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粪便（微）RNA 提取

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DOI：

10.3791/61908

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2020年10月28日

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

本文内容

摘要

本方案从动物和人类受试者的粪便样本中分离高质量的总RNA。采用商业化的miRNA提取试剂盒，并进行了重要改进，以获得优化产量和质量的高纯度RNA。所提取的RNA适用于大多数下游RNA分析，如测序、微阵列和逆转录PCR（RT-PCR）。

摘要

越来越多的研究表明，RNA存在于动物和人类的肠道腔内及粪便中。以下所述的实验方案旨在从动物和人类受试者的粪便样本中分离总RNA，包括微小RNA（microRNA）。其目标是获得高纯度和高产量的总RNA，以用于后续分析，如RNA测序、逆转录PCR（RT-PCR）和微阵列分析。该优化方案在miRNA分离方面的优势包括：通过增加文中所述的洗涤步骤，能够获得高度纯化的RNA产物；通过改进样本重悬方法，提高了RNA的得率；并提供了重要的去污染操作建议。该方法的一个局限性在于无法处理和纯化超过200 mg的大样本量，因为此类样本尺寸会导致难以清晰形成中间相。因此，大样本可能使有机物质污染待提取的水相，从而影响最终分离RNA的质量。然而，从不超过200 mg的样本中提取的RNA足以满足大多数下游分析的需求。

引言

细胞外RNA正逐渐被认识到是介导多种生物学过程的重要因子1。粪便中的细胞外RNA最早于2008年被报道，可作为结肠癌和活动性溃疡性结肠炎的标志物2，近期研究进一步揭示其为肠道腔内及粪便中的正常组分，并参与宿主与微生物之间的通讯3,4,5。本RNA提取方案旨在从动物和人类受试者采集的粪便样本中提取高质量的细胞外RNA。该方案改编自一种商用miRNA提取试剂盒，所获得的RNA可用于RNA测序、逆转录PCR（RT-PCR）和微阵列等下游分析。本方案包含多个关键且实用的操作建议，以最大限度地提高从人和动物粪便中获取RNA的数量与质量。开发并优化该RNA（包括microRNA）提取方法的目的在于减少粪便中微生物RNA的干扰，控制研究中的变量，从而在排除各种混杂因素和污染源的情况下分析肠道内的RNA组成。值得注意的是，该RNA提取方法可最大程度地避免活细胞和活微生物（即细胞内RNA）释放RNA，主要针对由肠道细胞释放或通过食物摄入获得的细胞外RNA。因此，该方法原则上不适用于以研究微生物转录组为目的的研究。

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方案

本文所述涉及实验动物的所有方法均已获得哈佛医学院布里格姆妇女医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

本文所述所有涉及人类研究对象的方法均符合合作伙伴人类研究委员会制定的指南。

1. 粪便样本采集

  1. 为实验中的每个动物受试者准备一个经过高压灭菌或无菌且无核酸酶的 2 mL 带螺口盖的微量离心管。
    1. 对于人类受试者，为每位受试者提供一个合适、无核酸酶且无菌的粪便样本采集装置。
  2. 在无菌环境中，从每个动物受试者收集 25–100 mg（小鼠粪便样本约为 1–4 粒粪便颗粒）的粪便样本。
    注意：建议使用两粒或更多粪便颗粒（约 50 mg 或更重），以获得纯度最高的 RNA。
    1. 使用所有必要的个人防护装备（PPE）和材料，例如：一副实验手套、消毒喷雾剂和无菌纸巾，对放置动物实验受试者的操作区域进行消毒，以避免粪便样本污染。
      1. 对于人类受试者，指导每位研究受试者/采集者在尽可能无菌的环境中收集 100–200 mg 的粪便样本。采用标准无菌操作，避免粪便样本受到污染。
  3. 将每个动物受试者的粪便样本直接收集到 2 mL 带螺口盖的微量离心管中，避免接触其他任何表面，以防污染。
    1. 对于人类受试者，指导每位受试者直接将粪便排入所提供的合适采集装置中（例如：无菌粪便样本采集套件），以避免污染。
      注意：应指导受试者避免粪便样本接触马桶表面、水、尿液或任何其他非无菌表面/物体。
  4. 将收集在 2 mL 带螺口盖微量离心管中的粪便样本立即在 -80 °C 冻存，或置于干冰桶中，以在后续粪便重悬步骤前获得更佳数量和质量的 RNA。
    1. 对于人类粪便样本，将每份新鲜样本取 200 mg 分装至带螺口盖的 2 mL 微量离心管中，并在如下所述的粪便重悬步骤前于 -80 °C 冻存。
      1. 对于未使用带螺口盖 2 mL 微量离心管储存的粪便样本，在如下所述的粪便重悬步骤前，称重并分别将 100–200 mg 的冷冻样本转移至独立的带螺口盖 2 mL 微量离心管中。
        注意：对于人类粪便样本，避免取用超过 200 mg 的样本用于 RNA 提取，否则可能导致后续步骤出现困难。若 2 mL 微量离心管中样本过载，水相、有机相和中间相可能无法清晰形成并分离。此步骤可暂停。

