小脑区域解剖用于分子分析

摘要

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。 

摘要

小脑在多种关键功能中发挥重要作用，包括运动控制、平衡、认知、奖赏和情绪调节。影像学研究表明，小脑的不同区域参与了这些不同的功能。然而，针对小脑区域差异的分子学研究进展相对滞后，因为目前多数研究使用整个小脑组织提取物，从而掩盖了特定小脑区域之间的差异。本文介绍一种可重复且快速分离四个不同小脑区域的技术：小脑深部核团（DCN）、前部和后部蚓部小脑皮层，以及小脑半球皮层。分离这些不同的区域有助于探索可能介导其在平衡、运动、情绪和认知中独特作用的分子机制。该技术也可用于研究在不同小鼠疾病模型中，这些特定区域在病理易感性方面的差异。

引言

小脑含有大脑中超过一半的神经元，传统上被认为是一个控制运动和平衡的中枢¹。近年来，研究证明小脑还在多种其他功能中发挥关键作用，包括认知、奖赏处理和情绪调节^2,3,4,5。

小脑具有明确的解剖结构：其皮层区域由颗粒层、浦肯野细胞层和分子层组成。颗粒细胞构成颗粒细胞层，并通过平行纤维将输入信号传递至分子层中的浦肯野细胞树突，后者同时还接收来自下橄榄核发出的攀缘纤维的输入。浦肯野细胞向小脑深部核团（DCN）的神经元发出抑制性投射，后者是小脑的主要输出通路。该小脑环路的输出还受到小脑皮层内抑制性中间神经元（包括戈尔吉细胞、星形细胞和篮状细胞）活动的进一步调节。⁴该小脑功能单元分布于小脑皮层的所有小叶中。尽管小脑各区域的环路结构相对一致，  小脑，来自人类神经影像学文献和患者研究的证据表明小脑具有功能异质性^6,7.

小脑皮层可分为两个主要区域：位于中线的蚓部和外侧半球。蚓部可进一步分为前叶和后叶。小脑这些不同的区域被认为参与调控多种不同的行为。任务诱发或无任务状态下的活动模式提示，蚓部的前部区域更多地参与运动功能，而后部蚓部则更多地参与认知功能^6,7。此外，蚓部还与情绪和情感相关，而小脑半球则参与执行功能、视觉空间处理、语言及其他记忆功能⁸。解剖学研究还表明，功能上不同的小脑区域与不同的大脑皮层区域存在连接⁹。病灶-症状映射研究发现，病变累及前叶（延伸至小叶VI）的卒中患者在精细运动任务中表现较差，而病变位于后叶区域及半球的患者则表现出认知缺陷，但无小脑运动综合征¹⁰。最后，疾病中的区域性小脑病理改变表明，功能上不同的小脑区域对疾病的易感性也各不相同^11,12。

尽管相关研究较少，初步证据表明小脑皮层不同区域具有独特的基因表达特征。浦肯野细胞中Zebrin II的表达在蚓部呈现区域特异性的分布模式，即后部小叶中Zebrin II阳性细胞较多，而前部小叶中较少¹³。这种差异还与区域特异的生理功能相关，表现为Zebrin II阴性的浦肯野细胞比Zebrin II阳性的浦肯野细胞具有更高的持续放电频率¹⁴。

除了小脑皮层外，小脑还包括作为小脑主要输出通路的深部小脑核团（DCN）。这些核团由内侧核（MN）、中间核（IN）和外侧核（LN）组成。功能成像和患者研究已表明，DCN也参与多种行为活动¹⁵，但极少有研究探讨DCN中基因表达的变化。

分子技术的进步使得研究脑内特定区域的基因表达成为可能，并揭示了在生理和疾病状态下不同脑区之间以及同一脑区内存在的异质性¹⁶。这些研究表明，小脑与其他脑区存在差异。例如，与其它脑区相比，小脑中神经元与胶质细胞的比例是相反的 ¹。即使在正常的生理条件下，小脑中促炎基因的表达也高于其他脑区¹⁷。分子技术在识别参与小脑疾病发病机制的通路方面也非常有用。例如，对整个小脑组织提取物进行RNA测序，鉴定出在脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）的浦肯野细胞特异性转基因小鼠模型中发生改变的基因，相较于野生型对照组。这些证据揭示了小脑浦肯野细胞发病机制中的关键分子通路，并有助于识别潜在的治疗靶点¹⁸。然而，最近的研究表明，小脑不同区域对疾病的易感性存在差异^11,12,19。这可能意味着在不同的小脑区域中发生了关键性的变化，而这些变化可能在使用全小脑提取物时被掩盖或无法检测到。因此，有必要开发出能够使研究人员分析不同小脑区域分子特征的技术。

