粪便（微量）RNA分离

Summary

该协议从动物和人类受试者的粪便样本中分离出高质量的总RNA。商业 miRNA 分离试剂盒具有显著适应性，以优化数量和质量分离纯 RNA。RNA分离株适用于大多数下游RNA检测，如测序、微阵列和RT-PCR。

Abstract

越来越清楚的是，RNA存在于动物和人类的肠腔和粪便中。下面描述的方案从动物和人类受试者的粪便样本中分离出包括microRNA在内的总RNA。目的是分离高纯度和高数量的总RNA，用于下游分析，如RNA测序、RT-PCR和微阵列。这种优化方案在miRNA分离中的优势在于能够通过描述的额外洗涤步骤分离高度纯化的RNA产物，通过改进的样品重悬方法增加获得的RNA数量，以及重要的去污技巧。一个限制是无法处理和纯化超过200 mg的较大样品，因为这些样品量会导致界面的清晰形成困难。因此，大样品量可能会污染方案中描述的待提取水相，有机物会影响最终分离的RNA的质量。然而，从高达 200 mg 的样品中分离出的 RNA 足以用于大多数下游分析。

Introduction

细胞外RNA被认为是介导许多生物过程的重要因素¹。粪便中的细胞外RNA于2008年首次被报道为结肠癌和活动性溃疡性结肠炎²的标志物，最近发现它是肠腔和粪便的正常成分，并介导宿主 -^{微生物通讯3}，^4，5。该RNA分离方案的目的是从动物和人类受试者的粪便样品中提取高质量的细胞外RNA。该方案改编自商业miRNA分离试剂盒。采集的 RNA 用于下游分析，如 RNA 测序、RT-PCR 和微阵列。该协议包括几个重要且有用的技巧，以最大限度地提高动物和人类粪便中发现的RNA的数量和质量。开发和优化这种RNA（包括microRNA）分离方法的原因是减少粪便中的微生物RNA，限制研究中的变量并分析肠道中的RNA组成，而不考虑各种混杂因素和污染源。值得注意的是，这种RNA分离最大限度地减少了活细胞和活微生物（细胞RNA）释放的RNA。它侧重于由肠道细胞释放或通过食物摄入获得的细胞外RNA。原则上，该方法不适用于研究微生物转录组的研究。

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Protocol

这里描述的所有涉及研究动物的方法均已获得哈佛医学院布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

此处描述的所有涉及人类研究主题的方法均符合合作伙伴人类研究委员会制定的指导方针。

1. 粪便样本采集

1. 高压灭菌或为实验中的每个动物受试者制备带有螺旋盖的无菌且无核酸酶的 2 mL 微量离心管。
   1. 对于人类受试者，为每个受试者提供适当的、无核酸酶的无菌粪便标本采集装置。
2. 在无菌环境中从每个动物受试者收集25-100mg（小鼠粪便样品约1-4个粪便颗粒）粪便样品。
   注意:两个或多个粪便颗粒（~50mg或更重）是获得最高纯度RNA的首选。
   1. 利用所有必要的个人防护设备 （PPE） 和材料，例如:一副实验室手套、消毒喷雾剂和无菌纸巾，对放置动物研究对象的工作区域进行消毒，以避免粪便样本污染。
      1. 对于人类受试者，指示每个研究对象/收集者在尽可能无菌的环境中收集100-200毫克粪便样本。使用标准无菌操作，避免粪便样本污染。
3. 将每个动物受试者的粪便样本直接收集到带有螺旋盖的 2 mL 微量离心管中，不要接触任何其他表面以避免污染。
   1. 对于人类受试者，指示每个受试者直接排便到提供的适用收集装置（例如，无菌粪便标本采集套件）中以避免污染。

Results

分别从50 mg小鼠粪便样品（2个小鼠粪便沉淀）和100 mg人粪便标本中分离代表性RNA，并在50 μL无核酸酶水中洗脱。分光光度计对浓度的分析表明，分别分离出49μg和16μgRNA的总量（表1）。如 ~2.0 的 A260/A280 比值和 ~1.8 的 A260/A230 比值所示，RNA 纯度很高（表 1）。如^报告3所示，粪便中的大多数RNA是microRNA，这些microRNA可以存在于外泌体中。与此一致，基于芯片的RNA电泳测定表明，来自小鼠和人类粪便的代表性RNA分离物在18S和28S rRNA组成中含量低或缺乏，并且RNA分离物的大小落在小RNA区域（图1A）。使用基于芯片的电泳进行进一步的小RNA电泳显示，大部分RNA具有microRNA大小（图1B）。这与使用小型RNA生物分析仪完成的定量与^{先前测定获得}的定量相当的观察结果一致6。

Discussion

重要的是使用无RNase技术来防止分离过程中的RNase污染⁷。离心并形成致密界面后，在回收水相时，关键是要避免中间相、下层相和颗粒污染物漂浮在水相顶部。此外，还添加了 500 μL 和 250 μL 洗涤溶液 2/3 的两个洗涤步骤，以消除滤膜中的污染物，从而优化质量。此外，不建议使用超过200 mg的起始样品材料，因为它可能会在中间相的明确形成中造成困难。同样，不建议使用小于25 mg的样品材料，因为它可能不足以提取足够的RNA样品进行下游分析。

微生物组研究的惊人增长推动了微生物物种、基因的测量，以^{微生物谱的}宏转录研究8。粪便中的MicroRNA已被研究为疾病的标志^物9，^10，11。自从粪便microRNA介导宿主-^{微生物相互作用的}首次报道3以来，越.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酸-苯酚：氯仿，pH 4.5（含 IAA，125：24：1）	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS，无钙、无镁	Thermo Fischer Scientific	14190-144
手套
离心机
mirVana miRNA 分离试剂盒	Thermo Fischer Scientific	AM1561
无核酸酶微量离心管（1.5 mL、2 mL）
无核酸酶水（未经 DEPC 处理）	Thermo Fischer Scientific	AM9937
移液器和无核酸酶移液器吸头（带过滤器）
PowerLyzer 24 均质器	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase 去污溶液	Thermo Fischer Scientific	AM9780
涡旋摇床