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方法文章

十二指肠微生物组的样本采集与分析

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DOI：

10.3791/61900

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2021年1月12日

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1Division of Gastroenterology, Hepatology and Parenteral Nutrition, Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 2The Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, 3UCLA Microbiome Center, David Geffen School of Medicine at University of California, 4Department of Surgery, University of California, Los Angeles, 5Department of Medicine and Human Genetics, David Geffen School of Medicine at University of California, 6Cedars-Sinai Cancer and Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

本文内容

摘要

在本文中，我们介绍一种采样和分析十二指肠微生物组的新方法。该方法能够准确描绘十二指肠中微生物的多样性和组成，可为十二指肠微生物组的进一步研究提供帮助。

摘要

微生物组的变化已与人类及小鼠模型中多个器官系统的生理和病理生理过程相关联。肠道微生物组通常通过粪便样本采集进行研究。由于粪便样本易于获取，已有大量研究揭示了远端管腔消化道的相关信息。然而，关于近端肠道微生物组重要性的研究仍较少。鉴于十二指肠是消化和吸收的主要部位，其微生物组与营养及肝病密切相关，值得进一步深入研究。本文详细介绍了一种新颖的方法，用于在人类受试者接受上消化道内镜检查时，通过获取十二指肠抽吸液和活检组织来采样近端管腔及黏膜肠道微生物组。样本采集简便，且不受患者准备依从性等干扰因素的影响，而这类问题可能在结肠镜检查获取结肠样本时出现。初步结果显示，管腔和黏膜微生物组存在显著差异，这可能与局部环境条件和屏障功能有关。因此，联合使用十二指肠抽吸液和活检组织能够更全面地反映十二指肠微生物组的特征。活检组织取自十二指肠的降部和水平部，这些解剖位置邻近肝脏和胆道系统，在研究胆汁酸生物学及肠-肝轴在肝病中的作用方面具有重要意义。所获取的活检组织和抽吸液可用于16S核糖体RNA测序、代谢组学及其他类似应用。

引言

近年来，肠道微生物组已成为备受关注的研究领域。目前人们认识到，肠道内复杂的细菌群落会因遗传、饮食、药物和环境因素等多种条件而存在差异1。研究还发现，不同的胃肠道疾病（如肥胖、炎症性肠病和肝病）均具有特征性的微生物群特征2,3。大多数研究主要通过分析粪便和远端黏膜样本，来描绘大肠微生物组的组成4。尽管肠道细菌浓度最高的区域是结肠（1012 个细菌/克），但在十二指肠（103/克）、空肠（104/克）和回肠（107/克）中也存在结构复杂的微生物群落，这些微生物在消化代谢和营养吸收过程中发挥着关键作用5。

小肠是胃肠道中营养物质分解和吸收的主要场所。定植于小肠内壁的共生细菌在促进食物底物的化学分解以及释放有助于营养吸收的生物活性化合物方面发挥着基础性作用6。这些相互作用共同构成了小肠内复杂的微生物-微生物以及宿主-微生物活动环境7。一项针对小鼠模型中小肠微生物群的研究发现，无菌小鼠在摄入高脂饮食后脂质吸收能力受损，但当其定植空肠微生物群后，脂质吸收显著增加6。一项针对肥胖个体与健康个体十二指肠微生物群的人体小规模研究发现，肥胖个体的十二指肠微生物群在脂肪酸和蔗糖分解通路方面存在改变，这种改变可能与饮食因素相关8。此外，小肠微生物群的失调已在多种疾病中被发现，包括小肠细菌过度生长、短肠综合征、贮袋炎、环境性肠功能障碍以及肠易激综合征7。

我们关注微生物组与慢性肝病不同阶段之间的关系。具体而言，十二指肠是小肠中进行化学分解和营养吸收的起始部位。此外，门静脉肝循环将营养物质和代谢产物输送至肝脏，在肝脏中经过加工和调控后进入血液循环。肠道与肝脏在解剖结构上的邻近关系，形成了一个易于产生促炎反应的环境，这种反应可能由肠道屏障功能障碍或肠道微生物组的改变所引发9。研究肠道微生物组与肝病进展的相关研究表明，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、脂肪性肝炎（NASH）、酒精性肝病以及肝硬化患者中均存在微生物组失衡现象10,11。尽管大多数研究集中于结肠微生物组的特征分析，但我们关注的是小肠微生物组与肝病之间的关联。通过采用本文所介绍的新方法，我们已鉴定出肝硬化患者十二指肠微生物谱的特异性，并揭示了其与饮食之间的关系12。