2. 洗涤液的配制

  1. 向miRNA提取试剂盒中提供的洗涤液1加入21 mL分析纯级100%乙醇 （见材料表） ，使总体积达到瓶上所示的30 mL。涡旋振荡直至瓶中所有成分完全溶解。
  2. 向提供的洗涤液2/3中加入40 mL分析纯级100%乙醇，使总体积达到瓶上所示的50 mL。涡旋振荡5秒或直至混合均匀。

3. 仪器与材料的准备

  1. 使用核糖核酸酶（RNase）去污染溶液（例如市售的RNase去污染溶液）喷洒工作区域和设备，例如：实验台、化学通风橱内的操作区域以及微型离心管架。为避免污染，可在任何需要的表面和时间使用RNase去污染溶液进行处理。
  2. 穿戴洁净的实验服，佩戴面部口罩，并戴上合适的手套，以防止人体皮肤上的核酸酶污染粪便样本中的RNA。用手持的RNase去污染溶液喷洒手套，并频繁更换手套以避免污染。
  3. 准备一个盛有干冰的容器，用于存放原本保存在-80 °C的粪便样本，以防止在粪便重悬前发生融化；另准备一个盛有冰块的容器，用于放置如酸性酚:氯仿等试剂，以延长其使用寿命。
    注意：确保包括本方案中所用培养基在内的所有材料均无菌，且无核酸酶污染。

4. 粪便重悬

  1. 将25–100 mg的粪便样本重悬于600 µL无菌的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）中。
    注意：粪便样本从–80 °C解冻时应立即处理，避免部分解冻，以尽量减少RNase和细胞RNA的释放，因为样本中的细胞在解冻过程中冰晶会破坏细胞内外的结构。
    1. 在含有粪便样本的2 mL带螺口盖的微量离心管中，加入600 µL的1× DPBS，并置于室温（RT）下。
    2. 将粪便样本与600 µL 1× DPBS的混合物在带盖的2 mL微量离心管中于室温孵育30分钟。
    3. 用1 mL移液器吸头充分研磨混合物，并在盖紧的2 mL微量离心管中涡旋振荡。为优化并提高RNA的产量和质量，可使用均质器以S4000（或4000 rpm）设置进行一次循环、持续45秒的处理来重悬混合物。

5. 有机萃取

警告：由于酸-酚：氯仿和分析纯级100%乙醇具有毒性和易燃性，在使用这些试剂的步骤中（直至第6步），必须在有害化学品通风橱中操作。处理危险物质时，应根据需要更换个人防护装备，并遵循适当的标准防护措施。

  1. 使用 600 µL 酸性酚:氯仿提取 RNA（酸性酚:氯仿的体积等于步骤 4.1 中加入的 1× DPBS 初始体积）。
    1. 向步骤 4.1 的悬液中加入 600 μL 酸性酚:氯仿。
      注意：从瓶中吸取酸性酚:氯仿时应取下层相，因为上层相混有缓冲液。若两相之间的界面受到扰动，请等待界面重新形成后再吸取酸性酚:氯仿，以避免污染。
  2. 涡旋混合 60 秒，确保充分混匀。或者，为优化并提高 RNA 产量，可使用匀浆器以 S4000 档位运行一个循环，持续 45 秒进行混合。
  3. 在室温下以 10,000 × g 离心 15 分钟，使用微量离心机分离水相和有机相。离心后，两相之间的界面应紧密清晰。若未达到该状态，请重复离心。
    注意：若经过多次重复离心后，界面仍无法达到理想紧密状态，可能由于初始体积与所加酸性酚:氯仿体积的比例不均所致，此时应更加小心地回收水相，避免污染。
  4. 回收水相，并将其转移至一个新的 2 mL 带铰链盖的微量离心管中（miRNA 提取试剂盒不提供此管）。
    1. 小心移取水相（即上层相），避免扰动下层相，并将其转移至一个新的 2 mL 带铰链盖的微量离心管中。记录所转移的体积（例如，约 500 µL）。
      注意：当界面紧密且上层相清晰分离时，水相表面可能仍有少量微小残余颗粒漂浮。请小心移液，避免接触这些残留物，仅回收外观清晰、明显分离的水相，以确保获得高质量的 RNA 产物，即使所获水相体积较小。

