小鼠脑组织功能区与解剖区域的显微解剖

摘要

本文介绍了一种快速、动手操作的逐步实验方案，用于小鼠脑组织的取出以及从新鲜脑组织中分离特定脑区。在许多神经科学研究实验室中，获取脑区用于分子分析已成为常规操作。这些脑区在分离后立即冷冻，以获得高质量的转录组数据，用于系统水平的分析。

摘要

大脑是哺乳动物神经系统的指挥中心，也是一个具有巨大结构复杂性的器官。大脑受到颅骨的保护，其表面覆盖着被称为大脑皮层的灰质层，分布于两侧半球。在这层结构下方，还存在许多其他特化的结构，对维持生命所必需的多种生理现象至关重要。获取特定大体脑区的样本需要迅速而精确的解剖步骤。 需要明确的是，在显微层面，存在众多亚区，这些亚区很可能跨越了我们为本次解剖所人为划定的区域边界。

小鼠模型被常规用于研究人类大脑功能及疾病。基因表达模式的变化可能局限于特定脑区，这些脑区与特定表型相关，并因疾病状态而异。因此，结合大脑明确的结构组织来研究转录调控具有重要意义。要全面理解大脑，必须研究不同的脑区，明确它们之间的连接，并识别各脑区活动中的关键差异。对这些不同脑区进行更深入的理解，可能为神经科学领域的新疗法和改进疗法开辟道路。本文中，我们讨论了一种将小鼠大脑分离为十六个不同区域的逐步操作方法。在该操作中，我们聚焦于雄性C57Bl/6J小鼠（6-8周龄）的大脑取出，并利用神经解剖学标志物识别和取样多个离散的、功能相关且行为相关的 脑区。本研究将为神经科学领域奠定坚实基础，推动更聚焦的研究策略，以深入理解大脑功能。

引言

大脑与脊髓和视网膜共同构成 中枢神经系统，该系统通过遍布全身的特化、精确定位且相互作用的细胞类型来执行复杂行为¹。大脑是一个复杂的器官，包含数十亿个相互连接的神经元和胶质细胞，具有精确的神经回路，执行多种功能。大脑呈两侧对称结构，具有两个不同的半球以及多样的细胞成分²。脊髓连接大脑与外界，受到骨骼、脑膜和脑脊液的保护，并负责向大脑传递和接收信息^2,3,4。大脑表面即大脑皮层，表面凹凸不平，具有明显的褶皱结构，凸起部分称为脑回，凹陷部分称为脑沟，这些结构将大脑划分为不同的功能区域⁵。在脑体积较小的哺乳动物中，皮层表面较为光滑^6,7。研究和表征人类大脑的结构对于理解不同脑区相关疾病及其功能回路至关重要。近年来，神经科学研究不断拓展，多种实验方法被用于研究大脑的结构与功能。分子生物学和系统生物学领域的进展开启了探索脑结构与分子功能之间复杂关系的新时代。此外，分子生物学、遗传学和表观遗传学的快速发展使我们能够深入理解系统功能背后的分子机制。这些分析可在更精细的局部层面进行，有助于精准定位研究方向，并推动更有效治疗策略的开发。

哺乳动物的大脑在结构上被明确划分为可清晰识别的独立区域；然而，这些独立结构的功能和分子复杂性尚未被充分理解。脑组织的多维和多层特性使得在功能层面研究这一结构变得困难。此外，同一脑区可执行多种功能，而不同脑区也可执行相同功能，这一事实进一步增加了理解大脑的复杂性⁸。因此，针对脑区结构与功能特征的研究方法必须采用精确的实验技术，以确保取样的一致性，从而将神经解剖学结构与功能相互关联。近年来，单细胞测序技术已被用于阐释大脑的复杂性^9,10，例如人类大脑颞叶即由75种不同的细胞类型组成¹¹。通过将这些数据与小鼠大脑对应区域进行比较，该研究不仅揭示了二者在结构和细胞类型上的相似性，也指出了其差异。因此，要解析这些复杂的机制，必须以高度精确的方式研究大脑的多个不同区域。人类与小鼠大脑之间在结构和功能上的保守性，使得小鼠可作为初步研究人类大脑功能及行为结果的替代模型。

随着系统生物学方法的进步，从啮齿类动物的特定脑区获取信息已成为神经科学研究中的关键步骤。尽管某些方案（如激光 捕获 显微切割¹²）成本较高，机械分离方案则经济实惠，且仅需使用常规实验工具即可完成^13,14。我们已将多个脑区用于转录组分析¹⁵，并开发了一种快速、实用的实验操作流程，可在短时间内逐步分离小鼠目标脑区。分离后的组织样本可立即在低温条件下保存，以维持其核酸和蛋白质的完整性。我们的方法操作更迅速，效率更高，同时减少了组织降解的可能性，从而提高了利用脑组织开展高质量、可重复实验的成功率。

