将小鼠大脑显微切割成功能和解剖学上不同的区域

Summary

我们提出了一个动手的，一步一步的，快速的方案，用于从新鲜脑组织中去除小鼠大脑和解剖离散区域。获取用于分子分析的大脑区域已成为许多神经科学实验室的常规。这些大脑区域立即被冷冻，以获得高质量的转录组学数据，用于系统级分析。

Abstract

大脑是哺乳动物神经系统的指挥中心，也是一个具有巨大结构复杂性的器官。大脑在颅骨内受到保护，由半球上的灰质外层覆盖物组成，称为大脑皮层。在这一层之下，还有许多其他专门的结构，这些结构对于对存在很重要的多种现象至关重要。获取特定大脑区域的样本需要快速而精确的解剖步骤。据了解，在微观层面上，存在许多子区域，并且可能跨越我们为了这种解剖而强加的任意区域边界。

小鼠模型通常用于研究人脑功能和疾病。基因表达模式的变化可能仅限于针对特定表型的特定大脑区域，具体取决于患病状态。因此，研究转录对其明确定义的结构组织的调节非常重要。要完全了解大脑，需要研究不同的大脑区域，定义连接，并确定每个大脑区域活动的关键差异。对这些不同区域中的每一个进行更全面的了解，可以为神经科学领域的新的和改进的治疗方法铺平道路。在这里，我们讨论了将小鼠大脑解剖成十六个不同区域的分步方法。在这个过程中，我们专注于雄性小鼠C57Bl / 6J（6-8周龄）大脑切除并解剖到多个区域，使用神经解剖学标志来识别和采样离散的功能相关和行为相关的大脑区域。这项工作将有助于在神经科学领域奠定坚实的基础，从而在更深入地了解大脑功能方面采取更有针对性的方法。

Introduction

大脑与脊髓和视网膜一起组成执行复杂行为的中枢神经系统，由整个身体中专门的，精确定位和相互作用的细胞类型控制¹。大脑是一个复杂的器官，有数十亿个相互连接的神经元和神经胶质细胞，具有执行许多功能的精确电路。它是一种双侧结构，具有两个不同的叶和不同的细胞成分²。脊髓将大脑与外部世界连接起来，并受到骨骼，脑膜和脑脊液的保护，并将信息路由到大脑和从大脑路由^{信息2，3，4}。大脑的表面，大脑皮层，是不平坦的，有不同的褶皱，称为回，凹槽，称为沟，将大脑分成功能中心⁵。大脑功能较弱的哺乳动物的大脑皮层为^6，7。重要的是要表征和研究人脑的结构，以了解与不同大脑区域相关的疾病及其功能回路。近年来，神经科学研究不断扩大，各种实验方法被用于研究大脑的结构和功能。分子和系统级生物学领域的发展开创了探索大脑结构与分子功能之间复杂关系的新时代。此外，分子生物学，遗传学和表观遗传学正在迅速扩展，使我们能够提高我们对系统如何运作所涉及的潜在机制的知识。这些分析可以在更本地化的基础上进行，以帮助针对性地研究和开发更有效的治疗方法。

哺乳动物的大脑在结构上被定义为清晰可辨的离散区域;然而，这些离散结构的功能和分子复杂性尚未得到明确理解。脑组织的多维和多层次性质使得这种景观难以在功能水平上进行研究。此外，多个功能由相同的结构执行，反之亦然，这一事实使对大脑⁸的理解进一步复杂化。至关重要的是，为大脑区域的结构和功能表征而执行的实验方法使用精确的研究方法来实现将神经解剖学结构与功能相关联的采样的一致性。最近使用单细胞测序^9，10 解释了大脑的复杂性，例如人脑的颞回，它由75种不同的细胞类型¹¹组成。通过将这些数据与来自小鼠大脑类似区域的数据进行比较，该研究不仅揭示了其结构和细胞类型的相似性，而且还揭示了差异。因此，为了解开复杂的机制，必须完全精确地研究大脑的不同区域。人类和小鼠大脑之间的保守结构和功能使得能够使用小鼠作为阐明人脑功能和行为结果的初步替代品。

随着系统生物学方法的进步，从啮齿动物的离散大脑区域获取信息已成为神经科学研究的关键程序。虽然一些协议如激光捕获显微切割¹² 可能很昂贵，但机械协议是廉价的，并且使用常用的工具^13，14执行。我们已经使用多个大脑区域进行转录组学测定¹⁵ ，并开发了一种动手和快速的程序，可以在短时间内逐步解剖感兴趣的小鼠大脑区域。解剖后，这些样品可以立即储存在寒冷的条件下，以保存这些组织的核酸和蛋白质。我们的方法可以更快地执行，从而实现高效率，并减少组织恶化的机会。这最终增加了使用脑组织产生高质量，可重复实验的机会。