6. 最终RNA提取

  1. 向2 mL微量离心管中的水相中加入1.25倍体积的RT ACS级100%乙醇（例如，若从步骤5.4中回收了500 μL水相，则加入625 μL的100%乙醇）。涡旋混匀3秒。
  2. 将水相/乙醇混合液通过miRNA提取试剂盒中提供的滤芯进行加载。
    1. 对于每个样品，将滤芯放入试剂盒提供的收集管中。
      1. 用移液器吸取600 µL水相/乙醇混合液加入滤芯中。
        注意：在移液前需短暂涡旋混合液，以确保乙醇与水相充分混匀。每次加载的水相/乙醇混合液体积不得超过700 µL。
    2. 在10,000 x g条件下离心90秒，使混合液通过滤膜过滤。过高的转速可能会损坏滤膜。
    3. 弃去滤过液，并重复步骤6.2.1至6.2.2，直至全部混合液通过同一滤膜完成过滤。后续洗涤步骤中继续使用并保留同一收集管。
    4. 用700 µL miRNA洗涤液1洗涤滤膜。
      警告：miRNA洗涤液1含有硫氰酸胍，可能引起皮肤刺激和严重眼损伤。请佩戴必要的个人防护装备，例如手套、面罩和防护实验服。根据需要频繁更换手套。
      1. 将用ACS级100%乙醇配制的工作液700 µL加入滤芯中。
      2. 离心60秒，使miRNA洗涤液1通过滤芯过滤。
      3. 弃去收集管中的滤过液，并将同一滤芯放回同一收集管中。
    5. 依次使用700 µL、500 µL和250 µL的洗涤液2/3各洗涤滤膜一次。
      1. 向滤芯中加入700 µL洗涤液2/3（用ACS级100%乙醇配制的工作液）。
        1. 在10,000 x g条件下离心1分钟。
        2. 弃去收集管中的滤过液，并将同一滤芯放回同一收集管中。
      2. 向滤芯中加入500 µL洗涤液2/3。
        1. 在10,000 x g条件下离心1分钟。
        2. 弃去收集管中的滤过液，并将同一滤芯放回同一收集管中。
      3. 向滤芯中加入250 µL洗涤液2/3。
        1. 在10,000 x g条件下离心1分钟。
        2. 弃去收集管中的滤过液。
      4. 将滤芯转移至新的收集管中，离心5分钟以去除滤膜中残留的液体。

7. 用 50 µL 无核酸酶水洗脱 RNA

  1. 将滤芯转移至新的收集管中。用移液器将 50 µL 无核酸酶水加入滤膜中央，并盖上收集管盖。
    1. 室温孵育 10 分钟。
    2. 在 8,000 × g 条件下离心 5 分钟，以回收 RNA 至新的收集管中。
    3. 使用荧光计测定所回收粪便 RNA 的浓度和纯度。回收的粪便 RNA 可在 -80 ˚C 下保存。

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结果

分别从50 mg小鼠粪便样本（2粒小鼠粪便颗粒）和100 mg人粪便标本中提取代表性RNA，并溶于50 µL无核酸酶水中。分光光度计分析显示，提取的RNA总量分别为49 µg和16 µg（表1）。RNA纯度较高，A260/A280比值约为2.0，A260/A230比值约为1.8（表1）。如文献报道3，粪便中的大部分RNA为microRNA，且这些microRNA可存在于外泌体中。与此一致，基于芯片的RNA电泳分析表明，从小鼠和人粪便中提取的代表性RNA几乎不含或缺乏18S和28S rRNA组分，且RNA片段大小位于小RNA区域（图1A）。进一步采用芯片电泳对小RNA进行分析，结果显示大部分RNA片段大小符合microRNA特征（图1B）。这与此前观察结果一致，即使用小RNA生物分析仪进行定量所获得的结果与先前检测方法的结果相当6。

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讨论

在分离过程中，必须采用无RNase的操作技术，以防止RNase污染7。离心后形成致密的中间相时，关键是要在回收水相时避免接触中间相、下层相以及漂浮在水相顶部的颗粒状污染物。此外，增加两步洗涤步骤，分别使用500 µL和250 µL的洗涤液2/3，以去除滤膜中的杂质，从而优化RNA纯度。另外，起始样品量不建议超过200 mg，因为这可能导致中间相无法清晰形成；同样，样品量少于25 mg也不推荐，因为可能不足以提取出足够量的RNA用于下游分析。

微生物组研究的迅猛发展推动了对微生物物种、基因以及微生物群落宏转录组学的研究8。粪便中的微小RNA（microRNA）已被研究作为疾病标志物9,10,11。自首次报道粪便microRNA介导宿主-微生物相互作用以来3，...

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披露

作者声明不存在与本实验方案中所述研究方法相关的任何重要或实质性的经济利益。

致谢

我们在生物分析仪方面获得了哈佛医学院生物聚合物中心的技术支持。本研究得到了国家多发性硬化症协会研究基金（项目编号：RG-1707-28516）的资助（H.L.W. 和 S.L.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酸性酚-氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）Thermo Fischer ScientificAM9720
不含钙、镁的DPBSThermo Fischer Scientific14190-144
手套
微量离心机
mirVana miRNA 提取试剂盒Thermo Fischer ScientificAM1561
无核酸酶微量离心管（1.5 mL，2 mL）
无核酸酶水（未经DEPC处理）Thermo Fischer ScientificAM9937
移液器及带滤芯的无核酸酶吸头
PowerLyzer 24 匀浆器QIAGEN13155
RNaseZap RNase 去污染溶液Thermo Fischer ScientificAM9780
涡旋振荡器

参考文献

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028(2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857(2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
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  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70(2019).
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RNA microRNA RNA

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