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高通量代谢谱分析用于微藻模型的优化

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DOI：

10.3791/61913

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2021年12月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

本文内容

摘要

本实验方案展示了如何利用表型微阵列（phenotype microarray, PM）技术平台，确定绿色微藻Chlamydomonas reinhardtii的代谢需求，并优化现有的代谢网络模型。

摘要

代谢模型基于生物体的基因组注释信息构建，可作为在系统水平上研究代谢过程的预测工具。基因组尺度的代谢模型可能包含空缺以及尚未通过实验验证的反应。对于新分离的微藻物种，由于此类分离株的代谢生化证据通常较为匮乏，所构建的模型会因这些空缺而存在缺陷。表型微阵列（phenotype microarray, PM）技术是一种高效、高通量的方法，可功能性地测定细胞在多种进入性代谢物刺激下的代谢活性 。将高通量表型检测与代谢建模相结合，可通过提供生化证据来支持和扩展基因组证据，从而快速重建或优化现有的代谢网络模型。本研究将以绿色微藻模式物种Chlamydomonas reinhardtii为例，展示PM检测在微藻研究中的应用。本研究利用PM实验获得的254个以上反应的实验证据，将基因组尺度的C. reinhardtii代谢网络模型iRC1080扩展并优化了约25%。本文建立的实验方案可作为其他微藻（包括已知的微藻突变体和新分离株）代谢功能特征分析的基础。

引言

为了增强并稳定地生产目标代谢物，优化藻类代谢需要通过代谢网络的系统水平分析，开发复杂的代谢工程策略。代谢网络模型可为优化策略的快速设计提供理性指导1,2,3,4。尽管已有约160种微藻物种完成测序5，但据我们所知，目前仅建立了44个藻类代谢模型4,6,7。由于难以获得高通量的代谢表型数据以对基因组信息进行实验验证，高质量网络模型的构建滞后于藻类基因组测序的快速发展。

C. reinhardtii 是藻类相关研究的理想模式体系。该物种可进行光能自养或异养生长，已被广泛用作基础与应用研究中的模式生物。其基因组序列于2007年发表8，随后研究人员基于该物种的基因组信息构建了基因组尺度的代谢模型9,10,11。Chang et al.10 基于基因组数据及文献证据（共涉及约250个来源）构建了C. reinhardtii 的基因组尺度代谢模型（iRC1080）。该模型包含1,706种代谢物和2,190个反应10；然而，该模型的完整性在当时无法超出已有发表的实验数据进行验证。

表型微阵列（PMs）技术是一种高通量平台，可为异养型微生物以及组织培养细胞提供代谢谱信息。特别是可用于解决微藻中表型与基因型之间的知识鸿沟，此应用首次报道于 莱茵衣藻12 随后针对一种绿胞藻属（Chloroidium）物种13 和小球藻14通过研究细胞对数千种代谢物、信号分子、渗透调节剂和效应分子的响应，PM检测可提供功能性代谢谱分析，并揭示细胞的功能、代谢特征及对环境的敏感性15,16,17具体而言，PM检测通过在96孔微孔板的各个孔中分别含有不同营养物质、代谢物或渗透调节物质，来检测细胞对代谢物的利用情况。此外，还可用于检测生物活性分子，如抗生素和激素。该方法通过检测NADH还原四唑类氧化还原染料所产生的颜色强度，评估细胞呼吸过程中对底物的代谢利用情况。15,16,1796孔微孔板中的实验可通过表型微阵列仪器（PMI）平台随时间自动监测和测定。设计有二十块96孔微孔板，涵盖常见的代谢物集合，用于研究细胞在利用碳源、氮源、硫源和磷源时的表型，以及不同渗透压/离子浓度和pH条件的影响。表型微阵列（PM）技术已成功应用于更新和完善多种现有微生物基因组尺度代谢模型。15,16,17,18.