随着对小肠微生物组的研究日益受到关注，建立能够准确代表小肠菌群的标准化取样技术变得十分必要。然而，样本采集过程中存在诸多挑战，使小肠微生物组环境的研究变得复杂。目前的取样方法通常需要侵入性操作，且容易受到污染，正如Kastl等人7所指出的那样。本文详细介绍了一种新颖的方法，用于从接受食管胃十二指肠镜检查的肝病患者中获取十二指肠抽吸液和活检组织，以进行微生物分析。

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方案

十二指肠样本来自退伍军人事务大洛杉矶医疗系统、西达斯-西奈医学中心和罗纳德·里根加州大学洛杉矶分校医学中心，在当地伦理审查委员会的机构审查委员会批准微生物组、微生物标志物与肝病（M3LD）研究的临床方案后采集。所有参与研究的患者均签署了书面知情同意书。

1. 受试者知情同意

  1. 招募因任何病因导致肝硬化并计划接受内镜检查以筛查静脉曲张或门静脉高压的受试者。排除合并肝细胞癌（HCC）的患者。
  2. 向受试者介绍研究内容，仔细确认其充分理解，并询问其是否愿意自愿参与本研究。若其同意，则完成知情同意书的签署。
  3. 确保由经过适当培训且具备资质的医疗专业人员进行内镜检查。

2. 标本采集

  1. 使用 50 mg 芬太尼和 2 mg 咪达唑仑对患者进行麻醉。根据需要增加剂量，直至患者达到中度麻醉状态并能耐受内镜操作。
  2. 将内镜（例如 Pentax EG29-i10）插入患者食管，并推进至幽门。
    注意：内镜尺寸应根据患者的生理情况选择。在采集样本前，不得使用内镜进行任何抽吸操作，以避免胃液或口咽部分泌物污染内镜通道。
  3. 准备一张显微镜载玻片和一根钝头 18 号注射针头，用于标本采集。准备一块无菌垫，用于将活检组织从载玻片转移至冻存管。
  4. 当内镜到达十二指肠第二段、位于瓦特壶腹远端时，通过上消化道内镜工作通道插入一次性无菌抽吸导管，抽吸存在的任何液体，并收集至一个 40 mL 一次性标本容器中。随后用注射器向十二指肠注入最多 30 mL 无菌水，再抽吸液体至液体标本收集装置中，共收集 15 mL 标本。
  5. 立即取下并盖紧连接在导管吸引组件上的抽吸容器，将其放入装有冰块的保温杯中，并置于标本转运袋内，送往处理实验室。
  6. 将一把 2.8 mm 一次性活检钳插入内镜侧端口，用于获取组织标本以供研究。在十二指肠第二段内进行两次随机钳取操作，每次钳取两块组织样本。
  7. 使用钝头 18 号注射针头将组织样本从活检钳中取出，置于显微镜载玻片上，然后将样本转移至四个独立的空 2 mL 冻存管中。拧紧管盖。
  8. 将四个拧紧盖子的冻存管放入一个空容器（如尿杯）中，并制备由 20 mL 乙醇和干冰组成的冷冻浴，对活检组织进行速冻。
  9. 将活检冻存管置于铺有干冰的绝缘泡沫塑料容器中，转移至 -80 °C 超低温冰箱进行长期保存，以维持标本完整性。

3. 胸腔积液处理

  1. 采集生物样本后，立即将样本转移至BSL2或更高级别的实验室进行处理。
  2. 轻轻翻转吸引液容器4次，然后将约1.5 mL液体分装至2 mL冻存管中。
  3. 将样本储存于-80 °C，直至可进行批量分析。

4. 问卷调查的实施与临床数据的收集

  1. 请参与者填写问卷，以收集有关饮食、人口统计学特征、吸烟/饮酒习惯、健康状况/用药情况以及生活质量的信息13。
  2. 查阅病历资料，获取临床数据，包括临床检验、影像学资料、用药情况及医学并发症。