方案

动物饲养和实验操作均遵循欧洲、国家和机构层面的动物护理指南。所有动物实验均经美国陆军环境健康研究中心（现为沃尔特·里德陆军研究所，WRAIR）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在获得国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）认证的设施中进行。
注意：实验将使用通过颈椎脱位法处死的6至8周龄雄性C57BL/6j品系小鼠进行¹⁶本实验室未进行灌注操作，但本方案可能 可进行修改，以通过灌注清除血管中的血液 可进行操作。解剖所需的所有耗材均已列于下文 材料表解剖过程分为三个部分，包括 脑的取出、垂体的摘除以及脑组织的解剖。脑组织采集的目的是在提取RNA后，将其用于转录组学分析。一旦完成特定脑区的解剖，我们立即把各脑区组织转移至预先标记好的冻存管中，随后将冻存管置于液氮或-80 °C保存。
注意：进行此操作需要具备扎实的神经解剖学知识。必须学习并掌握脑组织的水平切面、纵向切面以及常规的横断切面。由于脑组织降解速度极快，操作过程中没有时间查阅解剖图谱。

1. 小鼠脑组织取出

1. 用止血钳夹住离体头部的上颌（图2i），并用纱布垫将头皮进一步向前推移，以在颅骨背侧形成干燥的操作区域（图2ii）。
2. 将精细弯剪插入枕骨大孔，以分离附着的脑膜。此处应将剪刀插入颅底的枕骨大孔开口，即脊髓穿出的位置，剪刀尖端垂直朝上（12点钟方向），紧贴基底骨（即枕鳞）内表面并与其平行，然后将剪刀刀片向左侧旋转45°，再向右侧旋转45°。
3. 继续旋转手腕，撬起基底骨，从残留骨质的中线剪开，并延伸至枕骨和顶间骨，左右撬动直至完全去除。以类似方式去除枕骨和顶间骨，以暴露小脑。
   注意：此时可去除位于颅骨腹侧后部、包裹中耳和内耳部分结构的空心骨性结构——鼓泡，除非正在进行垂体前叶和后叶的解剖（图2iii）。
4. 使用弯头锐利剪刀去除颞嵴上的肌肉附着。将弯头锐利剪刀的一侧刀臂置于人字缝下方，插入横窦与矢状窦的交汇处（图2iv）。
5. 沿正中矢状缝将剪刀向前推进至前囟，同时小心向上提起，轻柔地剪开该缝，避免损伤大脑皮层。此步骤是整个操作的关键（图2v）。
6. 此时抬起并旋转顶骨，刮除骨内表面残留的脑膜附着物。抓住颞骨向外撬开，远离脑组织。使用弯剪或咬骨钳从两侧进入眼眶，沿与眶嵴成直角的方向行冠状位剪切，但不得超过中线（图2vii）。
7. 在矢状面上做两条平行切口，间距约4 mm（图2viii）。
   注意：不要用单次操作同时切断两侧。
8. 去除额骨碎片时应避免损伤脑表面（图2ix）。此时可用精细剪刀剪开硬脑膜，该结构应可在嗅球之间清晰可见并易于操作。
9. 轻柔地将颅骨翻转，利用重力辅助脑组织脱离，同时继续识别并剪断残留的脑膜附着和颅神经。通过剪断连接于脑部的最大三叉神经（自颅盖基底部明显延伸而出）即可释放脑组织（图2x）。
   ​注意：将脑组织转移至冷盐溶液中（冰冻无RNase的柠檬酸钠溶液（0.9%）或生理盐水（0.9%）），以进行后续解剖。

2. 垂体前叶和垂体后叶的分离

注意：垂体被一层非常坚韧的、类似帐篷状的膜覆盖，该膜在左右三叉神经之间横向延伸形成一条脊状结构。垂体组织极为柔软而脆弱，因此建议在颅骨内原位分阶段分别解剖垂体的后叶和前叶。in situ（原位）分离后，应立即将相应的垂体组织转移至预先标记好的小瓶中，并将小瓶置于液氮中保存，若无液氮则最好保存于 -80 °C 环境中。垂体正好位于枕骨与基蝶骨交界处上方；若发生弯曲或变形，垂体的结构将遭到破坏。