此处所示方案与数据基于 Chaiboonchoe 之前发表的研究工作 等12 本文介绍了利用PM测定方法来表征微藻的代谢表型，并扩展现有微藻代谢模型的研究工作 C. reinhardtii 以及指导新代谢模型的构建。

方案

1. 表型微阵列实验

  1. 从美国明尼苏达大学的衣藻资源中心（https://www.chlamycollection.org）获取 C. reinhardtii 菌株 CC-503。
  2. 将细胞在新鲜的Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中培养19 ，添加终浓度为400 µg/mL的替门汀、50 µg/mL的氨苄青霉素和100 µg/mL的卡那霉素（以抑制细菌生长），在25 °C、光照强度为400 µmol光子/m2s的条件下培养两天，至对数中期。
  3. 在22 °C下以2,000 × g离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  4. 制备含有0.1%四氮唑紫染料“D”的新鲜TAP培养基。
    注意：根据每块微孔板所测试的代谢物类别，在此步骤中可对TAP培养基进行修改，去除某些营养成分（例如，在氮源测试板中去除氯化铵）。
  5. 将沉淀重悬于步骤1.2中制备的新鲜TAP培养基中，调整细胞浓度至最终浓度为1 × 106 个细胞/mL。
  6. 使用化学化合物阵列检测板（包括碳源、氮源、磷和硫源检测板以及肽类氮源检测板）。
  7. 将含细胞的培养基各100 µL加入检测板的每个孔中。
    注意：确保每个检测设置重复实验。
  8. 在酵母提取物/蛋白胨平板上划线培养细胞，并在实验前后按照Smith et al.20 的方法进行革兰氏染色，以监测细菌污染情况。
  9. 将化学化合物阵列检测板插入微孔板读数系统中。
  10. 将所有检测板在30 °C下孵育最多7天，并设置微孔板读数系统每15分钟读取一次染料颜色变化。
    注意：由于大多数微孔板读数仪在孵育过程中无法提供持续光照，因此藻类应能够进行异养呼吸。

2. 数据分析

  1. 将微孔板读数仪的原始动力学数据导出为 CSV 文件，随后用作 R 中 Omnilog 表型微阵列（OPM）软件包的输入数据。将生物学信息作为元数据添加（例如菌株编号、培养基、温度等）。
    1. 使用 PM 动力学数据转换软件；加载 D5E 数据文件，并在 PM 动力学分析软件中通过以下命令行将其转换为 OKA 文件：
      Load | Import（定位 OKA 文件所在文件夹）| Populate Filters | Import | Add All Plates | Close。
      ​Export | 选择读数数据 （Kinetic），选择格式 （CSV）（Tabulate Header），选择微孔板 （每块板（单独文件））| Export data | Save。
    2. 为进行表型微阵列（PM）数据分析，使用在 R 软件环境中运行的 OPM 软件包21,22 。该软件包、教程及参考文档 可在以下网址获取： http://www.goeker.org/opm/。在 R 的图形用户界面 RStudio 中，使用以下命令安装 opm 软件包及其依赖项：
      source (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      library (opm)
    3. 进入包含动力学数据 CSV 文件的目录，并使用 read_opm 函数导入数据：
      ​x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
    4. 通过曲线参数估计对动力学数据进行聚合与离散化处理。
      For (i in 1 :length(x)) {
      x[[i]] <- do_aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method ="splines", options = set_spline_options("smooth.spline"))
      x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE)
      }
      #元数据的收集
      metadata <- collect_template(".")
      metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503")
      for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
    5. 使用 xy_plot 函数将呼吸（或生长）测量值（y 轴）随时间（x 轴）的变化关系绘制成图，适用于所检测的 96 孔板。
      print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
    6. 使用 level_plot 函数将数据可视化为热图，以便快速比较动力学数据。
      level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
    7. 从原始动力学曲线中提取重要的生物学信息——曲线参数，包括延滞期（λ）、生长速率（μ）、最大细胞呼吸（A）以及曲线下面积（AUC）21。为鉴定阳性代谢物，需使用阴性对照的 A 值（代表染料与培养基之间的非生物反应性）以及每块微孔板的空白孔作为背景扣除值。extract 函数用于获取 A 参数。
      opm_opt("curve.param")
      param <- extract (x, as.labels = list("Strain")))

