本文提供了三种简便且易于操作的检测方法，用于评估小鼠的脂质代谢。
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本文内容
摘要
摘要
评估脂质代谢是评价代谢功能的核心环节，对于体内代谢研究具有重要意义。脂质是一类包含多种不同分子的物质，其合成与代谢涉及众多代谢通路。在营养与肥胖研究中，亟需一种评估脂质稳态的起始方法。本文介绍了三种简便易行的技术，操作无需复杂经验或长期训练，大多数实验室均可采用这些方法对小鼠的脂质代谢异常进行初步筛查。这些方法包括：（1）利用商用试剂盒检测多种空腹血清脂质分子；（2）通过口服 Intralipid 耐受试验评估小鼠对膳食脂质的处理能力；（3）检测小鼠对药物化合物 CL 316,243 的反应。综合运用这三种方法，可全面了解小鼠脂质代谢与处理能力的整体状况。
引言
碳水化合物和脂质是能量代谢的两种主要底物。脂质代谢异常会导致多种人类疾病，包括2型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝病和癌症。膳食中的脂质主要是甘油三酯，通过肠道吸收进入淋巴系统，并在靠近心脏处以乳糜微粒的形式进入静脉循环1。在血液中，脂质由脂蛋白颗粒运输，其脂肪酸组分在外周器官（如肌肉和脂肪组织）中通过脂蛋白脂肪酶的作用被释放出来2。剩余的富含胆固醇的残余颗粒则由肝脏清除3。小鼠在实验室中被广泛用作研究脂质代谢的动物模型。由于其拥有完善的遗传操作工具和相对较短的繁殖周期，小鼠成为研究脂质吸收、合成与代谢机制的有力模型。
由于脂质代谢的复杂性，通常需要采用复杂的脂质组学研究或同位素示踪研究来定量分析脂质种类集合或与脂质相关的代谢通量及去向4,5。这对于缺乏专业设备或专业知识的研究人员而言构成了巨大挑战。本文中，我们提出了三种检测方法，可在采用技术上更具挑战性的技术之前作为初步测试。这些方法对小鼠而言属于非终末性操作，因此在识别脂质处理能力的潜在差异以及缩小受影响的代谢过程范围方面非常有用。
首先，检测空腹血清中的脂质分子有助于确定小鼠的整体脂质谱。小鼠应进行禁食，因为许多....
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方案
动物饲养在标准化环境中，遵循贝勒医学院（BCM）机构动物护理和使用委员会批准的动物护理和实验方案。动物饲喂标准或特殊饮食，自由饮水，并维持12小时昼夜循环。
1. 空腹血清脂质的测定
- 在下午5点后将小鼠转移至新笼子，仅提供自由饮水，禁食过夜（实验前约禁食16小时）。过夜禁食可确保小鼠胃肠道完全排空。
注意：小鼠在禁食期间会进食粪便，因此仅撤除食物无法确保其充分禁食。 - 次日早晨，抓住小鼠尾巴并将其放置于平面上。轻柔向后拉小鼠尾巴，使其进入固定器中。安装鼻部固定装置以限制小鼠活动，同时确保其仍可正常呼吸。旋紧鼻部固定装置的旋钮。观察胸部运动，确认动物呼吸正常，并尽量减少小鼠在固定器中的停留时间。
- 对自由活动的小鼠尾静脉进行浅表切口（划破），从切口处用玻璃毛细管采集25 µL血液（约填充毛细管的1/3），采集过程中无需固定小鼠。迅速将血液吹入微量离心管中。
- 使用止血粉止血，向笼中补充饲料，并确保小鼠无任何 应激迹象。
- 完成所有小鼠的采血操作。
- 将血液在室温下静置1小时，使其充分凝固。随后在4 °C条件下，以2,000 × g离心10分钟（使用冷冻台式微量离心机），收集上清液（血清）用于分析。
注意：血清可在–20 °C下保存数周直至分析；如需长期保存，应置于–70 °C。 - 按照试剂盒制造商提供的操作规程....
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结果
我们通过三个实验片段说明，每种检测方法均可提供有关小鼠脂质代谢的有价值信息。对于8周龄开始接受高脂饮食（HFD）喂养8周的C57BL/6J雄性小鼠，其总胆固醇水平显著升高，而血清甘油三酯和游离脂肪酸（NEFA）水平则未见显著变化（表1），提示血液中的甘油三酯和NEFA并非主要受饮食脂肪挑战的调控。在第二组实验中，C57BL/6J和C57BL/6N两个C57BL/6亚系小鼠均从8周龄开始接受HFD喂养8周，随后进行口服Intralipid负荷试验并比较其血清甘油三酯水平。结果显示，6N与6J亚系之间存在显著差异：6J亚系在Intralipid给药后血清甘油三酯水平的峰值显著更高，提示其甘油三酯吸收增强或清除速度明显减慢（图1）。最后，对于8周龄、饲喂普通饲料（NC）的雄性C57BL/6J小鼠，单次给予CL 316,243（1 mg/kg体重）可导致血清甘油显著升高；然而，连续一周每日腹腔预注射1 mg/kg体重的CL 316,243后，小鼠对CL 316,243的反应减弱，提示这些小鼠已对CL 316,243产生了耐受性（图2）。
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讨论
文中所述三种检测方法在实验室中均能稳定运行，但需注意几个关键事项。测定空腹血清脂质水平和口服脂肪乳耐受试验均需过夜禁食。进行口服脂肪乳耐受试验时，必须在室温下离心血液，以尽量减少脂肪层的形成，尤其是在1小时和2小时时间点；若脂肪层形成，切勿弃去。转移上清液时应同时保留脂质层，并轻柔吹打混匀，用于甘油三酯测定。
空腹血清脂质水平的解读
研究表明，禁食会降低小鼠的总胆固醇水平7，而长期摄入高 脂肪含量的饮食则会升高总胆固醇水平8。胆固醇主要有两种类型：高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。在人类中，HDL-C 被视为“有益”脂质，它可携带胆固醇并将其转运至肝脏，从而排出体外。LDL-C 构成了人体血清中大部分的胆固醇，可在动脉中积聚，导致主要动脉疾病。然而，小鼠缺乏一种关键酶——胆固醇酯转运蛋白（CETP）9，该酶介导 HDL 与载脂蛋白 B 脂蛋白（apoB.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号R00-DK114498，以及美国农业部（USDA）资助，项目编号CRIS: 3092-51000-062，授予Y. Z.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20% 英脱利匹特（Intralipid） | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip 无菌注射器 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 水合物 | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| 弯曲饲喂针头（18 规） | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| 游离甘油试剂 | Sigma Aldrich | F6428 | |
| 甘油标准溶液 | Sigma | G7793 | |
| HR 系列 NEFA-HR(2)显色试剂 A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR 系列 NEFA-HR(2)显色试剂 B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR 系列 NEFA-HR(2)溶剂 A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR 系列 NEFA-HR(2)溶剂 B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus 化学测定参考试剂盒 | Verichem | 9500 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| 微 hematocrit 毛细管，未肝素化 | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA 标准溶液 | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific 甘油三酯试剂 | Fisher Scientific | TR22421 | |
| 总胆固醇试剂 | Thermo Scientifi | TR13421 |
参考文献
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
- Williams, K. J.
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