不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用,但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法,以便通过分离RNA并检测基因表达差异,探究这些区域间的分子差异。
方法文章
不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用,但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法,以便通过分离RNA并检测基因表达差异,探究这些区域间的分子差异。
小脑在多种关键功能中发挥重要作用,包括运动控制、平衡、认知、奖赏和情绪调节。影像学研究表明,小脑的不同区域参与了这些不同的功能。然而,针对小脑区域差异的分子学研究进展相对滞后,因为目前多数研究使用整个小脑组织提取物,从而掩盖了特定小脑区域之间的差异。本文介绍一种可重复且快速分离四个不同小脑区域的技术:小脑深部核团(DCN)、前部和后部蚓部小脑皮层,以及小脑半球皮层。分离这些不同的区域有助于探索可能介导其在平衡、运动、情绪和认知中独特作用的分子机制。该技术也可用于研究在不同小鼠疾病模型中,这些特定区域在病理易感性方面的差异。
小脑含有大脑中超过一半的神经元,传统上被认为是一个控制运动和平衡的中枢1。近年来,研究证明小脑还在多种其他功能中发挥关键作用,包括认知、奖赏处理和情绪调节2,3,4,5。
小脑具有明确的解剖结构:其皮层区域由颗粒层、浦肯野细胞层和分子层组成。颗粒细胞构成颗粒细胞层,并通过平行纤维将输入信号传递至分子层中的浦肯野细胞树突,后者同时还接收来自下橄榄核发出的攀缘纤维的输入。浦肯野细胞向小脑深部核团(DCN)的神经元发出抑制性投射,后者是小脑的主要输出通路。该小脑环路的输出还受到小脑皮层内抑制性中间神经元(包括戈尔吉细胞、星形细胞和篮状细胞)活动的进一步调节。4该小脑功能单元分布于小脑皮层的所有小叶中。尽管小脑各区域的环路结构相对一致, 小脑,来自人类神经影像学文献和患者研究的证据表明小脑具有功能异质性6,7.
小脑皮层可分为两个主要区域:位于中线的蚓部和外侧半球。蚓部可进一步分为前叶和后叶。小脑这些不同的区域被认为参与调控多种不同的行为。任务诱发或无任务状态下的活动模式提示,蚓部的前部区域更多地参与运动功能,而后部蚓部则更多地参与认知功能6,7。此外,蚓部还与情绪和情感相关,而小脑半球则参与执行功能、视觉空间处理、语言及其他记忆功能8。解剖学研究还表明,功能上不同的小脑区域与不同的大脑皮层区域存在连接9。病灶-症状映射研究发现,病变累及前叶(延伸至小叶VI)的卒中患者在精细运动任务中表现较差,而病变位于后叶区域及半球的患者则表现出认知缺陷,但无小脑运动综合征10。最后,疾病中的区域性小脑病理改变表明,功能上不同的小脑区域对疾病的易感性也各不相同11,12。
尽管相关研究较少,初步证据表明小脑皮层不同区域具有独特的基因表达特征。浦肯野细胞中Zebrin II的表达在蚓部呈现区域特异性的分布模式,即后部小叶中Zebrin II阳性细胞较多,而前部小叶中较少13。这种差异还与区域特异的生理功能相关,表现为Zebrin II阴性的浦肯野细胞比Zebrin II阳性的浦肯野细胞具有更高的持续放电频率14。
除了小脑皮层外,小脑还包括作为小脑主要输出通路的深部小脑核团(DCN)。这些核团由内侧核(MN)、中间核(IN)和外侧核(LN)组成。功能成像和患者研究已表明,DCN也参与多种行为活动15,但极少有研究探讨DCN中基因表达的变化。
分子技术的进步使得研究脑内特定区域的基因表达成为可能,并揭示了在生理和疾病状态下不同脑区之间以及同一脑区内存在的异质性16。这些研究表明,小脑与其他脑区存在差异。例如,与其它脑区相比,小脑中神经元与胶质细胞的比例是相反的 1。即使在正常的生理条件下,小脑中促炎基因的表达也高于其他脑区17。分子技术在识别参与小脑疾病发病机制的通路方面也非常有用。例如,对整个小脑组织提取物进行RNA测序,鉴定出在脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)的浦肯野细胞特异性转基因小鼠模型中发生改变的基因,相较于野生型对照组。这些证据揭示了小脑浦肯野细胞发病机制中的关键分子通路,并有助于识别潜在的治疗靶点18。然而,最近的研究表明,小脑不同区域对疾病的易感性存在差异11,12,19。这可能意味着在不同的小脑区域中发生了关键性的变化,而这些变化可能在使用全小脑提取物时被掩盖或无法检测到。因此,有必要开发出能够使研究人员分析不同小脑区域分子特征的技术。
本文所述技术提供了一种可重复的方法,用于分离小鼠小脑的四个不同区域,以从这些区域提取RNA,并探究基因表达的区域性差异。图1A 中的小鼠小脑示意图将蚓部标为蓝色,半球标为黄色。具体而言,该技术可实现以下四个区域的分离: 小脑深部核团(DCN)(图1A 中红色虚线框所示区域)、前部蚓部小脑皮层(CCaV)(图1A 中深蓝色区域)、后部蚓部小脑皮层(CCpV)(图1A 中浅蓝色区域)以及半球小脑皮层(CCH)(图1A 中黄色区域)。通过对这些区域的基因表达分别进行分析,将有助于研究这些不同区域各自功能背后的分子机制,以及它们在疾病中易损性方面可能存在的差异。
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1. 设置
2. 脑组织提取与解剖