3. 与新代谢物相关的反应和基因的鉴定

  1. 通过检索 KEGG（京都基因与基因组百科全书）(http://www.genome.jp/kegg/)  和 MetaCyc (http://metacyc.org/)，确定由化学化合物阵列实验发现的代谢物所参与反应的酶学委员会编号（EC 编号）23,24。
  2. 以所确定的 EC 编号为基础，在多个可获取的藻类注释资源中进行搜索，包括联合基因组研究所（JGI）、Phytozome（http://www.phytozome.net）以及同行评审的科学文献23,25,26,27。
  3. 若某 EC 编号未检索到相应的遗传学证据，则需在其他生物中鉴定与该酶相关的蛋白质，优先从与C. reinhardtii亲缘关系最近的物种开始；随后在 NCBI PSI-BLAST 服务器上使用默认参数进行基于序列谱的搜索，并利用C. reinhardtii（taxid:3055）的非冗余蛋白数据库（nr）识别与该反应相关的候选基因12。
  4. 对 E 值 < 0.05 的 PSI-BLAST 检出结果进行人工审编，通过 EMBL-EBI Pfam（http://pfam.xfam.org/search）或 InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）蛋白结构域预测服务器进一步验证其是否与目标 EC 编号对应的酶功能相关。需注意，后两种分析是确保正确鉴定蛋白酶活性的关键步骤。

4. 模型优化与评估

  1. 使用最新的 COBRA Toolbox v.3.028 在 MATLAB 中29,30 用于模型优化的平台，以执行以下步骤。COBRA Toolbox 的安装可按照以下链接中的步骤进行：https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html 。此外，需注意 COBRA Toolbox 也可在其他开源编程语言中实现，例如 Python（COBRApy）31）并可在以下网址获取：https://opencobra.github.io/cobrapy/。
    1. 安装 COBRA Toolbox v.3.0 后，打开 MATLAB 并执行以下命令以初始化工具箱：
      ​initCobraToolbox;
    2. 将已鉴定的反应及其相关基因添加至代谢模型中，例如 iiRC1080，使用 COBRA Toolbox 函数 addReaction 以及 changeGeneAssociation. 导航至包含该文件的目录 iiRC1080 模型，从 http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 下载后，执行以下命令以加载模型、重命名模型，并添加一条新反应及其相关基因。
      加载('iRC 1080 .mat')
      modelNew = iRC 1080
      modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , …
      {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , …
      D-丙氨酸[c] , adp[c] , pi[c] …
      'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false);
      modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, …
      D-ALA 2'，'au.g 14655 _t 1
    3. 在某些情况下，当代谢物并非在细胞内产生，而是从培养基中摄取时，需向模型中添加新代谢物的转运反应。这些转运反应代表代谢物从胞外环境被动扩散至胞质溶胶的过程。此外，使用相应的虚拟交换反应进行补充 addExchangeRxn 将代谢物输入或输出至胞外培养基的功能。
      modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , …
      {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)
      modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]', -1000, 1000);
    4. 测试新生成模型的行为，例如， iBD1106，通过使用该函数进行通量平衡分析（FBA） 优化Cb模型 在光照和黑暗条件下，以生物量最大化作为目标函数。对于光照生长，将PRISM太阳能自养光反应的下限和上限设为646.07（最大速率）。对于黑暗生长，将所有PRISM光反应的上下限设为零。使用先前定义的生物量函数。10 在黑暗和光照条件下生长。FBA 解决方案将输出两个分别对应反应通量（solution.v）和缩减成本（solution.w）的向量，以及一个对应代谢物影子价格（solution.y）的向量。
      %模拟光照条件下的生长：
      modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ …
      % 'PRISM_solar_litho' , …
      PRISM_solar_exo …
      PRISM_incandescent_ 60 W …
      PRISM_fluorescent_cool_ 215 W …
      PRISM_metal_halide …
      PRISM_high_pressure_sodium …
      PRISM生长室 …
      PRISM_white_LED …
      PRISM_red_LED_array_ 653 nm …
      PRISM_red_LED_ 674 nm …
      PRISM_fluorescent_warm_ 18 W …
      PRISM_design_growth …
      }, 0, 'b' );
      modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');
    5. 重复步骤 4.1.4 iiRC1080，以比较获得的FBA解 iBD1106 与获得的那些进行比较 iiRC1080
    6. 可用的 COBRA 方法有多种，可用于比较模型（例如，通量变异性分析、基因敲除研究、鲁棒性分析、通量分支预测、FBA、采样等）。详细教程可参见 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html。此处提供了一个示例，其中 iiRC1080 模型与其优化版本进行比较， iBD1106，通过获取各模型中所包含代谢物的影子价格（生物量目标函数对系统变量变化的敏感性）。
      获取代谢物的影子价格：
      shadowPrices = 表（modelNew.mets, …
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y