5. DNA 提取

  1. 从-80 °C保存条件下取出十二指肠活检样本和抽吸物后，立即进行DNA提取。提取十二指肠活检样本中的DNA无需任何预处理步骤。
  2. 在同一天内完成所有样本的DNA提取与测序，以降低分析中批次效应的风险。在样本测序前，需建立针对所收集样本的特异性文库。
  3. 按照制造商说明书14，使用DNA微量提取试剂盒从十二指肠活检样本中提取DNA。
  4. 根据说明书建议的最大样本量，将样本加入含有750 µL裂解液和0.7 mL干体积2 mm玻璃珠的裂解管中。
  5. 将裂解管固定在配备管架的珠磨机中，以最大速度运行至少五分钟。具体时间根据所用珠磨机型号及待分析样本而定。
  6. 在微量离心机中以10,000 x g离心裂解管1分钟。
  7. 将最多400 µL上清液转移至带滤膜的收集管中，再次以8000 x g离心1分钟。
  8. 向微量离心管中的滤液加入1200 µL结合缓冲液，并充分混匀至均一状态。
  9. 将800 µL混合液转移至离心柱与收集管组件中，以10,000 x g离心1分钟，弃去穿流液。
  10. 将离心柱置于新的离心管上，加入400 µL DNA洗涤缓冲液，并充分混匀至均一状态，以10,000 x g离心1分钟，弃去穿流液。
  11. 重复步骤5.10两次，每次分别使用700 µL和200 µL DNA洗涤缓冲液进行洗涤。
  12. 在新的离心管中，向离心柱内加入20 µL洗脱缓冲液，孵育1分钟后，以10,000 x g离心1分钟以洗脱DNA，随后弃去离心柱。
  13. 再次过滤DNA。此时DNA已可用于PCR扩增。

6. DNA 扩增

  1. 使用 MiSeq、HiSeq 或 NovaSeq 测序仪对 16S 核糖体 RNA 基因的 V4 区域进行 250 × 2 双端测序的 PCR 扩增15。
  2. 制备一个 96 孔板引物板。配制主混合液：将 165 μL 的 ILHS_515f 保守正向引物（100 mM 储液）与 2970 μL 分子生物学级水混合。向每个孔中加入 28.5 μL 该混合液。
  3. 从含有条形码的 IL_806r 特异性引物（100 μM 储液）的 96 孔板中，向对应孔加入 1.5 μL 的相应反向引物。这些条形码将用于识别不同的患者样本。
  4. 配制主混合液：水（23.1 μL × 3.3 × 样本数）、PCR 缓冲液（3 μL × 3.3 × 样本数）、dNTPs（0.6 μL × 3.3 × 样本数）和 JumpStart Taq DNA 聚合酶（0.3 μL × 3.3 × 样本数）。
    注意：16S DNA 扩增应设三个重复。
  5. 向第一个 96 孔板的每个孔中加入 81 μL 主混合液。向每个孔中加入 6 μL DNA 和 3 mL 引物混合液。使用 P200 多通道移液器混匀各孔，然后将 30 μL 混合液转移至另外两个 PCR 板中对应的孔内。密封反应板。
  6. 使用以下热循环仪程序：94 °C 预变性 3 分钟；进行 35 个循环：94 °C 变性 45 秒，50 °C 退火 1 分钟，72 °C 延伸 1.5 分钟；循环结束后，72 °C 延伸 10 分钟，94 °C 保持 5 分钟，4 °C 保存至后续处理。

7. 清洁与文库构建

  1. 使用 PCR 或 DNA 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。用 30 μL 的 PCR 级（DEPC 处理）水洗脱 DNA。
  2. 使用具有定量 PCR 样本能力的紫外-可见光分光光度计。
  3. 在计算机桌面上打开分光光度计软件，点击 Nucleic Acid。
  4. 用蒸馏水擦拭检测口。向检测口加入 1 μL 的 1× PCR 缓冲液/水并进行校准。
  5. 输入样本编号，并用移液器将 1 μL 样本加入检测口。
  6. 关闭检测口并点击 Measure。
    注意：向检测口加样时应避免产生气泡。
  7. 用实验室擦拭纸和蒸馏水擦去样本，然后准备下一个样本。每个样本均需记录数值，计算机也应自动保存数据。
  8. 将每种扩增后的 PCR 产物各 250 ng 混合至同一管中，即为 DNA 文库。
  9. 将文库连同 Read 1 和 Read 2 以及索引测序引物一并送至测序实验室进行测序。
    注意：若本地无可用实验室，可使用商业测序服务完成此步骤。