Protocol

动物处理和实验程序是根据欧洲，国家和动物护理机构指南进行的。所有动物实验均由美国陆军环境卫生研究中心（现为沃尔特里德陆军研究所（WRAIR）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并在实验室动物护理国际评估和认证协会（AAALAC）认可的设施中进行。
注意:该程序将在6至8周龄的C57BL / 6j菌株上进行，该菌株因宫颈脱位¹⁶而安乐死。我们的实验室没有进行灌注，但可以修改该方案，从而可以进行灌注以清除脉管系统中的血液。解剖所需的所有耗材都列在 材料表中。解剖分为三个部分，包括切除大脑，切除垂体和脑夹层。脑组织收集的目的是在RNA提取后处理它们以进行转录组测定。一旦解剖了大脑区域，我们立即将每个大脑区域转移到已经标记的冷冻瓶中，然后将小瓶储存在液氮或-80°C中。
注意:神经解剖学的透彻知识对于执行此过程至关重要。水平和纵向部分，以及通常的横向部分，应该学习和学习。由于脑组织降解非常快，因此在执行此过程时没有时间查阅图谱。

1. 小鼠脑部切除

1. 用止血剂夹住被斩首头部的上颌骨（图2i），并使用纱布垫将头皮反射在颅骨背上进一步形成干燥的视野（图2ii）。
2. 将精细弯曲的剪刀插入大孔中以分离粘附的脑膜。在这里，将剪刀插入颅底的开口处是大孔，脊髓通过时刀片垂直指向（12点钟位置），但平行并压在基板骨的内表面（即枕骨鳞片）上，并将刀片向左旋转四十五°，然后向右旋转。
3. 继续旋转手腕以撬开基底板骨，基底板骨将剪切剩余骨的中间，继续进入枕骨和顶骨，左右撬动骨骼，直到它们被移除。以类似的方式，取出枕骨和顶骨以暴露小脑。
   注意:此时，除非解剖垂体的后叶和前叶，否则可以切除颅骨腹侧后部的空心骨结构，该结构包括中耳和内耳的一部分（图2iii）。
4. 使用弯曲的锋利剪刀刀片移除颞骨上的肌肉附着物。将弯曲的锋利剪刀的一个肢体放在穿透横窦和矢状窦的交界处的兰氏缝合线下（图2iv）。
5. 将剪刀沿矢状缝合线向矢中部向上推进，并非常轻柔地切割，同时小心地向上抬起以避免大脑皮层撕裂。这是该过程中的一个关键步骤（图 2v）。
6. 在此步骤中，顶骨被抬起并旋转，从而刮擦骨的内表面以识别和切割剩余的脑膜附件。抓住颞骨向外窥探，远离大脑。使用弯曲的剪刀或眶骨从每侧取出额骨，并以与眼眶嵴的直角切开冠状，但不要超过中线（图2vii）。
7. 在矢状面上使两个切口平行且相距约4毫米（图2viii）。
   注:不要一次描边切割两面。
8. 去除额骨碎片，避免撕裂脑表面（图2ix）。此时，使用细剪刀切割硬脑膜，这应该可以在嗅球之间接近。
9. 轻轻地倒置颅骨，让重力帮助切除大脑，同时继续识别和切割剩余的脑膜附件和颅神经。大脑将通过切割附着在大脑上的最大三叉神经来释放，并且从髑骨的底部清晰可见（图2x）。
   注意:将大脑转移到冷盐水溶液（冰冷的无RNase柠檬酸钠（0.9%）或生理（0.9%）盐水）中进一步解剖。

2. 垂体前后夹层

注意:垂体被非常坚韧的帐篷状膜覆盖，脊在左右三叉神经之间横向延伸。这些结构非常柔软和细腻，因此，建议直接从颅骨分阶段分阶段分离垂体后叶和前叶。 解剖后，立即将相应的垂体转移到预先标记的小瓶中，并将小瓶储存在液氮中，否则优选-80°C。 垂体正好位于枕骨和基底骨的交界处;如果它们弯曲，垂体结构就会被破坏。

1. 保持听觉大疱完整，以确保垂体解剖结构完整且易于识别（图2ix）。
2. 从颅骨的其余部分切除垂体后叶，然后解剖垂体前叶。
3. 在膜状帐篷的脊部两侧做一个非常小的矢状突切口，并用超细镊子抬起垂体后叶，注意不要破坏垂体前叶组织（图2x）。
4. 在垂体前叶的侧缘和最近的三叉神经之间做一个矢状切口，然后抬起垂体前叶（图2x）。