结果

模式绿藻Chlamydomonas reinhardtii的表型微阵列筛选
表型微阵列（PM）实验用于检测该藻类在基本培养基中利用不同碳源、氮源、硫源和磷源的能力。在本方法描述中，我们展示了如何利用PM实验鉴定碳代谢和氮代谢特性。碳源和氮源利用的动力学通过微孔板读板仪进行测定，并使用PMI软件分析数据。所选PM实验板（PM01和PM03）的汇总动力学结果如图1所示。“xy图”展示了96孔板实验中随时间变化的呼吸代谢测量值，其中纵轴和横轴分别表示原始测量值和时间。数据被转换为热图模式，以便对动力学数据集进行比较分析。

利用PM数据优化基因组尺度代谢网络的流程（图2）展示了高通量PM测定与基因组搜索提供的实验证据相结合，能够扩展代谢网络模型。

为了评估从 PM01 - 04 和 PM10 板获得的 PM 数据的可重复性，通过线性回归分析将两次独立重复实验的数据相互作图（图 3）。图 3 显示，大部分数据点几乎重合于 45° 线上，仅有少数离群值存在，其决定系数 R2 为 0.9。该图证实了藻类实验结果的一致性和可重复性。

新代谢物的鉴定
PM 分析在七块微孔板（PM01-PM04 和 PM06-PM08）中鉴定出 662 种代谢物，而气相色谱飞行时间质谱（GC-TOF）鉴定了 77 种代谢物32 (图4）。在将这两组数据与所统计的1068种代谢物进行比较时 iRC1080，三组之间仅有六种代谢物重叠，而149种代谢物在其中两两之间重叠 iRC1080 和 PM。该结果表明，代谢谱分析平台可成为获取新型代谢信息的重要来源。

在扣除背景信号后，PM01 板中唯一检测到的支持性碳源为乙酸。该结果与文献报道一致33，表明了PM检测方法的特异性。PM检测揭示了莱茵衣藻（C. reinhardtii）可利用的新型硫、磷和氮源。其中，硫源代谢物包括硫酸盐、硫代硫酸盐、四硫代硫酸盐和DL-硫辛酰胺；磷源包括硫代磷酸盐、二硫代磷酸盐、D-3-磷酸甘油酸和半胱胺-S-磷酸；氮源代谢物包括L型和D型氨基酸（含一些不常见的氨基酸），如L-高丝氨酸、L-焦谷氨酸、甲胺、乙胺、乙醇胺、D,L-α-氨基丁酸，以及108种二肽和5种三肽（表 1）。所有新鉴定出的128种代谢物均在KEGG和MetaCyc数据库中进行了相关反应、EC编号及代谢通路的检索。

