Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

摘要

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵细胞未稀释胞质提取物的方法。

摘要

传统上用于大规模生化检测的Xenopus laevis卵提取物，现已发展成为一种强大的基于成像的工具，用于研究细胞质现象，如胞质分裂、有丝分裂纺锤体的形成以及细胞核的组装。在早期方法的基础上——这些方法通过在稀疏时间点取样并固定提取物进行成像——近年来的新方法采用延时显微镜对活体提取物进行实时成像，从而以更高的时间分辨率揭示更多动态特征。这些方法通常需要对成像容器进行复杂的表面处理。本文介绍一种无需化学表面处理即可实现卵提取物活体成像的替代方法。该方法易于实施，并利用大规模生产的实验室耗材进行成像。我们描述的系统既可用于宽场显微镜，也可用于共聚焦显微镜。该系统设计用于在二维（2D）场中对提取物进行成像，但也可轻松扩展至三维（3D）成像。它非常适合研究细胞质内的空间模式形成。通过代表性数据，我们展示了采用此方法制备的间期提取物中微管、细胞核和线粒体的典型动态组织结构。这些图像数据可提供有关细胞质动态行为和空间组织的定量信息。

引言

细胞质构成了细胞的主要体积，并具有独特的组织结构。真核细胞细胞质的组分能够自组装形成多种空间结构，例如微管星状体和高尔基体，这些结构又会根据细胞的身份和生理状态发生动态排列和更替。因此，理解细胞质的空间组织及其与细胞功能的关联，对于揭示细胞的工作机制至关重要。Xenopus laevis 卵提取物传统上被用于大规模生化分析^{1,2,3,4,5,6,7,8}，但近年来的研究已将其确立为研究细胞质结构及其细胞功能机制的有力活体成像系统^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}。这些未稀释的提取物在保留细胞质多种结构和功能的同时，允许对细胞质内容进行直接操控，而这种操控在传统的基于细胞的模型中难以实现^19,20。这使得它们成为表征细胞质现象并解析其机制基础的理想体系。

现有的提取物成像方法需要化学表面修饰，或微流控装置的制备。一种基于盖玻片的方法需要对玻璃盖玻片进行聚乙二醇（PEG）钝化处理²¹。一种基于微乳液的方法需要在玻璃表面进行三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷的气相沉积^22,23。基于微流控的系统能够精确控制提取物液滴的体积、几何形状和组成，但需要专门的微加工设施^11,12,24。

本文介绍一种用于成像卵提取物的替代方法，该方法易于实施，并使用 readily available、低成本的材料。该方法包括使用载玻片和盖玻片构建成像腔室，其中盖玻片表面涂有氟化乙烯丙烯（FEP）胶带。该腔室可用于多种显微镜系统对提取物进行成像，包括体视显微镜、直立显微镜和倒置显微镜。该方法无需对表面进行化学处理，即可实现与上述基于玻璃的现有方法相当的光学清晰度。该方法旨在对在二维视野内厚度均匀的提取物层进行成像，并可轻松扩展用于对三维体积的提取物进行成像。该方法特别适用于大视野下细胞质集体行为的延时成像。

我们使用处于间期阻滞的卵提取物来演示成像方法。提取物的制备遵循 Deming 和 Kornbluth¹⁹ 的方案。简言之，天然停滞于减数分裂 II 期中期的卵通过低速离心破碎。该离心过程使细胞质脱离减数分裂阻滞状态，从而使提取物进入间期。通常在离心破碎前加入细胞松弛素 B，以抑制 F-肌动蛋白的形成。然而，如果需要保留 F-肌动蛋白，则可省略该步骤。此外，在离心破碎前还需加入环己酰亚胺，以防止间期提取物进入下一次有丝分裂。随后将提取物置于上述成像腔室中，并放置于显微镜上。最后，通过连接显微镜的相机在设定的时间间隔内连续采集图像，获得延时图像序列，从而记录提取物在二维视野中的动态行为。

