一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

摘要

本文介绍了一种将寡核苷酸（如小干扰RNA（siRNA）、microRNA模拟物（miRs）或抗microRNA（anti-miR））导入成熟脂肪细胞以调控蛋白质和microRNA表达的实验方案。

摘要

脂肪细胞功能的改变参与了包括2型糖尿病和胰岛素抵抗在内的代谢性疾病的发病机制。这凸显了深入理解脂肪细胞功能障碍相关分子机制的必要性，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。调控蛋白质和微小RNA（micro-RNAs）的表达 在 脂肪细胞的培养与操作仍极具挑战性。本文介绍了一种将小鼠成纤维细胞分化为成熟脂肪细胞的方案，并通过使用小干扰RNA（siRNA）和micro-RNA模拟物（miR mimic）寡核苷酸进行反向转染，以调控成熟脂肪细胞中蛋白质和micro-RNA的表达。该反向转染方案包括：先在细胞培养板中将转染试剂与寡核苷酸孵育形成复合物，随后将成熟脂肪细胞加入其中。脂肪细胞在寡核苷酸/转染试剂复合物存在的情况下重新贴附于培养板表面。转染后的3T3-L1成熟脂肪细胞可用于胰岛素信号通路、葡萄糖摄取、脂质生成及脂解等功能分析，以研究蛋白质或micro-RNA调控对脂肪细胞功能的影响。

引言

肥胖被认为是多种代谢性疾病的主要风险因素，包括胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2D）和心血管疾病¹。目前的治疗方法未能遏制这些疾病日益增长的发病率，肥胖和糖尿病患者的胰岛素抵抗管理仍然是重要的临床问题。脂肪组织在能量稳态调控中起关键作用，其在肥胖状态下的病理性扩张会促进胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生^2,3。这凸显了深入理解脂肪细胞功能障碍相关分子机制的必要性，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。许多研究已探讨了编码蛋白质的RNA在脂肪细胞生理功能中的作用及其与肥胖的关联。

近年来，非编码RNA（ncRNA），尤其是微小RNA（miR）的发现，推动了基因表达调控机制相关新概念的形成。研究表明，ncRNA是脂肪细胞功能的重要调控因子，其表达失调在代谢性疾病中发挥重要作用⁴。因此，调控脂肪细胞中蛋白质和ncRNA的表达对于解析其在脂肪细胞功能中的作用及其对2型糖尿病（T2D）等病理过程的影响至关重要。然而，在体内以及原代脂肪细胞中调控蛋白质和ncRNA的表达仍极具挑战性，这促使研究者更倾向于使用体外脂肪细胞模型。

小鼠3T3-L1成纤维细胞可轻松分化为成熟、有功能且对胰岛素敏感的脂肪细胞，这是一种被广泛研究的细胞系，常用....

方案

注意：所有实验步骤均须在超净细胞培养工作台中采用无菌技术进行。有关所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 小鼠3T3-L1成纤维细胞向脂肪细胞的分化

1. 在100 mm培养皿中使用不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10%新生小牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养3T3-L1成纤维细胞（图1A）。将培养皿置于组织培养孵箱中（7% CO₂，37 °C）。
2. 细胞融合后两天，更换培养基，改为含0.25 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、0.25 µM地塞米松、5 µg/mL胰岛素和10 µM罗格列酮的DMEM培养基（不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素）。
   注意：当每100 mm培养皿接种300,000个细胞时，通常需要5天达到融合状态。
3. 两天后，更换为含5 µg/mL胰岛素和10 µM罗格列酮的DMEM培养基（不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素），继续孵育2天。随后每隔两天用不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基更换培养液（图1B）。
4. 在诱导分化程序开始后7–8天转染....