3. 小鼠脑部解剖

注意:在脑和垂体切除后，立即在预冷的不锈钢块上进行进一步的解剖（图3）。解剖后，将脑区域转移到预先标记的小瓶中，并将小瓶优选转移到液氮中，否则为-80°C。 自上而下方法产生的结构（按时间顺序）可能包括:小脑（CB），脑干/后脑（脑桥和延髓）（HB），嗅球（OB）作为辅助嗅球，内侧前额叶皮层（MPFC），外侧前额叶皮质（FCX），前后纹状体（ST），腹侧纹状体（VS）由伏隔核（NAC）和嗅觉结节（OT），组成。 鼻中隔（SE），视前区域，梨状皮质（PFM），下丘脑（HY），杏仁核（AY），海马体（HC），后扣带皮层（CNG），内嗅皮层（ERC），中脑（MB）与丘脑和大脑皮层的其余部分（ROC）（表1）。将按照隔离的顺序讨论特定区域，使用单个半球。

1. 在从髑髅地中取出大脑时要格外小心，因为如果有任何撕裂伤，地标可能会被摧毁。在此步骤中，使用面部防护装置（特别是 7 倍珠宝遮阳板）进行所有解剖，并由位于每个切片者肩膀上的手术灯提供照明。大部分解剖将使用钝型小弯曲镊子（即Graefe镊子）完成。
2. 将大脑放在不锈钢块上（图4i 和 图4ii）。用冰块和冰冷的盐水溶液包围它，保持块的低温。定期用冰冷的盐水溶液润湿组织以保存结构。
3. 将大脑定位为大脑皮层朝上的位置。使用小弯曲的镊子，通过暴露上，中小脑蒂和下小脑蒂轻轻地反射CB并去除 CB （图4iii 和 图4iv）。
4. 从背侧开始，在 OB 和大脑半球之间进行矢状中切口（图4v），并确保不要延伸到比前部更远的地方。此时，蚯虫可以很容易地从侧部分离出来， HB 将通过脑桥前缘的冠状切口获得。
5. 通过脑桥后缘的冠状切口将延髓分开。
   注意:此时，间脑，前脑的后部，包含上丘脑，丘脑，下丘脑和腹侧丘脑以及第三脑室，将向腹侧翻转，并且矢状突中切将由视交叉糠孔制成。解剖大脑半球，然后从其中一个半球中取出 OB 将在此步骤中进行（图4v 和 图4vi）。
6. 在进一步解剖间脑之前分离大脑半球（图4v）（图4v）。背部方法将通过仔细的钝性解剖来保留关键突出的中线地标。在切断每个半球间连接之前，请先可视化它们，因为这将最大限度地减少偏离中线的可能性。
   注意:在此步骤中，可以保留大脑半球（半脑）中的一个，第二个半球可用于进一步解剖
7. 将小的弯曲镊子的闭合刀片滑入胼胝体下方，轻轻展开以双侧缩回新皮层。胼胝体是连接两个半球的宽带，通过捏镊子可以钝解剖，而不会干扰位于下方的中线结构。
   注意:半球的中庭面将具有多个可见的地标，例如有髓结构，如胼胝体属，前部和前部。此外，虽然在中线外侧几毫米处，但乳腺丘脑束和后屈束也可能可见。
8. 将穿过中线的多个结构一分为二。这将包括胼胝体、前穹窿、腹侧穹窿、后穹窿、背前穹窿、上切除、上丘脑、腹侧穹窿和丘脑周围纤维。
9. 在中间线或中间线附近的此步骤中要特别小心，这些中线可能会受到背入法的部分损害。如果不仔细执行，所有随访结构都处于危险之中。
10. 移除OB （楔形和较浅的颜色）和附属嗅球，然后通过冠状切口收集 MPFC （扣带皮层区域1，前缘，下颌，内眶和次级运动皮质[M2]）和 FCX ，该冠状切口位于胼胝属前1mm处（图4vii）。将所得部分除以从内侧到外侧表面距离的1/3的薄板切口，内侧产生 MPFC ，横向产生FCX的其余部分。扣带皮层是MPFC的小鼠类似物。
    注意:这个组织切片还将包含少量的M2（次级运动皮层） ¹⁷ ，并且是不可避免的。
11. 在前交叉层的水平上进行冠状切口，导致前交叉部分前肢在所得冠状部分的喙面上的横截面中可见，而横截面将在该部分的尾部显示这是 NAC¹⁸的确认性标志。 VS 由 NAC 和 OT 组成。