方案

本文所述所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 载玻片和盖玻片的准备

1. 使用滚轮涂布器将一层氟化乙烯丙烯（FEP）胶带粘附到玻璃载玻片上。用干净的刀片切除边缘多余的胶带。以相同方式制备涂有FEP胶带的盖玻片（图1A）。
2. 将双面粘性成像间隔垫贴附至载玻片的FEP胶带涂层面，顶部保护衬层保持未剥离状态（图1A）。
   ​注意：载玻片和盖玻片应在实验前预先制备。可立即使用，或存放于盒中以防止表面灰尘积聚。成像间隔垫中的孔深度为120 µm，直径为9 mm。

2. 间期阻滞卵提取物的制备与活体成像

注意：以下实验方案改编自 Deming 和 Kornbluth¹⁹、Murray²⁰ 以及 Smythe 和 Newport²⁵，并进行了修改。除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。

1. 在取卵前3至10天，将100 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）皮下注射至成熟的雌性Xenopus laevis青蛙的背侧淋巴囊中。
2. 在计划取卵前16至18小时，向步骤2.1中的青蛙注射500 IU的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。将青蛙置于18 °C的产卵缓冲液（100 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgSO₄·7H₂O，2.5 mM CaCl₂·2H₂O，0.5 mM HEPES，0.1 mM EDTA，配制成pH 7.4的20倍浓缩液，使用前用洁净的蛙养殖用水稀释至1倍）中，直至取卵。
3. 实验当天，在大号玻璃培养皿中收集卵子，并评估卵子质量。丢弃外观呈白色蓬松球状或成串出现的卵子（图1B）。在体视显微镜下检查卵子，保留外观正常的卵子（图1C），丢弃色素分布不规则或斑驳的卵子（图1D）。
   注意：本方案适用于从一只青蛙收集的卵子，通常在注射hCG后16小时内可产约25 mL卵子。一般使用hCG诱导3至6只青蛙，选择卵子质量最高的个体用于提取物制备实验。
4. 将卵子转移至400 mL玻璃烧杯中，通过倾倒尽可能去除产卵缓冲液。
5. 将卵子在100 mL新配制的脱胶液（2% w/v L-半胱氨酸溶于水，用NaOH调节pH至8.0）中孵育，并定期轻轻摇动。约3分钟后，倒出溶液，加入100 mL新鲜脱胶液。继续孵育直至卵子紧密堆积（卵子间无空隙），但避免脱胶液处理总时间超过5分钟。
6. 通过倾倒尽可能去除脱胶液，并用0.25x MMR缓冲液（25 mM NaCl，0.5 mM KCl，0.25 mM MgCl₂，0.5 mM CaCl₂，0.025 mM EDTA，1.25 mM HEPES，配制成10倍浓缩液，用NaOH调节pH至7.8，使用前用Milli-Q水稀释）洗涤卵子：加入缓冲液，轻轻摇动卵子，然后倒出缓冲液。重复数次，直至总共使用1 L缓冲液完成洗涤。
7. 用总共400 mL卵裂解缓冲液（250 mM蔗糖，10 mM HEPES，50 mM KCl，2.5 mM MgCl₂，1 mM DTT，现配并用KOH调节pH至7.7）洗涤卵子数次。在每次洗涤之间，用巴斯德移液管去除外观异常的卵子。
   注意：外观异常的卵子指呈白色蓬松球状（图1B）、色素斑驳（图1D）、出现白色区域扩大的退化现象（图1E），或动物极色素区域变暗并收缩的卵子（图1F）。
8. 使用尖端剪宽的移液管，将卵子转移至含有1 mL卵裂解缓冲液的17 mL圆底离心管中。在临床离心机中以400 × g离心15秒，使卵子压紧。
9. 用巴斯德移液管尽可能从压紧的卵子上层去除卵裂解缓冲液。
   注意：必须尽可能去除压紧卵子中的缓冲液，以最大限度减少卵提取物的稀释。有时需连同残留缓冲液一起去除部分松散的卵子以实现此目的。
10. 测定压紧卵子的近似体积，然后直接在压紧的卵子上层加入5 µg/mL抑蛋白酶肽（aprotinin）、5 µg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、5 µg/mL细胞松弛素B（cytochalasin B）和50 µg/mL环己酰亚胺（cycloheximide）。
    注意：抑蛋白酶肽和亮抑蛋白酶肽为蛋白酶抑制剂。细胞松弛素B抑制肌动蛋白聚合，防止提取物收缩和凝胶化²⁶。环己酰亚胺抑制蛋白质合成，从而使提取物保持在细胞周期的间期。
11. 将离心管置于摆桶转子中，在4 °C下以12,000 × g离心15分钟，破碎卵子。
    注意：离心结束后，卵子应已破裂，裂解物分为三层主要结构：顶部为黄色脂质层，中间为细胞质提取物（也称粗提物），底部为含有色素颗粒的深色致密层（图1G）。
12. 将18号针头连接至注射器。针尖斜面朝上，从离心管侧面刺入细胞质层底部，缓慢吸取提取物。
    注意：应缓慢吸取细胞质提取物，以避免混入上层黄色脂质层的污染物。
13. 将收集的细胞质提取物转移至新的微量离心管中，置于冰上保存。提取物应在1小时内使用。
14. 准备成像时，向提取物中加入所需的试剂和荧光成像探针。
    注意：荧光成像探针可标记特定的细胞质结构，使其能在荧光显微镜下被观察到。
15. 移除步骤1.2中制备的载玻片上成像间隔片的顶部保护膜，在孔中央滴加约7 µL提取物。立即盖上FEP膜涂层的盖玻片，使FEP面朝向提取物以密封孔位。迅速进行成像（图1H，I）。
16. 将载玻片置于配备电动载物台和数字相机的倒置或正置显微镜上。在明场和荧光通道中，按所需的空间位置和时间间隔对提取物进行成像。
    注意：通常使用5倍物镜进行成像。电动载物台可实现多个预设空间位置的自动图像采集。明场显微镜可基于透明度差异观察细胞质结构。荧光显微镜可观察在步骤2.14中加入的荧光成像探针所特异性标记的细胞质结构。相机记录这些结构的时间序列图像，从而捕捉细胞质组织的动态变化。