本文所述技术提供了一种可重复的方法，用于分离小鼠小脑的四个不同区域，以从这些区域提取RNA，并探究基因表达的区域性差异。图1A 中的小鼠小脑示意图将蚓部标为蓝色，半球标为黄色。具体而言，该技术可实现以下四个区域的分离： 小脑深部核团（DCN）（图1A 中红色虚线框所示区域）、前部蚓部小脑皮层（CCaV）（图1A 中深蓝色区域）、后部蚓部小脑皮层（CCpV）（图1A 中浅蓝色区域）以及半球小脑皮层（CCH）（图1A 中黄色区域）。通过对这些区域的基因表达分别进行分析，将有助于研究这些不同区域各自功能背后的分子机制，以及它们在疾病中易损性方面可能存在的差异。

方案

1. 设置

1. 准备所需设备，包括断头剪、钝头镊子、解剖剪、血管剪、微型刮勺、矢状面小鼠脑组织切片模具、剃须刀片、200 µL 移液器吸头、玻璃培养皿、玻璃载片和冰桶。将所有设备放置在吸水垫上。
2. 将培养皿、玻璃板和脑组织切片模具置于冰上。
3. 使用剃须刀片以垂直角度剪去一个200 µL 移液器吸头尖端约5 mm，使吸头末端开口宽度约为1 mm。此尺寸通常足以 punch 出小脑深部核团（DCN）。但也可根据实际解剖情况按需调整。建议准备多个吸头以便快速更换和调整。
4. 用动物编号和小脑区域标记1.5 mL微量离心管（每只动物四管）。
5. 在冷冻安全容器中装入液氮，用于组织取出后快速冷冻。

2. 脑组织提取与解剖

所有实验均按照明尼苏达大学动物护理委员会的指南进行。

1. 使用5% CO₂暴露法处死小鼠。呼吸停止后，实施颈椎脱位。用断头剪将小鼠头部剪下，并将尸体丢弃至指定容器中。
2. 使用刀片沿头部正中矢状线从鼻部开始向后做一切口，分离皮肤并向两侧翻开。使用刀片切除两侧肌肉，切至耳道下方。
3. 使用解剖剪修剪脊髓区域，直至脑干与小脑交界处，注意避免损伤小脑。
4. 将血管剪的一侧刀片插入脑干与脊柱之间的间隙，向耳道方向剪开，同时轻轻上抬剪刀，以干净地切断骨骼但尽量减少对组织的损伤。
5. 继续沿颅骨边缘向嗅球方向剪开，剪切时持续上抬，以尽量减少对脑组织的损伤。
6. 使用钝头镊子轻轻剥离颅骨后部，暴露脑的后部区域及小脑。
7. 沿刚刚剪开的颅骨边缘，使用钝头镊子将剩余颅骨向上并越过脑组织剥离。此步骤应去除大部分颅顶，从而暴露脑组织。
8. 使用血管剪和钝头镊子进一步修剪剩余颅骨，清除脑顶部的大部分颅骨。
9. 使用显微铲轻轻抬起脑组织，从下方插入并向上滑动，以分离嗅球与残留颅骨，并切断视束纤维。此时脑组织应可轻松取出。
10. 将脑组织放入置于冰上的培养皿中，并清除任何残留的颅骨或其他碎片。
11. 使用显微铲将脑组织背侧朝上轻轻放入脑切片模具中。仔细调整位置，确保其在模具中水平放置，尤其是中线应位于模具中央。该模具专为成年小鼠脑组织设计；幼龄或患病动物的组织可能在模具中位置较低，但仍应能实现样本间可重复的结果。
12. 将一片刀片沿矢状中线放置，确保刀片完全插入模具底部（图1B）。
13. 在第一片刀片侧方1 mm处放置第二片刀片（图1B）。再放置两片刀片，彼此间隔1 mm。最终结果应为在脑的一侧放置三片刀片，彼此相距1 mm。另一侧同样操作。总共放置7片刀片，彼此相距1 mm（图1C）。
14. 小心抓住刀片的前后两端，垂直向上从模具中取出。刀片外侧的组织可丢弃。
15. 缓慢地逐次分离各刀片，注意避免损伤组织切片。
16. 使用显微铲小心将组织切片从刀片上滑下并转移至载玻片上。共获得六片矢状面脑切片（图1D）。
17. 最外侧的4个切片中可见小脑深部核团（DCN）（紫色框，图1D）。为分离DCN，将修剪过的200 µL 移液器吸头垂直置于DCN上方，用力向下压穿组织，并在各个方向轻轻摇动，以彻底将DCN从周围组织中分离。垂直向上提起，干净地取出DCN，并目视确认吸头内含有组织。
18. 用手指按压吸头顶部，使组织凸出。将吸头插入正确标记的微量离心管中，确保组织穿孔样本落入管底。对剩余三个切片重复步骤2.17，将所有DCN穿孔样本放入同一管中。将离心管置于液氮中快速冷冻。各穿孔样本大小示意图见图1E。
19. 已提取DCN的切片属于小脑半球。将这些切片中 cerebellum 周围的其余脑组织推离。使用钝头镊子小心夹取这些半球的小脑皮层组织，并放入相应的微量离心管中。快速冷冻。
20. 对于最后两个蚓部切片（浅蓝色框，图1D），推离周围脑组织，仅保留小脑。使用刀片将前部小叶与后部小叶分离。切口应位于小叶6形成之后，且不应包含小叶10（图1F）。
21. 使用钝头镊子小心将前部小脑皮层组织和后部小脑皮层组织分别放入对应的微量离心管中，并将离心管置于液氮中5分钟进行快速冷冻。此后可继续进行RNA提取，或 将离心管保存于-80 ˚C环境中。