新发现的128种代谢物与49个独特的EC编号相关。其中，15个EC编号通过包括Phytozome 10.0.2版本在内的五个数据来源与其基因组证据建立了关联。34 JGI 版本 435，AUGUSTUS 5.0 和 5.210 Manichaikul 的注释 等36 和 KEGG13. 无基因组证据的代谢物被录入通用蛋白质资源数据库网站（UniProt，http://www.uniprot.org/）37,38 在其他生物体中发现了其相关序列。其他生物体中的同源序列 C. reinhardtii 通过在 NCBI 网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）运行位点特异性迭代 BLAST（PSI-BLAST），仅考虑产生显著比对结果的序列（E 值 < 0.05），鉴定出这些序列。 <0.005).

模型优化
与新增的128种代谢物及其编码基因相关的反应被添加到 iRC1080 模型中，从而扩展了代谢网络。所得模型 iBD1106 包含 2,444 个反应、1,959 种代谢物和 1,106 个基因（表 2）。新增的 254 个反应包括：20 个氨基酸氧化反应、108 个二肽水解反应、5 个三肽水解反应以及 120 个转运反应，这些反应由四个基因（Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3）编码。

共有 113 个新增反应，用于描述二肽和三肽的水解过程。二肽和三肽的水解分别与两个基因相关，其中一个基因对应二肽（Cre02.g078650.t1.3），另一个基因对应三肽（Cre16.g675350.t1.3）。

关于磷的来源，添加了一个与基因 JLM_162926 相关的半胱胺-S-磷酸盐水解为半胱胺和磷酸盐的反应。

WoLF PSORT 工具39 （http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）以及Ghamsari报告的结果 等35 用于确定新反应发生的细胞区室。通过分析与新反应相关的蛋白质序列，WoLF PSORT 预测这些反应的细胞区室为细胞质。

当生化信息不完整时，生成的代谢模型可能包含缺口。在这种情况下，可使用 COBRA 命令 gapFind。该命令可列出根缺口，并帮助识别新模型中引入的新缺口。在代谢模型中无法生成的代谢物被称为根缺口40,41。对根缺口的分析表明，iRC1080 和 iBD1106 模型均包含相同的 91 个缺口。这说明添加新的代谢物及其相关反应并未引入额外的根缺口。需要注意的是，本实验方案中使用的表型分析方法无法填补根缺口，因为原始的根缺口代谢物缺乏转运或生成机制，而这些机制在表型测定中未被解决。通过通量平衡分析，测试了 iBD1106 在光照和黑暗条件（无乙酸盐和含乙酸盐）下的代谢行为。该算法通过最大化生物量前体反应来优化目标函数（生物量生长）。为了评估每种代谢物对目标函数的贡献，计算了所有代谢物的“影子价格”。代谢物通量变化引起的目标函数变化定义了该代谢物的影子价格30,42。通过影子价格分析，可以判断某种代谢物是“过剩”还是“限制”目标函数，例如生物量的生成。负值或正值的影子价格表明，添加该代谢物将分别降低或提高目标函数；影子价格为零则表明该代谢物不会影响目标函数。在 图5中对 iBD1106 和 iRC1080 的影子价格进行比较显示，大多数代谢物未观察到显著变化；但在光照和黑暗生长条件下，分别发现了 105 和 70 种存在差异的情况。表 4 列出了这些代谢物的部分示例。

