小脑区域解剖用于分子分析

摘要

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。 

摘要

小脑在多种关键功能中发挥重要作用，包括运动控制、平衡、认知、奖赏和情绪调节。影像学研究表明，小脑的不同区域参与了这些不同的功能。然而，针对小脑区域差异的分子学研究进展相对滞后，因为目前多数研究使用整个小脑组织提取物，从而掩盖了特定小脑区域之间的差异。本文介绍一种可重复且快速分离四个不同小脑区域的技术：小脑深部核团（DCN）、前部和后部蚓部小脑皮层，以及小脑半球皮层。分离这些不同的区域有助于探索可能介导其在平衡、运动、情绪和认知中独特作用的分子机制。该技术也可用于研究在不同小鼠疾病模型中，这些特定区域在病理易感性方面的差异。

引言

小脑含有大脑中超过一半的神经元，传统上被认为是一个控制运动和平衡的中枢¹。近年来，研究证明小脑还在多种其他功能中发挥关键作用，包括认知、奖赏处理和情绪调节^2,3,4,5。

小脑具有明确的解剖结构：其皮层区域由颗粒层、浦肯野细胞层和分子层组成。颗粒细胞构成颗粒细胞层，并通过平行纤维将输入信号传递至分子层中的浦肯野细胞树突，后者同时还接收来自下橄榄核发出的攀缘纤维的输入。浦肯野细胞向小脑深部核团（DCN）的神经元发出抑制性投射，后者是小脑的主要输出通路。该小脑环路的输出还受到小脑皮层内抑制性中间神经元（包括戈尔吉细胞、星形细胞和篮状细胞）活动的进一步调节。⁴该小脑功能单元分布于小脑皮层的所有小叶中。尽管小脑各区域的环路结构相对一致，  小脑，来自人类神经影像学文献和患者研究的证据表明小脑具有功能异质性^6,7.

小脑皮层可分为两个主要区域：位于中线的蚓部....

方案

1. 设置

1. 准备所需设备，包括断头剪、钝头镊子、解剖剪、血管剪、微型刮勺、矢状面小鼠脑组织切片模具、剃须刀片、200 µL 移液器吸头、玻璃培养皿、玻璃载片和冰桶。将所有设备放置在吸水垫上。
2. 将培养皿、玻璃板和脑组织切片模具置于冰上。
3. 使用剃须刀片以垂直角度剪去一个200 µL 移液器吸头尖端约5 mm，使吸头末端开口宽度约为1 mm。此尺寸通常足以 punch 出小脑深部核团（DCN）。但也可根据实际解剖情况按需调整。建议准备多个吸头以便快速更换和调整。
4. 用动物编号和小脑区域标记1.5 mL微量离心管（每只动物四管）。
5. 在冷冻安全容器中装入液氮，用于组织取出后快速冷冻。

2. 脑组织提取与解剖

所有实验均按照明尼苏达大学动物护理委员会的指南进行。

1. 使用5% CO₂暴露法处死小鼠。呼吸停止后，实施颈椎脱位。用断头剪将小鼠头部剪下，并将尸体丢弃至指定容器中。
2. 使用刀片沿头部正中矢状线从鼻部开始向后做一切口，分离皮肤并向两侧翻开。使用刀片切除两侧肌肉，切至耳道下方。
3. 使用解剖剪修剪脊髓区域，直至脑干与小脑交界处，注意避免损伤小脑。

结果

本实验使用了四只十一周龄的雌性野生型 C57/Black6 小鼠。其中一只小鼠用于进行完整的小脑解剖，称为“整体小脑”，以便将解剖区域中的 RNA 水平与完整解剖样本进行比较。其余三只小鼠用于执行本方案中描述的小脑解剖。使用三只小鼠可确保在不同个体间检测到的 RNA 水平变化趋势具有可重复性。

图1A 显示小鼠小脑——蚓部为蓝色，半球为黄色。图中为蚓部（前部区域为深蓝色，后部区域为浅蓝色）和半球（黄色）的矢状面示意图。DCN 用红色虚线框标出。成功的解剖操作始于将刀片沿脑组织中线进行初始切割（图1B）；该步骤可指导后续六次刀片切割的准确定位（图1C）。由此可获得六个矢状切片（图1D），包括四个外侧/半球切片（紫色轮廓.......

讨论

本文所述方法可评估四个不同小脑区域内的基因表达基础及分子机制，这些区域包括小脑深部核团（DCN）、小脑蚓部前部皮层（CCaV）、小脑蚓部后部皮层（CCpV）以及小脑半球皮层（CCH）。能够分别评估这些区域将拓展我们对特定小脑区域异质性的认识，并可能揭示其在多种行为中的作用。

通过将全脑组织进行矢状面切片，可以轻松地观察和识别小脑的这四个区域，从而实现快速分离。据作者所知，这是首次描述用于分子分析的全小脑区域分离方法。在最近发表的一篇论文中，研究人员采用粗分离法获取小脑前部小叶和小脑结节小叶进行分子分析²²。然而，使用该方法无法同时分离小脑深部核团（DCN）。尝试使用振动切片机切割300 μm厚的切片以获取DCN穿孔样本时，通常会遇到三个关键问题。第一，由于小脑固定位置的微小差异以及组织切片角度的不同，难以在不同动物之间重复性地分离出相同的区域。第二，固定和切片过程耗时较长，增加了RNA降解的风险，降低了后续实验中RNA样本的质量。最后，从300 μm厚的切片中获取的穿孔组织RNA得率较低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 微量离心管	ThermoScietific	3456
100% 异丙醇	VWR Life sciences	1106C361
200 µl 移液器吸头	GeneMate	P-1237-200
成年小鼠脑切片模具（矢状面）	Kent Scientific Corporation	RBMA-200S
钝头镊子
氯仿	Macron	220905
断头剪
解剖剪
乙醇	Pharmco	111000200
玻璃载片（用于电泳）	BIORAD
匀浆器	Kimble	6HAZ6
冰桶
胰岛素注射器（0.5 ml）	BD	329461
iScript Adv cDNA 反转录-qPCR 试剂盒	BIORAD	1725037
微型刮勺
尖嘴镊
培养皿	Pyrex
Aldolase C 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.58>43415246
Kcng4 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.56a.9448518
Parvalbumin 基因 Primetime 引物	IDT	Mm.PT.58.7596729
Priming 引物 Rps18	IDT	Mm.PT.58.12109666
单刃剃刀刀片	Personna GEM
无菌一次性研磨杵	FisherScientific	12141364
TRIzol 试剂	Ambion by Life technologies	15596018
血管剪