3. RNA 提取

注意：本方案改编自《冷泉港实验室方案》中的TRIzol法RNA提取方案²⁰。TRIzol可溶解生物材料，从而实现RNA的提取。

1. 将微量离心管置于冰上，以防止组织过快融化，向微量离心管中加入150 µL 冰冷的TRIzol。使用无菌研杵进行匀浆。组织匀浆完成后，用移液器反复吹打溶液，确保无完整组织残留。通过胰岛素注射器反复抽吸，进一步破碎任何细小的组织碎片。
2. 再加入350 µL TRIzol，并反复吹打以充分混匀。室温静置5分钟。
3. 向管中加入150 µL 氯仿，剧烈振荡，然后静置2-3分钟。氯仿将匀浆后的组织溶液分离为不同相（RNA、DNA和蛋白质）。
4. 在15˚C下以12,000 × g离心10分钟。确保所有离心管处于相同方向。
5. 小心取出离心管，并将离心机温度设为4˚C。仅将透明的水相转移至新管中（此为RNA），注意不要扰动不透明的中间相（即DNA）。 最下层为红色，含有蛋白质。管中剩余溶液可保存或丢弃。
6. 按1:2比例加入100%异丙醇（若取出了200 µL水相，则加入100 µL 异丙醇）。通过反复吹打充分混匀。室温静置10分钟。异丙醇使RNA从溶液中沉淀析出。
7. 在4˚C下以12,000 × g离心10分钟。确保所有离心管方向一致，以便于观察沉淀。所得沉淀即为提取的RNA。
8. 小心取出离心管，用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。沉淀呈凝胶状，较难观察，但可根据离心管在离心机中的方向大致判断其位置。
9. 吸除全部上清液后，加入500 µL 75%乙醇，短暂涡旋，然后在4˚C下以7500 × g离心5分钟。乙醇进一步洗涤沉淀。
10. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。打开管盖使样品干燥。通常需要5-10分钟，具体时间取决于沉淀上残留的乙醇量。切勿过度干燥。
11. 干燥后，将沉淀重悬于无DNase的水中。DCN样品加入20 µL ，其余样品均加入30 µL 。
12. 重悬后，样品可于-80 ˚C保存，或进行后续检测。