显示细菌生长和乙酸产生的时程数据与热图；实验数据分析。
图 1：C. reinhardtii的表型微阵列分析。 显示了PM01（碳源；A，C）和PM03（氮源；B，D）检测板的呼吸XY图和水平图。该图是一个8×12阵列，其中每个单元格代表一个孔板，因此对应一种特定的代谢物或生长环境。在每个单元格或孔的表示中，曲线表示染料通过还原反应的转化程度（y轴）随时间（x轴）的变化。每个单元格中均显示了来自CC-503和空白孔的PM呼吸曲线，并以颜色区分（青绿色代表空白孔，紫色代表CC-503）。水平图将每条呼吸曲线表示为一条细的水平线，其颜色随时间变化（或保持不变）。热图的颜色变化从浅黄色（几乎没有发生呼吸作用）到深橙色或棕色（发生了显著的呼吸作用）。图中展示了 C. reinhardtii（CC-503）及空白孔板所利用的代谢物。此图引自Chaiboonchoe 等先前发表的研究12 请点击此处查看该图的放大版本。

显示化合物转运、NADH吸收及网络优化步骤的代谢通路示意图。
图2：利用PM数据进行基因组尺度代谢网络优化的流程图。当一种新化合物在PM实验中呈阳性结果后，从现有数据库（如KEGG和MetaCyc）中确定其酶分类号（EC）、反应及代谢通路。随后，若可获得相关数据，则从基因组和注释资源中提取基因组证据，建立基因型与表型之间的关联。当缺乏直接的基因组证据时，可通过EC编号确定蛋白质序列，并利用PSI-Blast搜索获得遗传学证据。然后，基于新鉴定的化合物对重建的代谢网络进行优化，但需先经过质量控制步骤，即利用相关数据库查询蛋白质结构域。本图改编自Chaiboonchoe et al.12 之前发表的研究成果 请点击此处查看该图的放大版本。

散点图，相关性分析，R²=0.9049，重复PMI值比较图。
图3：PM测试的重复性。 在168小时的时间段内收集PMI值，并对两次重复实验中的最大PMI值进行作图。每个坐标轴代表一次实验的最大PMI值（x轴为一次重复实验，y轴为另一次重复实验）。重复性良好的数据点在两个轴上呈等距分布。每个点代表一个单独的最大值。线性回归由电子表格软件完成，并显示了决定系数（R2）的结果。本图改编自Chaiboonchoe et al.12 之前发表的研究工作。请点击此处查看此图的放大版本。

比较GC-TOF、Biolog、iRC1080数据集重叠部分及特有成分的维恩图
图4：代谢物的维恩图。 该维恩图列出了通过PM平板、iRC1080代谢模型以及气相色谱飞行时间质谱（GC-TOF）实验鉴定出的代谢物。每个圆圈表示各研究方法中所包含的代谢物总数，而重叠区域则表示不同方法之间共有的代谢物数量。iRC1080代谢模型共包含1,068种独特代谢物。GC-TOF共鉴定出77种代谢物32，而通过PM平板共鉴定出662种代谢物。本图源自Chaiboonchoe et al. 之前发表的研究工作12 请点击此处查看该图的放大版本。

iRC1080 与 iBD1106 数据集的极坐标图对比；图表展示数据方差。
图5代谢物的影子价格 iRC1080 和 iBD1106 在不同条件下 生物量最大化 “雷达图”中的每个圆圈对应一个影子价格值，而从图中心延伸出的每条线代表一种代谢物。 （A） 影子价格与代谢行为 iRC1080 和 iBD1106 在光照生长条件下； （B） 不同的代谢行为 iRC1080 和 iBD1106 在黑暗培养条件下的生长情况。该图来自 Chaiboonchoe 之前发表的研究工作 等 12 请点击此处以查看此图的放大版本。

