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方法文章

通过物候监测、人工授粉、荧光显微镜观察及分子基因分型建立日本李的授粉需求

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DOI：

10.3791/61897

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2020年11月9日

 ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

本文内容

摘要

本文描述了一种用于确定日本李型杂交种授粉需求的方法，该方法结合了田间和实验室授粉，通过荧光显微镜观察花粉管，并利用PCR鉴定S-基因型，同时监测开花情况以筛选授粉品种。

摘要

常见的日本李栽培品种是由原产的Prunus salicina与其他Prunus物种杂交获得的种间杂种。大多数杂种表现出配子体型自交不亲和性，该特性由一个单一位点、高度多态性的S-位点控制，该位点包含多个等位基因。大多数栽培杂种具有自交不亲和性，需要来自亲和授粉品种的花粉来完成其花朵的受精。由于大量新品种的授粉需求尚未明确，确定日本李的授粉要求正变得日益重要。本文描述了一种用于确定日本李类型杂种授粉需求的方法体系。通过在田间和实验室条件下进行人工授粉，随后利用荧光显微镜观察花粉管伸长情况，并结合田间果实成熟情况的监测，来判定其自交（不）亲和性。通过结合PCR分析鉴定S-基因型以及田间开花期的观测，评估授粉品种的选择。了解品种的授粉需求有助于在新建果园时合理选配品种，并可在已有果园中及早发现因授粉不足导致的产量问题。

引言

日本李（Prunus salicina 林德（Lindl.）原产于中国1. 在19th 20世纪，该作物从日本引入美国，在美国与其它北美二倍体李子进行了杂交2. 在20th 世纪，其中一些杂交种被传播到世界各地的温带地区。如今，“日本李”这一术语指的是由原始种间杂交产生的一系列种间杂交种 P. salicina 包含另外多达15个二倍体 李属 种（spp.）3,4,5.

梅（日本李）与其他蔷薇科（Rosaceae）物种一样，表现出配子体型自交不亲和性（GSI），该特性由一个单一位点、高度多态的 S-位点控制，该位点包含多个等位基因6。该 S-位点包含两个基因，分别编码在雌蕊中表达的核糖核酸酶（S-RNase）和在花粉粒中表达的F-box蛋白（SFB）7。在自交不亲和反应中，当花粉粒（单倍体）所表达的 S-等位基因与雌蕊（二倍体）所表达的两个等位基因之一相同时，花粉管在花柱中的生长会受到抑制，原因是 S-RNase 作用导致花粉管RNA降解8。由于这一过程阻止了胚珠中雌配子体的受精，GSI促进了不同品种间的异花授粉。

尽管一些日本李子品种是自交亲和的，但目前种植的大多数品种为自交不亲和，需要来自相互亲和的授粉品种的花粉来完成授粉受精3在核果类植物的李属中 李属 例如杏仁9，杏10,11,12 和甜樱桃13，可通过不同方法确定品种的授粉需求。自交（不）亲和性可通过田间花朵的自花授粉并随后监测坐果情况来确定，或在实验室受控条件下进行半体外自花授粉，并在显微镜下观察花粉管生长情况14,15,16,17,18通过在田间或实验室中利用潜在授粉品种的花粉进行异花授粉，并结合对不亲和性关系的鉴定，可确定品种间的不亲和性关系。 S通过PCR分析鉴定各栽培品种的等位基因14,15,16,19,20,21,22在甜樱桃或杏等物种中，也可通过鉴定特定的 S 与自交亲和性相关的等位基因，如 S4’ 在甜樱桃中13 或 Sf 在杏仁中23.

主要生产国的多个李子育种项目已推出大量新品种2,14，其中许多品种的授粉需求尚不明确。本研究描述了一种用于确定日本李类型杂交种授粉需求的方法。通过在田间和实验室条件下进行自花授粉，并结合荧光显微镜下对花粉管生长的观察，来判定其自交（不）亲和性。授粉品种的选择则结合了通过PCR分析鉴定S-基因型与田间开花期监测的结果。

