏毒性筛选，在治疗性药物开发（例如 CiPA）中具有关键意义。在一项采用微电极阵列和电压感应光学技术的多中心盲法研究中，标准化心脏毒性检测方案的建立已充分体现了该方法的重要价值⁶。

目前市面上有多种可用的电位敏感染料，而新型探针的持续合成开发在多种心脏和神经结构中展现出显著提升其效能的潜力。理想的电压敏感染料（VSD）应具备增强的动力学特性和灵敏度，同时表现出更低的电容负载、光漂白性和细胞毒性。最近合成的 VF2.1Cl（FluoVolt）在很大程度上因其新颖的基于“分子导线”的结构而具备了上述诸多优良特性，该结构也为新型 VoltageFluor（VF）家族的其他成员所共有⁷。与常见的电致变色型电压敏感染料不同——后者通过简单的探针分子与质膜在分子和电学上共轭结合——这种染料包含一条被动插入、横跨膜的合成“分子导线”，将一个富电子给体与一种修饰过的荧光素荧光团（FITC）配对。其作用机制详见图1。该染料对膜电位波动表现出优异的敏感性，在可比速度下每100 mV的膜电位变化可引起27%的发射光强度变化，而其他常见探针仅约有10%的变化⁷。此外，基于“分子导线”的PeT系统不直接与细胞电场相互作用，因而产生的电学干扰极小，且对细胞电容负载的影响可忽略不计。

图1：VF2.1Cl染料的化学、光谱与作用机制参数。（A）VF2.1Cl的化学结构。需注意的分子特征包括苯乙烯基分子导线中含有的多个烷基，有助于插入质膜。与FITC探针共轭的带负电荷的磺酸基团可确保荧光团在细胞外表面的稳定，并促进其相对于脂质双分子层电场近乎垂直地插入。（B）VF2.1Cl垂直嵌入靶细胞质膜的简化示意图。（C）VF2.1Cl染料的吸收与发射光谱。该光谱与标准FITC和GFP探针相同。（D）VF2.1Cl作用机制的图示。在静息状态（超极化）下，细胞内负电压驱动自由电子向头部荧光团移动。电子富集使得在光激发后，光诱导电子转移（PeT）成为激发态退激的主要途径，从而有效淬灭荧光。相反，在去极化膜电位条件下，电子向下移动，有利于光激发后产生荧光。所产生的荧光响应与膜电压呈线性关系，可用于精确获取细胞电生理动力学的详细时间信息。（E）负载VF2.1Cl的兔心肌细胞的代表性明场（上图）和470 nm荧光（下图）图像。（F）单个负载染料的心肌细胞的Z轴层扫图像。箭头指示VF2.1Cl在细胞膜上清晰定位的区域。图像使用转盘共聚焦系统采集，系统配置包括X-lightv3转盘共聚焦头（针孔模式为50 µm）、LDI-7照明器、Prime95B相机和PlanApo Lambda 100倍物镜。比例尺：20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

FITC 探针与 VF2.1Cl 偶联，确保其可在标准荧光和 GFP 滤光片配置下有效使用，并且仅需单通道采集系统，这两点均为荧光成像平台的常见特征。近期已有报道使用该染料对密集的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）单层进行分析^8,9,10,11。本实验方案与上述研究有所不同，因为我们研究的是单个、分离的 iPSC-CM，避免了密集合胞体单层所产生的电学和旁分泌影响；同时我们采用了一种价格低廉且可定制的光度测量系统，而非复杂的共聚焦或宽场成像装置。

本文介绍了我们从分离的人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞及原代心肌细胞中快速获取和分析稳定光学动作电位的实验方案（参见补充文件）。我们采用VF2.1Cl探针，并结合可定制的先进单细胞光度测量平台进行检测。这些实验方案已获得哥廷根大学医学中心伦理委员会批准（编号：10/9/15）。