所有实验均按照明尼苏达大学动物护理委员会的指南进行。
3. RNA 提取
注意:本方案改编自《冷泉港实验室方案》中的TRIzol法RNA提取方案20。TRIzol可溶解生物材料,从而实现RNA的提取。
4. 实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR)
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本实验使用了四只十一周龄的雌性野生型 C57/Black6 小鼠。其中一只小鼠用于进行完整的小脑解剖,称为“整体小脑”,以便将解剖区域中的 RNA 水平与完整解剖样本进行比较。其余三只小鼠用于执行本方案中描述的小脑解剖。使用三只小鼠可确保在不同个体间检测到的 RNA 水平变化趋势具有可重复性。
图1A 显示小鼠小脑——蚓部为蓝色,半球为黄色。图中为蚓部(前部区域为深蓝色,后部区域为浅蓝色)和半球(黄色)的矢状面示意图。DCN 用红色虚线框标出。成功的解剖操作始于将刀片沿脑组织中线进行初始切割(图1B);该步骤可指导后续六次刀片切割的准确定位(图1C)。由此可获得六个矢状切片(图1D),包括四个外侧/半球切片(紫色轮廓...
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本文所述方法可评估四个不同小脑区域内的基因表达基础及分子机制,这些区域包括小脑深部核团(DCN)、小脑蚓部前部皮层(CCaV)、小脑蚓部后部皮层(CCpV)以及小脑半球皮层(CCH)。能够分别评估这些区域将拓展我们对特定小脑区域异质性的认识,并可能揭示其在多种行为中的作用。
通过将全脑组织进行矢状面切片,可以轻松地观察和识别小脑的这四个区域,从而实现快速分离。据作者所知,这是首次描述用于分子分析的全小脑区域分离方法。在最近发表的一篇论文中,研究人员采用粗分离法获取小脑前部小叶和小脑结节小叶进行分子分析22。然而,使用该方法无法同时分离小脑深部核团(DCN)。尝试使用振动切片机切割300 μm厚的切片以获取DCN穿孔样本时,通常会遇到三个关键问题。第一,由于小脑固定位置的微小差异以及组织切片角度的不同,难以在不同动物之间重复性地分离出相同的区域。第二,固定和切片过程耗时较长,增加了RNA降解的风险,降低了后续实验中RNA样本的质量。最后,从300 μm厚的切片中获取的穿孔组织RNA得率较低。
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢Cvetanovic实验室的Austin Ferro和Juao-Guilherme Rosa在解剖技术问题排查以及RNA提取和RTqPCR实验中的帮助。本研究由M. Cvetanovic获得美国卫生与公共服务部(HHS)国家卫生研究院(NIH)R01 NS197387项目资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 微量离心管 | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% 异丙醇 | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 µl 移液器吸头 | GeneMate | P-1237-200 | |
| 成年小鼠脑切片模具(矢状面) | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| 钝头镊子 | |||
| 氯仿 | Macron | 220905 | |
| 断头剪 | |||
| 解剖剪 | |||
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| 玻璃载片(用于电泳) | BIORAD | ||
| 匀浆器 | Kimble | 6HAZ6 | |
| 冰桶 | |||
| 胰岛素注射器(0.5 ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA 反转录-qPCR 试剂盒 | BIORAD | 1725037 | |
| 微型刮勺 | |||
| 尖嘴镊 | |||
| 培养皿 | Pyrex | ||
| Aldolase C 基因 Primetime 引物 | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Kcng4 基因 Primetime 引物 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Parvalbumin 基因 Primetime 引物 | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Priming 引物 Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| 单刃剃刀刀片 | Personna GEM | ||
| 无菌一次性研磨杵 | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol 试剂 | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
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