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方案

1. 田间人工授粉

  1. 花粉提取
    1. 为获得花粉，需在D期采集花蕾24，依据BBCH标度的57期25,26.
      注意：日本李所需的花芽数量比其他植物更多 李属 因为它们的花药产生的花粉较少。
    2. 使用塑料网筛（孔径2 mm × 2 mm）去除花药，并将其置于室温下的纸面上放置24小时，直至花药开裂。
    3. 将花粉粒通过细网筛（孔径0.26 mm × 0.26 mm）筛分，并置于带盖的10 mL玻璃管中，4 °C保存备用。
  2. 去雄花朵的授粉
    1. 当10%–20%的花朵开放时，选择并标记若干枝条。去除已开放的花朵和幼小花蕾，仅保留D期的花蕾24，依据BBCH标度的第57阶段25,26.
    2. 用指甲或镊子去除每个处理组800至1,000个花蕾的花瓣、花萼和雄蕊。
    3. 去雄后24小时，使用细小的画笔对雌蕊进行人工授粉。部分枝条上的一半雌蕊用同一品种的花粉授粉，另一半则用来自其他品种的相容性花粉作为对照。注意避免手指或画笔被其他品种的花粉污染。
    4. 记录每周的开花数量和发育中果实的数量，以表征不同授粉处理下的落果模式，并量化最终的坐果率。
  3. 田间补充授粉
    1. 在第一朵花开放前数天，将选定的树木用孔径0.8 mm的网罩封闭，以防止传粉昆虫进入。
    2. 当10%–20%的花朵开放时，为每种授粉处理选择并标记若干枝条，每种处理保留1,000–1,500朵花。
    3. 第二天，当花朵开放时，借助画笔将相应的花粉授到每朵花上（自花授粉使用同一品种的花粉，异花授粉对照则使用其他相容品种的花粉）。
    4. 每隔一天授粉一次，直至所有花朵开放。
    5. 记录从开花到收获期间每周的花朵和发育中果实的数量，以表征不同授粉处理下的落果模式，并量化最终的坐果率。

2. 实验室中的人工授粉

  1. 根据BBCH标度的第57阶段24，采集50–100朵处于D阶段的花25,26。
  2. 在实验室中，对每种处理（自花授粉和异花授粉）去雄30朵花。
    注意：去雄操作应小心进行，避免对雌蕊造成任何损伤。
  3. 在将每朵花的花梗基部放入湿的花艺泡沫前，需在水下对其做新鲜切口（每种授粉处理使用一块独立的泡沫）。
  4. 24小时后，使用之前收集的花粉（见第1.1节），用细小的画笔对每个雌蕊进行人工授粉。一组雌蕊用同一品种的花粉授粉，另一组则用兼容品种的花粉作为对照。
  5. 授粉后将授粉的雌蕊在室温下放置72小时。花艺泡沫应持续保持湿润。
  6. 在4 °C条件下，用乙醇/乙酸（3:1）固定液固定雌蕊至少24小时。随后将固定液更换为75%乙醇。样品可在此溶液中于4 °C保存至使用前27。
    注意：确保样品完全浸没在溶液中。

3. 显微观察

  1. 体外花粉萌发评价
    1. 配制花粉萌发培养基：将25 g蔗糖溶解于250 mL蒸馏水中，然后加入0.075 g硝酸钙[Ca(NO3)2]和0.075 g硼酸（H3BO3）。
    2. 向溶液中加入2 g琼脂，搅拌至完全溶解28。
    3. 将培养基在120 °C下高压灭菌20 min。冷却培养基，在凝固前于无菌超净工作台中将每份3 mL分装至无菌培养皿（55 mm × 12 mm）中。培养基凝固后，用铝箔包裹培养皿，于4 °C保存备用。
    4. 将先前在人工控制授粉中作为花粉供体的各品种花粉分别接种于两个培养皿中，于25 °C培养24 h。
      注意：接种后的培养基可立即进行显微观察，或保存于-20 °C备用。若需冷冻保存，应在显微观察前24 h将培养皿从冷冻箱转移至冰箱中解冻。
    5. 为观察花粉粒，配制1%（v/v）的苯胺蓝溶液用于胼胝质染色。首先，将7.97 g三碱基磷酸钾（K3PO4）溶于1,000 mL蒸馏水中，配制0.1 N的K3PO4溶液。再将1 mL苯胺蓝溶于100 mL 0.1 N K3PO4溶液中，配制成1%（v/v）苯胺蓝溶液。
    6. 向每个培养皿中加入2–3滴苯胺蓝溶液，染色5 min后，在紫外落射荧光显微镜下使用激发滤光片BP340-390和阻断滤光片LP425进行观察。对每个品种的两个培养皿，每皿选取三个视野，每个视野计数100–200个花粉粒，统计可育与不可育花粉粒数量。
  2. 花粉管生长观察
    1. 用蒸馏水冲洗固定后的雌蕊三次，每次1 h，共3 h，然后转移至4 °C、5%（w/v）的亚硫酸钠（Na2SO3）溶液中浸泡24 h。该溶液的配制方法为：将5 g亚硫酸钠溶于100 mL蒸馏水中。
    2. 在5%（w/v）亚硫酸钠溶液中，将雌蕊于120 °C高压灭菌8 min，以软化组织。
    3. 将软化后的雌蕊置于载玻片上的一滴1%（v/v）苯胺蓝溶液中，加盖盖玻片并轻压，使组织展开，以染色胼胝质。
    4. 在显微镜下使用紫外落射荧光，配合激发滤光片BP340-390和阻断滤光片LP425，观察花粉管在花柱中的生长情况。