方案

1. 细胞制备

注意：本方案中使用的人类iPSC来自健康供体，并通过全定义的小分子调控WNT信号通路及乳酸纯化技术在单层培养条件下进行分化，具体方法如前所述^12,13,14。iPSC-CMs每2-3天使用下述培养基进行传代培养。

1. 配制含有基础培养基（RPMI 1640）和2%添加剂（B27）的培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
2. 配制含有基础培养基（RPMI 1640）、2%添加剂（B27）和1:2000 ROCK抑制剂的铺板培养液，4 °C保存，使用时恢复至室温（RT）。
3. 用150 µL无因子基底膜基质（1:60稀释）包被已灭菌的10 mm圆形#0玻璃盖玻片，4 °C孵育4 h。
   注意：需优化盖玻片上液体体积，以确保完全覆盖整个玻璃表面，同时维持足够的表面张力防止溢出。推荐10 mm圆形盖玻片使用150 µL。可根据实验需求调整批次大小、盖玻片类型、盖玻片体积和培养板类型。
4. 使用基于EDTA的细胞解离试剂开始iPSC-CM解离。用1,000 µL移液器轻轻冲洗，确保单层细胞完全脱离。
5. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入两倍体积的铺板培养液，100 × g离心10分钟。
6. 用所需体积（重悬体积）的铺板培养液重悬细胞沉淀，通过手动或电子方式计数细胞。
7. 选择每张盖玻片的最佳细胞密度（15,000），以便后续进行单个细胞分析。
8. 计算在该理想密度下接种所有盖玻片所需的“活性”细胞悬液体积（A）。应用以下公式，并将计算结果移取至另一离心管中：
   
9. 计算为每张盖玻片提供目标体积所需的额外铺板培养液体积（B）。应用以下公式，并将计算所得体积加入活性细胞悬液管中：
   
10. 去除盖玻片上的基质，向每张盖玻片加入“盖玻片体积”的细胞悬液（A+B）。在加样过程中定期重悬管中液体，以确保细胞分布均匀。
11. 37 °C孵育1小时，然后轻柔地向孔中加满铺板培养液。
12. 24小时后，更换为常规培养液，并每2–3天更换一次。

2. 实验装置

1. 使用配备40倍放大倍率、高数值孔径物镜（N.A: > 0.75）的倒置落射荧光显微镜进行实验。
2. 将一个快速切换的暖白光LED连接至显微镜的透射光照明端口。在透射光路中插入一个简单的红色660 nm滤光片。
   注意：在光度测量实验过程中可开启此光源，以观察样品，而不会干扰绿色荧光信号。
3. 安装一个用于光度记录的快速切换470 nm LED光源。在显微镜的落射荧光端口插入470/40激发滤光片，以净化LED产生的光线。
   注意：为实现最佳信号定量，建议使用具有高速反馈控制光学输出的照明系统。
4. 在显微镜镜组转盘内插入包含495 nm长通分光镜的显微镜滤光立方体。
5. 在显微镜C接口端口安装带有可调视场光阑的检测臂，以便选择感兴趣区域。
6. 分别将光电倍增管检测器（PMT）和USB相机连接至显微镜，构成发射光检测系统的基础。
7. 在PMT端口插入包含565 nm长通分光镜和535/50发射滤光片的滤光立方体，以将发射光分配至两个检测器。
   注意：连接在发射检测系统透射端口的相机可在整个实验过程中检测明场下的透射光。
8. 将PMT连接至电源和PMT放大器。将PMT放大器输出端连接至数据采集系统的模拟输入端口。
9. 对来自PMT的模拟信号以1 kHz或更高频率进行滤波。
10. 以至少为模拟信号中最高频率两倍的频率（2 kHz或更高）对数据进行数字化，以满足奈奎斯特准则并防止混叠。