8. 数据格式化

  1. 测序数据以正向和反向的 .fastq 文件形式提供结果。将这些数据转换为数据表并进行清洗，以便后续分析应用。
  2. 打开 R 编程软件。按照补充代码文件中列出的说明和代码，执行 DADA2 分析流程，对 DNA 测序数据进行清洗16。在序列通过分析流程后，下载 SILVA 参考数据库用于分类学注释17。
  3. 简要步骤：在 R 中加载 DADA2 软件包。定义一个路径，将所有 .fastq 文件保存在同一目录下，并将这些文件导入 R。
  4. 读取 fastq 文件的名称，并匹配正向和反向 fastq 文件的列表。
  5. 检查正向读段和反向读段的质量。
    注意：可根据需要截断核苷酸序列，以保留高质量序列。
  6. 对 fastq 文件进行过滤和修剪。使用 learnErrors 方法学习 DADA2 所采用的参数化错误模型。该模型将显示每种可能的核苷酸替换（A → C、A → T、A → G 等）的观测错误率与预期错误率。
  7. 应用样本推断算法，确定每个样本中唯一序列的数量，并进一步检查 dada-class 对象，以获得每个样本中真实唯一变异体的数量。
  8. 合并正向和反向读段，获得完整且去噪后的序列。
  9. 构建扩增子序列变异体（ASV）表。
  10. 从 ASV 表中去除嵌合序列。嵌合序列是由两个更丰富的亲本序列组合而成的单一序列。
  11. 追踪通过分析流程的总读段数量。DADA2 将使用 SILVA 数据库为每个唯一序列分配分类学信息。可通过在 DADA2 分析流程中加入已知细菌序列组成的群落，并将 DADA2 鉴定出的序列变异体与预期群落组成进行比较，以评估分析准确性。
    注意：DNA 测序数据现已完成清洗，可根据具体研究项目的范围和目标进行后续分析。

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结果

近端肠道黏膜与管腔微生物组之间的群落差异
既往研究已发现管腔和黏膜结肠样本中微生物群落在组成上存在差异4,5,18。初步结果显示，十二指肠抽吸液和活检样本可用于检测近端肠道中管腔和黏膜微生物群。此外，我们发现这些微生物组群落彼此之间具有显著差异（图1）。另外，抽吸液中的胆汁酸与抽吸液微生物组的组成呈显著相关性（图2）。

微生物组成分析；PCA图，柱状图；十二指肠活检与抽吸样本；门、属水平。...

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讨论

微生物组研究极为重要，因为这一复杂生态系统在能量稳态、免疫应答和代谢过程中发挥着关键作用19。不同区域的微生物组存在差异，这可能反映了胃肠道不同部位独特的生理功能，并可能影响多种疾病状态20。粪便微生物组是最常被研究的对象，但近年来小肠微生物组也逐渐成为研究焦点6,21。目前亟需建立统一的操作流程，以进一步研究近端肠道微生物组及其对胃肠道健康与疾病状态的影响。

该方法可用于研究近端肠道微生物组的管腔和黏膜组分。与鼻胃管法相比，该方法具有优势，因为后者无法稳定获取幽门后样本，且存在口咽部污染的风险。同样，通过回肠造口术采集活检样本可能使样本暴露于皮肤和外部环境中7。某些人群因筛查和监测需要而需常规接受内镜检查，例如肝硬化患者或胃癌、食管癌患者22。对正在接受筛查的患者采集样本，可...

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披露

作者声明无相关财务利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助，资助编号为 RO1CA204145。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 冻存管Corning430659
96 孔板Applied Biosystems4306737
dNTPsSigmaD7295
干冰由机构提供
EG29-i10 内窥镜PentaxN/A内窥镜尺寸可能因患者生理结构而异
Epoch 微孔板分光光度计BiotekN/A
乙醇Sigma Aldrich676829
HiSeq 2500IlluminaN/A
IL_806r 反向引物IDT DNA technologiescustom定制引物
ILHS_515f 正向引物IDT DNA technologiescustom定制引物
JumpStart Taq DNASigmaD4184
黏液样本收集器Busse Hospital Disposables40540 cc 带转运盖的样本收集器
Nanodrop Gen5 软件ThermoFisher Scientific
PCR 缓冲液SigmaP2192
PCR 纯化试剂盒Zymo ResearchD4204
Radial Jaw 4 大型活检钳Boston ScientificM005133432.8 mm 钳口外径
Vioscreen 饮食问卷VioCareN/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep KitZymo ResearchD430025 µg 结合容量

参考文献

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