4. 实时定量聚合酶链式反应（RTqPCR）

1. 在此步骤之前，必须对 RNA 进行 DNase 处理以去除任何基因组 DNA，并使用 BioRad 的 iScript 生成 cDNA。在制备 cDNA 之前，务必对 RNA 浓度进行归一化。此外，优化 qPCR 引物至关重要。请遵循此处描述的方法完成此步骤²¹。以下为 qPCR 的简要说明。
2. 所有引物均购自 IDT。正向和反向序列位于同一管样品中，储存浓度为 20x。
   Rps18（对照基因）：
   正向 – 5’-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3’
   反向 – 5’-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
   Parvalbumin（钙结合蛋白，抑制性细胞标记物）：
   正向 – 5’-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3’
   反向 – 5’-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3’
   Kcng4（钾通道亚基）：
   正向 – 5’-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3’
   反向 – 5’-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3’
   Aldolase C（Zebrin II，小脑皮层中差异表达）：
   正向 – 5’-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3’
   反向 – 5’-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3’
3. qPCR 反应条件如下：预变性阶段，95˚C 下持续 5 分钟；扩增阶段，共 50 个循环：95˚C 下 10 分钟，62˚C 下 10 分钟，72˚C 下 10 分钟；熔解曲线阶段：95˚C 下 5 秒，65˚C 下 1 分钟，升温速率为 0.07˚C/秒，直至达到 97˚C 的目标温度；随后进入冷却阶段，10 分钟内降温至 40˚C。 所有 qPCR 反应均设三个重复，采用 2^{- ΔΔCt} 法分析基因表达水平，以 Rps18 作为上样对照对基因表达进行归一化处理，并以全小脑提取物作为参考样本。

结果

本实验使用了四只十一周龄的雌性野生型 C57/Black6 小鼠。其中一只小鼠用于进行完整的小脑解剖，称为“整体小脑”，以便将解剖区域中的 RNA 水平与完整解剖样本进行比较。其余三只小鼠用于执行本方案中描述的小脑解剖。使用三只小鼠可确保在不同个体间检测到的 RNA 水平变化趋势具有可重复性。

图1A 显示小鼠小脑——蚓部为蓝色，半球为黄色。图中为蚓部（前部区域为深蓝色，后部区域为浅蓝色）和半球（黄色）的矢状面示意图。DCN 用红色虚线框标出。成功的解剖操作始于将刀片沿脑组织中线进行初始切割（图1B）；该步骤可指导后续六次刀片切割的准确定位（图1C）。由此可获得六个矢状切片（图1D），包括四个外侧/半球切片（紫色轮廓...

讨论

本文所述方法可评估四个不同小脑区域内的基因表达基础及分子机制，这些区域包括小脑深部核团（DCN）、小脑蚓部前部皮层（CCaV）、小脑蚓部后部皮层（CCpV）以及小脑半球皮层（CCH）。能够分别评估这些区域将拓展我们对特定小脑区域异质性的认识，并可能揭示其在多种行为中的作用。

通过将全脑组织进行矢状面切片，可以轻松地观察和识别小脑的这四个区域，从而实现快速分离。据作者所知，这是首次描述用于分子分析的全小脑区域分离方法。在最近发表的一篇论文中，研究人员采用粗分离法获取小脑前部小叶和小脑结节小叶进行分子分析²²。然而，使用该方法无法同时分离小脑深部核团（DCN）。尝试使用振动切片机切割300 μm厚的切片以获取DCN穿孔样本时，通常会遇到三个关键问题。第一，由于小脑固定位置的微小差异以及组织切片角度的不同，难以在不同动物之间重复性地分离出相同的区域。第二，固定和切片过程耗时较长，增加了RNA降解的风险，降低了后续实验中RNA样本的质量。最后，从300 μm厚的切片中获取的穿孔组织RNA得率较低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 微量离心管	ThermoScietific	3456
100% 异丙醇	VWR Life sciences	1106C361
200 µl 移液器吸头	GeneMate	P-1237-200
成年小鼠脑切片模具（矢状面）	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
钝头镊子
氯仿	Macron	220905
断头剪
解剖剪
乙醇	Pharmco	111000200
玻璃载片（用于电泳）	BIORAD
匀浆器	Kimble	6HAZ6
冰桶
胰岛素注射器（0.5 ml）	BD	329461
iScript Adv cDNA 反转录-qPCR 试剂盒	BIORAD	1725037
微型刮勺
尖嘴镊
培养皿	Pyrex
Aldolase C 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.58>43415246
Kcng4 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Parvalbumin 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.58.7596729
Priming 引物 Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
单刃剃刀刀片	Personna GEM
无菌一次性研磨杵	FisherScientific	12141364
TRIzol 试剂	Ambion by Life technologies	15596018
血管剪