3. 使用 VF2.1Cl 进行细胞负载

注意：所有涉及该染料的步骤均须在弱光条件下进行。

1. 配制 Tyrode’s 灌流液（单位：mM）：140 NaCl，10 HEPES，10 葡萄糖，4 KCl，1 MgCl₂₂，2 CaCl₂，pH = 7.35，预热至 37 °C。
2. 在微量离心管中，将5 µL 1,000x VF2.1Cl与50 µL 20%溶解用泊洛沙姆溶液混合，配制一份上样溶液。
3. 在20 mm的培养皿中，将5 µL上样液加入5 mL预热的Tyrode's溶液中（终浓度为0.1×染料浓度）。
   注意：最终染料浓度为 0.1x，即 1/10。^th 制造商推荐的方法。这种方法节约资源，确保细胞毒性可忽略不计，并且重要的是，仍能从负载细胞中获得清晰的光学信号，具有高信噪比。
4. 将一张iPSC-CM盖玻片加入培养皿中，于37 °C孵育20分钟。
5. 组装加热式活细胞成像室，将其安装到显微镜载物台上，并加入500 µL新鲜的Tyrode溶液。
6. 用37 °C的新鲜Tyrode溶液洗涤盖玻片。
7. 使用精细尖头镊子将iPSC-CM盖玻片小心地转移至预热的灌流槽室中。
   注意：确保灌流室及其内容物始终在生理温度下加热。如有需要，可开始持续灌注预热的Tyrode溶液。

4. 电场刺激

注意：对iPSC-CM进行外部刺激是可选的，但有助于标准化细胞动态和实验参数。这可以简化分析过程，并允许研究频率依赖性效应。

1. 将一个带有两个相距 5 mm 铂电极的刺激装置插入记录室中。
2. 将外部刺激器连接至刺激装置，设置为 0.5 Hz 的 5 ms 双相场脉冲。
3. 通过从 1 V 逐步增加刺激电压来确定最佳刺激电压。阈值刺激定义为细胞开始收缩时的最低电压。施加的电压应比该阈值高约 25%。正常范围在 1 V 至 30 V 之间。
4. 通过外部刺激器设定刺激频率，或由采集软件触发刺激。

5. 光学动作电位采集

注意：本实验方案使用商业软件进行数据采集与分析。

1. 使用透射光路和USB相机，在明场模式下观察心肌细胞。
2. 选择一个孤立的细胞，并使用视场光阑紧密裁剪其光路，确保仅监测来自目标细胞的光信号。
3. 启动PMT放大器，并将PMT电源电压设为750 V。
4. 运行刺激程序（见步骤4），同时启动采集软件并同步开启470 nm激发光。后者可通过远程控制面板操作，或以固定强度（TTL信号）自动触发。
5. 调节PMT放大器的增益和偏移，确保信号不饱和，并优化至记录系统的检测范围。
6. 记录10次扫描，确保检测到稳定的动作电位。
7. 继续记录，立即移动显微镜载物台，短暂获取无细胞区域的背景信号，随后关闭激发光。
   注意：该背景值（F_offset）将用于校正任何背景荧光。
8. 如需要，可局部灌注参考药物（例如1 µM硝苯地平），以鉴定细胞对药理学干预的反应。
9. 依次重复步骤5.2–5.7，每次选择一个新的细胞。如需要，可更换盖玻片，以确保单次实验中实现较高的样本通量。
   注意：染色及图像采集方案详见图2。

6. 数据分析

1. 使用分析软件打开已保存的记录文件，对单个细胞中包含刺激诱发动作电位的10次扫描信号进行平均。
2. 取代表F_offset的基线信号均值，并从平均后的轨迹中减去该值。
3. 使用以下公式计算∆F/F0（其中F为测得的荧光强度，F0为舒张期荧光强度）：
   
4. 确定轨迹的基线（舒张期）和感兴趣区域（动作电位，AP），并测量所需的心肌动作电位参数。包括但不限于复极化50%（APD₅₀）和90%（APD₉₀）的衰减时间。
5. 将该单个细胞的数据导出至电子表格软件中。
6. 对所有记录重复步骤6.1–6.5。采用适当的非配对检验或方差分析对结果进行评估。