结果

采用此处所述的反向转染方法在3T3-L1脂肪细胞中调控蛋白或微小RNA的表达后，已证实脂肪细胞在转染后仍能保持其形态图1B，C）。事实上，转染后2天，脂肪细胞已充分铺展并贴附于培养板上，呈现出多房性脂滴，这是成熟3T3-L1脂肪细胞的典型特征。转染与未转染的脂肪细胞之间的脂质含量无显著差异。图1D，E）。此外，分化标志物的mRNA表达，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（Pparγ2), 脂联素 （Adipoq），葡萄糖转运蛋白4或溶质载体家族2成员4（Slc2a4），胰岛素受体底物1（Irs1），脂滴包被蛋白-1（perilipin-1）Plin1) 与未转染的脂肪细胞相比，在转染细胞中保持不变（图1F。这种反向转染方案效.......

讨论

本文介绍了一种成熟脂肪细胞分化与转染的详细实验方案。这种反向转染方法是一种简单、经济且高效的手段，可用于将寡核苷酸（包括但不限于siRNA、micro-RNA模拟物和抗micro-RNA）转染入3T3-L1脂肪细胞，而3T3-L1是公认最难转染的细胞系之一。该方法存在一些需要考虑的局限性。本方案在质粒DNA转染方面效率较低，因此限制了其在功能获得性研究中的应用。尽管包括3T3-L1细胞系在内的小鼠细胞系通常被用于体外研究脂肪细胞功能，但小鼠组织中micro-RNA的表达模式和活性常与人类存在差异；这一情况在原代细胞和细胞系中均存在。此外，将3T3-L1成纤维细胞诱导分化为脂肪细胞所使用的培养基需要包含非生理性的激素混合物（胰岛素、地塞米松、IBMX和罗格列酮），且分化后的细胞在形态上与体内成熟的脂肪细胞明显不同：它们呈现多房性脂滴，而非单房性脂滴。这可能解释了体外与体内研究之间在基因表达和细胞反应方面存在的一些差异。

与电穿孔相比，使用这种反向转染方法的一个优势在于成本较低。实际上，该方法所用试剂价格更低，且反向转染的高效率减少了所需寡核苷酸的用量，同时无需电穿孔仪等昂贵设备。此外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔组织培养板	Dutscher	353043
2.5% 胰蛋白酶（10倍浓缩液）	Gibco	15090-046	用 D-PBS 稀释至 5 倍体积
2-丙醇	Sigma	I9516
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	D5879
Accell 非靶向对照组	Horizon Discovery	D-001910-10-05
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A7030
牛皮I型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C8919
地塞米松	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
杜尔贝科的  改良型伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	41965062	4.5 g/L D-葡萄糖；L-谷氨酰胺；不含丙酮酸盐
乙醇	Sigma	51976
FAM标记的阴性对照si-RNA	Invitrogen	AM4620
胎牛血清	Gibco	10270-106
游离甘油检测试剂	Sigma-Aldrich	F6428
甘油标准溶液	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 抗体	圣克鲁斯	sc-131119	稀释倍数：0.5 µg/mL
优化型最低基本培养基（Opti-MEM）	Gibco	31985-047
胰岛素，人重组	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA 模拟物	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT试剂盒	Qiagen	218161
miScript 引物检测 Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript 引物检测 Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR 试剂盒	Qiagen	219073
新生牛血清	Gibco	16010-159
油红O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus 小鼠 Plin1 siRNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
青霉素和链霉素	Gibco	15140-122
Perilipin-1 抗体	细胞信号传导	3470	稀释比例：1/1000
培养皿 100 mm × 20 mm	Dutscher	353003
PKB 抗体	细胞信号传导	9272	稀释比例：1/1000
PKB 磷酸化 Thr308 抗体	细胞信号传导	9275	稀释比例：1/1000
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408
转染试剂（INTERFERin）	Polyplus	409-10
α-tubulin 抗体	Sigma-Aldrich	T6199	稀释倍数：0.5 µg/mL
Vamp2 抗体	R&D Systems	MAB5136	稀释倍数：0.1 µg/mL