Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

Xianrui Cheng; James E. Ferrell, Jr.

doi:10.3791/61923

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方法文章

Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

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DOI：

10.3791/61923

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2021年6月6日

Xianrui Cheng¹^,² , James E. Ferrell, Jr.¹^,³

¹Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, ²Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, ³Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵细胞未稀释胞质提取物的方法。

摘要

传统上用于大规模生化检测的Xenopus laevis卵提取物，现已发展成为一种强大的基于成像的工具，用于研究细胞质现象，如胞质分裂、有丝分裂纺锤体的形成以及细胞核的组装。在早期方法的基础上——这些方法通过在稀疏时间点取样并固定提取物进行成像——近年来的新方法采用延时显微镜对活体提取物进行实时成像，从而以更高的时间分辨率揭示更多动态特征。这些方法通常需要对成像容器进行复杂的表面处理。本文介绍一种无需化学表面处理即可实现卵提取物活体成像的替代方法。该方法易于实施，并利用大规模生产的实验室耗材进行成像。我们描述的系统既可用于宽场显微镜，也可用于共聚焦显微镜。该系统设计用于在二维（2D）场中对提取物进行成像，但也可轻松扩展至三维（3D）成像。它非常适合研究细胞质内的空间模式形成。通过代表性数据，我们展示了采用此方法制备的间期提取物中微管、细胞核和线粒体的典型动态组织结构。这些图像数据可提供有关细胞质动态行为和空间组织的定量信息。

引言

细胞质构成了细胞的主要体积，并具有独特的组织结构。真核细胞细胞质的组分能够自组装形成多种空间结构，例如微管星状体和高尔基体，这些结构又会根据细胞的身份和生理状态发生动态排列和更替。因此，理解细胞质的空间组织及其与细胞功能的关联，对于揭示细胞的工作机制至关重要。Xenopus laevis 卵提取物传统上被用于大规模生化分析¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸，但近年来的研究已将其确立为研究细胞质结构及其细胞功能机制的有力活体成像系统⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,....

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方案

本文所述所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 载玻片和盖玻片的准备

使用滚轮涂布器将一层氟化乙烯丙烯（FEP）胶带粘附到玻璃载玻片上。用干净的刀片切除边缘多余的胶带。以相同方式制备涂有FEP胶带的盖玻片（图1A）。
将双面粘性成像间隔垫贴附至载玻片的FEP胶带涂层面，顶部保护衬层保持未剥离状态（图1A）。
注意：载玻片和盖玻片应在实验前预先制备。可立即使用，或存放于盒中以防止表面灰尘积聚。成像间隔垫中的孔深度为120 µm，直径为9 mm。

2. 间期阻滞卵提取物的制备与活体成像

注意：以下实验方案改编自 Deming 和 Kornbluth¹⁹、Murray²⁰ 以及 Smythe 和 Newport²⁵，并进行了修改。除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。

在取卵前3至10天，将100 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）皮下注射至成熟的雌性X....

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结果

Xenopus laevis 卵提取物可用于研究间期胞质的自组织过程。图2A 展示了一项成功实验的结果。我们将去膜的 Xenopus laevis 精子核¹⁹ 以 27 个核/µL 的浓度和 0.38 µM 纯化的 GST-GFP-NLS²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰（由谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白和核定位信号组成的融合蛋白）添加到处于间期阻滞的提取物中，以实现间期细胞核的重建与可视化。同时加入 1 µM 荧光标记的微管蛋白以观察微管，以及 500 nM MitoTracker Red CMXRos 以观察线粒体。提取物放入成像室后不久，胞质呈现无序状态。在室温下经过约30分钟后.......

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讨论

Xenopus laevis 卵提取物已成为基于成像研究的强大模型系统各种亚细胞结构的研究¹⁰^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,²¹^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 J. Kamenz、Y. Chen 和 W. Y. C. Huang 对手稿提出的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院资助（R01 GM110564、P50 GM107615 和 R35 GM131792），授予 James E. Ferrell, Jr.。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
17 ml 离心管	Beckman Coulter	337986
22x22 mm 方形 #1 盖玻片	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	蛋白酶抑制剂
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	蛋白质合成抑制剂
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	肌动蛋白聚合抑制剂
雌性 Xenopus laevis 青蛙	Nasco	LM00535MX
荧光 HiLyte 488 标记微管蛋白	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	用于可视化微管细胞骨架
荧光 HiLyte 647 标记微管蛋白	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	用于可视化微管细胞骨架
氟化乙烯丙烯（FEP）光学透明胶带	CS Hyde company	23-FEP-2-5
玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20C
人绒毛膜促性腺激素（hCG）	MilliporeSigma	CG10
成像垫片	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	蛋白酶抑制剂
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-518-100B
矿物油	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	用于可视化线粒体
孕马血清促性腺激素（PMSG）	BioVendor	RP1782725000
滚轮涂布器	Amazon	B07HMBJSP8	用于将 FEP 胶带贴附至玻璃载玻片和盖玻片
单刃剃须刀片	Fisher Scientific	12-640	用于去除多余的 FEP 胶带
移液吸头	Fisher Scientific	13-711-7M

参考文献

Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54

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