Biolog 化学物质EC*基因注释PSI-BLAST
半胱胺-S-磷酸3.1.3.1JLM_1629261,2,3,4
四硫代硫酸盐1.8.2.2无显著性 E 值
1.8.5.2无显著性 E 值
D-丙氨酸1.4.1.1XP_001700222.1
1.5.1.22手动质控失败
2.1.2.7无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10无显著性 E 值
2.3.2.14无显著性 E 值
2.3.2.16无显著性 E 值
2.3.2.17无显著性 E 值
2.3.2.18无显著性 E 值
2.6.1.21手动质控失败
3.4.13.22XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4Chlre2_kg.scaffold_ 140000391,2,3
3.4.17.8手动质控失败
3.4.17.13无显著性 E 值
3.4.17.14无显著性 E 值
4.5.1.2无显著性 E 值
6.1.1.13手动质控失败
6.1.2.1手动质控失败
6.3.2.4au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10手动质控失败
6.3.2.16无显著性 E 值
6.3.2.35无显著性 E 值
D-天冬酰胺1.4.5.1无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96无显著性 E 值
2.3.1.36无显著性 E 值
1.4.99.1XP_001692123.1
3.5.1.77e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81无显著性 E 值
5.1.1.10手动质控失败
D-天冬氨酸6.3.1.12无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-谷氨酸1.4.3.7无显著性 E 值
1.4.3.3无显著性 E 值
D-赖氨酸5.4.3.4无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37手动质控失败
D-丝氨酸2.7.11.8无显著性 E 值
2.7.11.17Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78手动质控失败
3.4.21.104手动质控失败
4.3.1.18g6244.t14手动质控失败
6.3.2.35无显著性 E 值
6.3.3.5无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
D-缬氨酸1.21.3.1手动质控失败
6.3.2.26手动质控失败
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
L-焦谷氨酸
硫代磷酸盐
二硫代磷酸盐
乙胺6.3.1.6
D,L-α-氨基丁酸2.1.1.49无显著性 E 值
1.4.3.3Cre02.g096350.t1.35
二肽3.4.13.18Cre02.g078650.t1.31
三肽3.4.11.4Cre16.g675350.t1.31

表1: 已鉴定出的阳性底物利用代谢物列表（C、P、S、N），未包含于 iRC1080 代谢模型  若未鉴定出基因，则不包含该反应。  1Phytozome 版本 10.0.2（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii）   2JGI 版本 4 35.  3Augustus 版本 510.  4KEGG（http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html）  5JGI 版本 3.136. 本表格来自 Chaiboonchoe 早前发表的研究工作 等 12

模型反应代谢物基因
iRC10802,1911,7061,086
iBD11062,4451,9591,106

表2：iRC1080 和iBD1106的组成内容。 本表格来自 Chaiboonchoe 等 之前发表的研究12

反应类别或类型反应数量
氨基酸20
二肽108
三肽5
转运反应120

表3新反应概述 iBD1106. 此表格来自 Chaiboonchoe 之前发表的研究工作 等 12

生长条件代谢物名称iRC1080iBD1106
4r5au4-(1-D-核糖基氨基)-5-氨基尿嘧啶00.168
5aprbu5-氨基-6-(5'-磷酸核糖基氨基)尿嘧啶-0.0090.158
光照pa1819Z18111Z1-(9Z)-十八碳烯酰,2-(11Z)-十八碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸-0.009-0.65
黑暗4abut4-氨基丁酸0.18-0.05

表 4：显著影子价格的示例 iRC1080 和 iBD1106. 此表格来自 Chaiboonchoe 之前发表的研究工作 等 12

讨论

本文利用高通量PM测定板和未经修饰的PMI，描述了绿色微藻C. reinhardtii的代谢表型分析。该检测方法共用于190种碳源（PM01和PM02）、95种氮源（PM03）、59种磷源和35种硫源（PM04），以及肽类氮源（PM06-08）。在这些检测中，共观察到148种营养物质产生阳性呼吸反应（其中碳源利用有1项阳性检测，硫源和磷源利用各有4项阳性检测，氮源利用有139项阳性检测）。当将培养基应用于针对各类营养源（碳、氮、磷或硫）进行检测的相关PM微孔板时，培养基中不应添加对应的底物或营养成分。