4. 确定不相容关系

  1. 从叶片中提取 DNA
    1. 为提取 DNA，建议在春季于田间采集每种栽培品种的 3–4 片幼嫩叶片。
      注意：也可从成熟叶片中提取 DNA，但幼嫩叶片中的 DNA 含有的酚类化合物较少。
    2. 使用商业试剂盒提取 DNA，并按照试剂盒提供的操作说明进行（参见材料表）。
    3. 使用紫外-可见微量分光光度计在 260 nm 处测定各样本 DNA 的浓度并评估其质量。将 DNA 浓度调整至 10 ng/μL。
  2. 扩增片段的 PCR 条件
    1. 标记 0.2 mL 的 PCR 管及管盖。
    2. 根据表 1准备 PCR 试剂，并将其置于冰上融化。
    3. 根据反应数再额外增加 10% 的量，在 1.5 mL 微量离心管中配制每对引物的主混合液（master mix），每反应体积为 16 μL。按照表 1中的顺序加入试剂，并充分混匀。
    4. 将 16 μL 主混合液分装至各 0.2 mL PCR 管中，每管中已含有 4 μL DNA 模板或 4 μL 灭菌去离子水作为阴性对照（C-）。使用已知基因型的栽培品种 DNA 作为阳性对照。轻轻混匀后盖紧管盖，于 2,000 x g 离心 30 秒，使全部液体沉降至反应管底部。
    5. 将反应管放入热循环仪中，设置以下温度程序进行 PCR 扩增：94 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 分钟、56 °C 退火 1 分钟、72 °C 延伸 3 分钟；最后 72 °C 延伸 7 分钟20。
  3. 电泳及片段大小估算
    1. 制备 1.7%（w/v）琼脂糖微型凝胶：将 0.68 g 琼脂糖和 40 mL 1x TBE 缓冲液加入 100 mL 锥形瓶中，使用微波炉以 600 W 功率、每 30 秒间隔加热，直至完全溶解，避免剧烈沸腾。
    2. 将溶液置于实验台上冷却，随后加入 3.5 μL 核酸染色液。
    3. 将凝胶托盘放入制胶架中，并插入选定的梳子。确保有足够的加样孔用于加载所有 PCR 产物和 DNA 标准分子量标记。
    4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，静置冷却至完全凝固。移除梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，并加入足量 1x TBE 缓冲液，使液面刚好覆盖凝胶表面。
    5. 在第一孔和最后一孔中各加入 2 μL DNA 分子量标准（1 kb DNA Ladder），其余孔中每孔加入 3 μL PCR 扩增产物。关闭电泳装置，接通电源，以 100 V 恒压电泳 30 分钟。
    6. 使用凝胶成像系统在紫外光下观察凝胶结果。利用 DNA 分子量标准判断扩增片段的大小，并与阳性对照比较，以确定对应的等位基因。

5. 监测开花日期

  1. 在不同年份监测各品种不同植株在开花期间的物候特征。根据最初（约5%）到最晚（约95%）开放的花朵确定开花期的持续时间。根据BBCH标度第65阶段25,26，当至少50%的花朵处于F阶段24时，视为盛花期。
  2. 为比较可相互授粉品种的开花日期并确定每年开花时间重叠的品种，利用多年数据编制开花时间日历。