图2：染料负载与图像采集流程。（A）iPSC-CM和原代心肌细胞进行VF2.1Cl染料负载的完整流程图。（B）本实验中用于激发和检测VF2.1Cl荧光信号以响应跨膜电压变化的分光镜（BS）及滤光片配置简化示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

图 3：分离的原代心肌细胞和人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）的光学动作电位（AP）曲线。（A）单个小鼠心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及 APD₅₀ 和 APD₉₀ 的均值 ± 标准误（n = 7，右侧）。（B）单个人源 iPSC 来源心肌细胞的代表性光学动作电位（中间），以及 APD₅₀ 和 APD₉₀ 的均值 ± 标准误（n = 48，右侧）。（C）使用 1 µM 尼卡地平对 iPSC-CM 动作电位进行药理学...

讨论

本文介绍了一种基本实验方案，可轻松获取适用于电生理建模和心脏药物筛选的、来自分离的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）的详细动作电位（AP）特征。我们在低密度接种的iPSC-CMs中检测到规律且稳定的动作电位，表明所用指示剂功能正常，且方法具有良好的可靠性。

由于iPSC重编程的商业化方法种类繁多，且心肌分化方案缺乏标准化，基于iPSC的模型在功能和形态上可能表现出极大的变异性¹⁶。这也会阻碍心脏毒性研究的有效性。我们发现，在低激发光强度下，该方法对长期实验具有普遍较强的响应性，且指示剂诱导的细胞毒性极低。标准化的基本解离和盖玻片接种步骤对于确保iPSC-CM制备的一致性质量至关重要。可松动的盖玻片能够方便地插入和更换于成像平台内，对于单个心肌细胞的快速数据采集和表征极为有用。然而需要注意的是，我们观察到在玻璃盖玻片上进行长时间（即超过4周）稀疏培养后，细胞活力会出现轻微下降。

第2步中概述的高速光度测量系统的模块化构建对本方案至关重要。目前市面上有许多基于光学的设备可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
0.25 Trypsin EDTA	Gibco	25200056
B27 Supplement	Gibco	17504044
CaCl2	Carl Roth	HN04.2
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica	ITW Reagents	A1422
胎牛血清	Gibco	10270-106
FluoVolt 膜电位检测试剂盒	Invitrogen	F10488
HEPES	Carl Roth	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	Sigma-Aldrich	9265.2
Nifedipine	Sigma-Aldrich	21829-25-4
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140
ROCK 抑制剂 Y27632	Stemolecule	04-0012-10
RPMI 1640 培养基	Gibco	61870010
Versene EDTA	Gibco	15040033
设备
495LP 二向色分光镜	Chroma Technology
Axopatch 200B 放大器	Molecular Devices
圆形盖玻片，厚度 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	Molecular Devices
Dual OptoLED 电源	Cairn Research
ET470/40x 激发滤光片	Chroma Technology
ET535/50m	Chroma Technology
刻蚀式血细胞计数板	Hausser Scientific
滤光立方体	Cairn Research
IX73 倒置显微镜	Olympus
MonoLED	Cairn Research
多端口适配器	Cairn Research
Myopacer 细胞刺激器	IonOptix
Optomask 快门	Cairn Research
Optoscan 系统控制器	Cairn Research
PH-1 温控平台	Warner Instruments
光电倍增管检测器	Cairn Research
PMT 放大器插件	Cairn Research
PMT 电源插件	Cairn Research
RC-26G 开放式浴槽腔室	Warner Instruments
SA-OLY/2AL 显微镜载物台适配器	Olympus
T565lpxr 二向色分光镜	Chroma Technology
T660lpxr 二向色分光镜	Chroma Technology
TC-20 双通道温度控制器	npi Electronic
UPLFLN 40X 物镜	Olympus
USB 3.0 彩色相机	Imaging Source
软件
Clampex 11.1	Molecular Devices
Clampfit 11.1	Molecular Devices
IC Capture 2.4	Imaging Source
Prism 8	Graphpad