此处展示的方法可有效用于表征微藻的代谢表型，进而扩展现有的代谢网络模型或指导新模型的构建。此外，随着 大多数微藻的营养需求尚不明确，该平台可用于快速确定这些需求。Nelson 等43 已成功应用这些方法鉴定出可促进微藻生长的新化合物 Chloroidium sp. UTEX 3007，并利用所获得的信息定义该物种的入口代谢物，这些代谢物与衣藻不同，包括 40 种不同的碳源。

使用PM对微藻进行表型分析的一个主要局限在于，PMI的培养室中没有光照，因此微藻必须能够进行异养代谢。缺乏光照可能会影响那些依赖光信号来计算代谢通量的模型的解释。具有协同功能的基因对在进化过程中共同形成了代谢网络的枢纽，而光合与非光合代谢网络枢纽之间的区别是可以界定的44。通常情况下，光合代谢网络枢纽（即模型中连接度较高的节点）将不会包含在异养模型中。从实际应用角度出发，在对混合营养型物种建模时，应排除已知由光照驱动的反应，并考虑不同条件下能量平衡的差异。因此，在衣藻代谢建模中，分别对光依赖性和光非依赖性代谢进行建模是标准做法6,45。

一些绿色微藻，例如共球藻纲（Trebouxiophytes），能够同化多种碳分子以支持生长，这被认为源于它们作为地衣共生成员的长期进化历史。46。虽然像绿藻类这样的 衣藻 可利用乙酸盐进行生长的褐色海洋微藻 微绿球藻（Tisochrysis lutea） 以其商业化生产超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFAs）的潜力而闻名，不能利用乙酸盐，但可利用甘油进行生长47生物量浓度超过 100 g/L−1 干重细胞量已通过以下方式实现 小球藻 通过在补料分批模式下优化添加有机碳源48此外，向其中添加糖可 小球藻 vulgaris 可提高其对 CO 的封存能力2, 从而在光合生长过程中提供加性效应49大多数异养型微藻也可进行混合营养生长，但绿藻门 Chromochloris zofingiensis 已证明在添加糖后可关闭光合作用50.

硅藻属于硅藻门（Bacillariophyta），是一类重要的浮游植物。尽管大多数硅藻只能进行光能自养生长，但其中一些种类可进行混合营养或异养培养51。例如，已发现甘油可在无CO2 的光照条件下支持某些硅藻（包括模式物种Phaeodactylum tricornutum）的生长52。此外，某些底栖硅藻（如Nitzschia linearis）可在黑暗中利用碳水化合物生长53。通过添加合适的有机碳源，使细胞实现异养生长，有望将PM测定法扩展应用于硅藻及其他藻类类群；而对于专性自养微藻，也可结合最低限度的光照，采用混合营养策略进行培养。

为评估数据的可重复性，强烈建议对所有板进行重复检测。只有在减去阴性对照和相应空白孔的值后，吸光度（PMI值）为正值时，才可将该检测结果视为阳性。此现象在存在待测化合物的情况下，反映了染料与培养基之间的非生物反应。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究的主要支持来自纽约大学阿布扎比分校基因组学与系统生物学中心（CGSB），资助方为塔克欣（Tamkeen），项目资金来自纽约大学阿布扎比分校研究所拨款（73 71210 CGSB9）以及纽约大学阿布扎比分校教师研究基金（AD060）。W.F. 还获得了浙江大学“百人计划”的额外支持。我们感谢 Ashish Jaiswal 在视频录制过程中提供的帮助。我们感谢 Hong Cai 生成了代谢表型数据。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨苄青霉素VWR97062-796
Biolog 生理生化鉴定板 [PM01-08]Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog 检测系统Biolog, Hayward, CA, USA
莱茵衣藻 CC-503 菌株美国明尼苏达大学莱茵衣藻资源中心明尼苏达大学董事会
卡那霉素VWR0408-EU-10G
四氮唑紫染料 “D”Biolog, Hayward, CA, USA
替门汀GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd42010012-2

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