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结果

每个日本李子花芽包含一个由1–3朵花组成的花序。与其他核果类植物一样，每朵花由四个花部轮生结构组成：雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片，这些结构在基部融合形成杯状结构。花的结构比其他核果类植物更小，具有短而脆弱的雌蕊，周围环绕着含有少量花粉粒的雄蕊。在开花前，每朵花序的花在短花梗上彼此分离，白色花瓣展开呈气球状，外围被绿色萼片包围（花期D阶段，57 BBCH）（图1A）。开花时花朵完全开放，露出花药和雌蕊（花期F阶段，65 BBCH）（图2A）。与其他温带Prunus spp.类似，花芽先开放，叶芽则在数天后萌发。这使得开花的树木显得极为壮观，满树繁花而无叶片。

日本李的人工授粉需要在花开放前的气球期采集花朵（图1A），此时雌蕊和雄蕊几乎发育成熟，但花药尚未开裂。此阶段可防止携带外来花粉的昆虫进入，因为花瓣仍处于闭合状态。尽管其花朵数量远高于其他Prunus物种，但其中大多数（85...

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讨论

本文所述的日本李栽培品种授粉需求研究方法，需通过田间或实验室控制授粉来确定各栽培品种的自交（不）亲和性，并利用荧光显微镜观察花粉管的生长情况。通过分子基因分型对S-等位基因进行表征，从而建立不亲和性关系。最后，通过监测物候期，筛选每年开花期相吻合的栽培品种，以完成授粉品种的选择。

由于新培育的日本李类型品种数量众多，且大多数品种的授粉需求未知并表现为自交不亲和性，因此明确这些新品种的授粉需求正变得愈发重要3。本文所述的方法结合了物候期监测、人工控制授粉、荧光显微镜观察以及分子基因分型技术，已被证实可用于有效确定品种的授粉需求14。

日本李的杂交种具有一些特殊性，这使得无法像其他Prunus物种那样采用单一方法来确定其授粉需求。首先，其花朵较小且更为脆弱3。花粉的提取与处理方法与其他Prunus spp.

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由西班牙国家农业与食品技术研究所（Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria，项目编号：RFP2015-00015-00 和 RTA2017-00003-00）、阿拉贡自治区政府—欧洲社会基金、欧盟（Grupo Consolidado A12-17R）、埃斯特雷马杜拉自治区政府—欧洲区域发展基金（FEDER）、地区研究计划（IB16181）以及研究小组项目（AGA001，GR18196）资助。B.I. Guerrero 获得墨西哥国家科学技术理事会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México，CONACYT，编号 471839）奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰乙酸Panreac131008.1611
琼脂iNtRON Biotechnology25999
苯胺蓝Difco8504-88
硼酸 (H3BO4)Panreac131015.1210
四水合硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O)Panreac131231.1211
盖玻片DeltalabD10246024 mm x 60 mm
数码相机Imaging Developmet SystemsUI-1490SE
数码相机软件套件Imaging Developmet Systems4.93.0.
DNA 寡核苷酸ThermoFisher Scientific
dNTP 混合液，每种 10 mMThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA 聚合酶ThermoFisher ScientificEP0713
96°乙醇VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA 标准分子量标记（美国专利号 4.403.036）(500bp-12Kb)Invitrogen15615-016大小：250µg；浓度：1.0 µg/µl
凝胶成像系统Bio-Rad1708195
手动计数器TamacoTM-4
Image Lab 软件Bio-Rad凝胶成像系统的图像分析系统
MetaPhor 琼脂糖Lonza50180
5415 R 微型离心机EppendorfZ605212
带紫外落射荧光的显微镜LeicaDM2500激发滤光片 BP340-390，阻断滤光片 LP425
载玻片DeltalabD10000426 mm x 76 mm
小型电泳系统Fisherbrand14955170
微型离心机ThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 分光光度计ThermoFisher ScientificND1000
培养皿Deltalab20020155 mm x 14 mm
磷酸三钾 (K3PO4·1.5H2O)Panreac141513
正向引物 'Pru C2'ThermoFisher Scientific
正向引物 Pru T2'ThermoFisher Scientific
反向引物 'PCER'ThermoFisher Scientific
RedSafe 核酸染色液iNtRON Biotechnology21141
蔗糖Panreac131621.1211
无水亚硫酸钠 (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools 植物DNA提取试剂盒Biotools21272
TBE 缓冲液 (10X)PanreacA0972,5000PE
Thermal Cycler T100Bio-Rad1861096
Thermomixer comfortEppendorfT1317
垂直高压灭菌器 Presoclave IIJP Selecta4001725
涡旋振荡器Fisherbrand11746744

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