结果

Xenopus laevis 卵提取物可用于研究间期细胞质的自组织过程。图2A 展示了一项成功实验的结果。我们将去膜的 Xenopus laevis 精子核¹⁹ 以 27 个核/µL 的浓度以及 0.38 µM 纯化的 GST-GFP-NLS^27,28,29,30（由谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白和核定位序列组成的融合蛋白）添加到处于间期阻滞的提取物中，以实现间期细胞核的重建与可视化。同时加入 1 µM 荧光标记的微管蛋白以观察微管，以及 500 nM MitoTracker Red CMXRos 以观察线粒体。提取物放入成像室后不久，细胞质呈现无序状态。在室温下持续观察的...

讨论

Xenopus laevis 卵提取物已成为基于成像研究的强大模型系统 各种亚细胞结构的研究^{10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
17 ml 离心管	Beckman Coulter	337986
22x22 mm 方形 #1 盖玻片	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	蛋白酶抑制剂
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	蛋白质合成抑制剂
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	肌动蛋白聚合抑制剂
雌性 Xenopus laevis 青蛙	Nasco	LM00535MX
荧光 HiLyte 488 标记微管蛋白	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	用于可视化微管细胞骨架
荧光 HiLyte 647 标记微管蛋白	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	用于可视化微管细胞骨架
氟化乙烯丙烯（FEP）光学透明胶带	CS Hyde company	23-FEP-2-5
玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20C
人绒毛膜促性腺激素（hCG）	MilliporeSigma	CG10
成像垫片	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	蛋白酶抑制剂
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-518-100B
矿物油	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	用于可视化线粒体
孕马血清促性腺激素（PMSG）	BioVendor	RP1782725000
滚轮涂布器	Amazon	B07HMBJSP8	用于将 FEP 胶带贴附至玻璃载玻片和盖玻片
单刃剃须刀片	Fisher Scientific	12-640	用于去除多余的 FEP 胶带
移液吸头	Fisher Scientific	13-711-7M