    注意:除了前交叉段的横段外，还有一个前肢，称为前交叉，即前肢。
12. 从侧脑室前角下方的中线水平切除前交叉的横截面部分，以释放背侧隔膜核和 VS 腹侧。从侧表面上取出少量皮质， NAC 和 OT 将被移除。
13. 通过外部囊外侧的弯曲手术刀切口将 ST 的喙部分与上覆皮层分开，注意不要将纹状体组织包括在皮质样本中。此时，隔膜 核/SE 将是可见的，可以很容易地从该切片中取出（图4viii）。
    注意: PFM 的前缘和后缘由假想的冠状平面定义，这些平面分别与前部和体一致。内侧极限由外部胶囊¹⁸定义。
14. 在间脑剩余半截面的侧表面上，沿着鼻沟向尾部延伸部分水平切口，但仅限于与体的假想冠状平面水平。进行部分冠状切口，从 HY 的乳腺体平面的外皮质表面向内侧延伸 1 mm。在这里，幽闭平面上的矢状旁切口将释放 PFM （图4ix 和 图4x）。
    注意:在间脑剩余半段的内侧表面上，可以看到许多解剖学特征，包括状体，后屈筋膜和髓状纹状体。可以看到半圆形图案（背凹面），表示 丘脑 和 HY之间的边缘。HY 在矢 状突中段的视图上很容易识别，根据前腹侧和前副前交叉以及前部的状体以及后屈的筋膜。后者的地标在地图集¹⁷ 和白化小鼠前脑背景¹⁹中都得到了很好的展示。
15. 在状体后方做一个部分冠状切口，仅向下丘脑沟横向延伸。此时，沿着下丘脑沟长度的矢状突切口现在释放了 HY 。
16. 需要外侧心室的外翻，以揭示额外的边缘内连接和剩余的边缘系统组成部分。观察间脑剩余半部分的内侧，弯曲的镊子将是最好的选择，因为它们允许技术人员操纵周围区域的其他脆弱部分，用于切断穹窿，并插入外侧心室并轻轻扩张，使用钝性解剖打开心室并旋转 HC 从垂直到水平面 90°。可能需要使用 #11 刀片切除脉络膜动脉/脉络丛，因为尖头可以帮助精确切开。
17. 将 CNG 旋转 90°（但与 HC 的方向相反）以处于水平面。使用镊子，轻轻地将 HC 向外和横向旋转180°，这将使 ERC 的内表面可见并朝上。
18. 从 ERC 产生的有髓鞘纤维的扇形辐射将汇聚形成角束，包括穿孔路径及其与 HC的附着。将丘脑和 MB 向背侧旋转180°，以腹侧露出 AY。
19. 如果需要，抬起视道以显示终纹的附着物，因为它将包含沿着丘脑心室表面外缘到 AY 的纤维带，并使 AY 的轮廓清晰。
    注意: HC 和穹窿将整体清晰可见，嵌套在侧脑室中，可以很容易地抬起。侧脑室将衬有软脑膜和扇形起源的穿孔路径，通过 ERC 非常透明的腭下方面将可见²⁰。
20. 内侧 ERC 的外表面将有一个可见的突出的大锥体细胞层。此外，高尔基体染色纤维的密集收敛将是内侧 ERC的一个显着特征。在这种解剖手术中，在切除外侧心室后，这些纤维将很容易通过软脑膜在内侧表面上看到，软脑膜排列在心室的内表面，形成非常突出的扇形结构。
21. 请注意，纤维在亚骺聚集，下降并离开腹侧 ERC，向后延伸，然后垂直上升以穿孔 HC。 ERC 中的这种扇形结构将用于定义用于解剖目的的边缘。按照 AY、 ERC、 压缩天然气 和 HC 结构的顺序进行识别和移除。
    注意:为 AY 解剖定义一个好的地标将是下一步的关键，而末端纹状体与 AY 相遇的后缘交界将是一个好点。
22. 在这一点上，其余的结构包括 丘脑 和 MB。通过可视化其背表面上延伸在中线喜尾平面上的纹状髓来确认丘脑的识别。通过冠状切口尾部将 丘脑 从中 脑 完全分离到半月形，将喙骨与上丘脑完全分开。 ROC 将在此步骤中保存。
23. 此时，完成所有大脑区域的收集，并立即（如获得每个区域）将样品速冻储存直至进一步处理。

Results

我们对复杂的大脑结构和功能的理解正在迅速发展和改善。大脑包含多个不同的区域，建立分子图谱可以帮助我们更好地了解大脑是如何工作的。在这种方法的论文中，我们讨论了将小鼠大脑解剖成多个不同的区域（表1）。在该协议中，根据关键地标识别结构，并通过保持其坚固性以立即解剖来用盐水溶液保持组织湿润来实现。该方法比其他报告²¹ 覆盖更多的区域，并且是使用冷冻大脑的解剖方法^22，23的补充。这些解剖的组织可以根据研究的要求保存和处理。这里讨论的方法是立即从颅骨中取出大脑，然后解剖，根据小鼠大脑的大小，以快速的方式为下游测定提供足够的组织。我们的团队从多个解剖组织中提取RNA，并使用脑组织的微阵列进行基因表达分析;AY、HC、MPFC、隔膜区、纹状体和VS等结果已发表¹⁵篇。这些收获的大脑在RNA提取前在-80°C下储存数月。这种方法可以与其他方法结合使用，以分散大脑区域的下游效用。这种解剖方法的重点是遵循解剖学...

Discussion

哺乳动物大脑是一个复杂的器官，由一系列形态上不同且功能独特的细胞组成，这些细胞具有不同的分子特征和执行特殊和离散功能的多个区域。这里报告的解剖程序可以有多个目标，具体取决于实验室的要求。在我们的实验室中，我们评估了从暴露于创伤后应激障碍（如应激¹⁶ ）的小鼠收集的多个大脑区域的转录。我们想进一步研究菌株遗传背景²⁴ 对多个大脑区域表达水平的影响。该协议具有多个关键步骤，需要考虑这些步骤才能成功重现实验。大脑的每个局部区域在神经病理学状况中起着独特的作用，并且缺乏对适当的大脑区域的详细知识来研究。因此，生成与大脑区域相关的数据集非常重要。因此，数据不仅可以通过选择大脑区域来查询，还可以通过数据类别（例如，转录组，蛋白质，细胞（细胞结构）或其他）来查询，从而获得更精确的信息。以前，新鲜大鼠脑组织中的嗅球，额叶皮层，纹状体和海马体等组织已被证明是使用显微镜²⁵解剖的。或者，在大脑冷冻¹⁴ 时可以解剖切片，然后提取RNA和蛋白质，但这种方法仅限于可以通过清...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>脑去除
Deaver 剪刀	Roboz 手术店	RS-6762	5.5" 直尖/锋利
Deaver 剪刀	Roboz 手术店	RS-6763	5.5" 弯曲尖/锐
手术剪刀	Roboz 手术店	RS-6703	4.75" 弯曲尖/锐
精致的手术剪刀	Roboz 手术店	RS-6702	4.75 英寸直锐/锐利
轻型手术剪刀	Roboz 手术店	RS-6753	5 英寸弯曲锐利/锐
微型刮刀，半径和锥形平头			不锈钢镜面饰面
手术剪刀 6.5 英寸	Roboz 手术店	RS-6846	弯曲锐利/锐利
组织钳	Roboz 外科商店	RS-8160	4.5" 1X2 齿 2mm 尖端宽度
Rongeur（可选）	Roboz 外科商店	RS-8321 多种款式可供选择	Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
<强>垂体解剖
手术刀手柄	Roboz 手术刀柄 Roboz 手术商店	RS-9843	手术刀手柄 #3 实心 4"
和刀片	Roboz Surgical Store	RS-9801-11	无菌手术刀刀片：#11 盒 100 40 毫米
超细镊子 Inox	Roboz 手术商店	RS-4955	尖端尺寸 0.025 X 0.005 毫米
<强>脑解剖
A 放大面罩	Penn Tool Col	40-178-6	2.2 倍外镜头和 3.3 倍内镜头放大倍率，矩形放大镜
解剖冷板	Cellpath.com	JRI-0100-00A	冰山冷板和底座
Graefe 镊子，全曲线超精致	Roboz 手术商店	RS-5138	0.5 毫米尖端 4 英寸（10 厘米）长
轻型手术剪刀	Roboz Surgical Store	RS-6753	5 英寸弯曲锐利/锋利
手术刀手柄	Roboz Surgical Store	RS-9843（如上所述）	手术刀手柄 #3 实心 4 英寸
和刀片（尤其是 #11）	Roboz Surgical Store	RS-9801-11（如上所述重复）	无菌手术刀刀片：#11 Box 100 40mm
抹刀	亚马逊	MS-SQRD9-4	双头抹刀方形和圆头
组织镊子	Roboz 手术店	RS-8160（重复上述）	4.5" 1X2 齿