1. 保持听泡完整，以确保垂体解剖结构完整且易于识别（图 2ix）。
2. 从颅骨其余部分分离垂体后叶，随后分离垂体前叶。
3. 在膜性小脑幕脊两侧各做极小的旁矢状切口，用超细镊子提起垂体后叶，注意不要破坏垂体前叶组织（图 2x）。
4. 在垂体前叶外侧缘与邻近三叉神经之间做矢状切口，随后取出垂体前叶（图 2x）。

3. 小鼠脑组织解剖

注意：在取出脑组织和垂体后，应立即在预冷的不锈钢板上进行进一步解剖（图3）。解剖完成后，将脑区组织转移至预先标记好的样品管中，并最好将样品管置于液氮中，否则应保存于-80 °C。自上而下法可获取的脑区结构（按操作顺序）可能包括以下部分：小脑（CB）、脑干/后脑（脑桥和延髓）（HB）、嗅球（OB）（作为附属嗅球）、内侧前额叶皮层（MPFC）、外侧前额叶皮层（FCX）、前部和后部纹状体（ST）、由伏隔核（NAC）和嗅结节（OT）组成的腹侧纹状体（VS）、隔区（SE）、视前区、梨状皮层（PFM）、下丘脑（HY）、杏仁核（AY）、海马（HC）、后扣带皮层（CNG）、内嗅皮层（ERC）、中脑（MB）（含丘脑）以及其余大脑皮层（ROC）（Table 1）。下文将按照分离顺序，以单侧大脑半球为例，逐一讨论特定脑区的处理方法。

1. 从颅骨中取出脑组织时需格外小心，以免损伤解剖标志，尤其应避免造成任何撕裂。此步骤操作时须佩戴面部防护装备， specifically 使用7倍放大头戴式额镜（7x jewelers visor），并由置于解剖者双肩上方的手术灯提供照明。大部分解剖操作将使用钝头小型弯镊（即Graefe镊）完成。
2. 将脑组织置于不锈钢板上（图 4i 和 图4ii）。将组织块置于冰和冰冻生理盐水中以保持低温。定期用冰冻生理盐水润湿组织，以保存其结构。
3. 将脑组织置于大脑皮层朝上的位置。使用小型弯头镊子，轻轻将小脑（CB）翻开，暴露小脑上、中、下脚，然后予以切除 CB (图 4iii 和 图 4iv).
4. 从背部开始，在正中矢状面进行切割 OB 和大脑半球（图4v）并确保不要超过前连合。此时，小脑蚓部可轻松与外侧部分分离 HB 将在脑桥前缘通过冠状切口获取。
5. 在脑桥后缘处进行冠状切面，分离延髓。
   注意：此时，间脑（前脑的后部，包含上丘脑、丘脑、下丘脑、腹侧丘脑和第三脑室）将被翻转至腹侧朝上，并从视交叉处向前进行正中矢状切开。随后解剖分离大脑半球并予以移除 OB 来自其中一个半球的样本在此步骤中图 4v 和 图4vi).
6. 分离大脑半球（图4v) 在进一步解剖间脑之前（图 4v）。将采用背侧入路，通过精细的钝性分离以保护关键的中线解剖标志。在切断任何结构前，需先辨识每一条大脑半球间连接，以最大限度减少偏离中线的可能性。
   注意：在此步骤中，其中一个大脑半球（半脑）可以被保存，而第二个半球可用于进一步解剖
7. 将小型弯头镊子的闭合镊尖插入胼胝体下方，轻轻撑开，以双侧牵开新皮层。胼胝体是一束宽阔的神经纤维，连接两侧大脑半球，可用镊子夹捏进行钝性分离，注意避免扰动其下方的中线结构。
   注意：大脑半球内侧面可见多个标志结构，如胼胝体膝部、穹窿和前连合等有髓鞘结构。此外，虽位于中线外侧数毫米处，乳头丘脑束和后屈束也可能可见。
8. 横切穿过中线的多个结构，包括胼胝体、前连合、腹侧穹窿连合、后连合、背侧穹窿连合、乳头体上交叉、上丘连合、腹侧穹窿连合以及室周丘脑纤维。
9. 在此步骤中，需特别注意中线区域，该区域可能因背侧入路方法而部分受损。若操作不慎，所有后续结构均面临风险。
10. 移除 OB （楔形且颜色较浅）以及副嗅球，随后进行采集 内侧前额叶皮层 （扣带皮层区域1、前肢部、下肢部、内侧眶部以及次级运动皮层 [M2]）和 FCX 在胼胝体膝部前方1毫米处进行冠状切开图 4vii）。沿从内侧到外侧表面距离的三分之一处进行矢状切分，得到 内侧前额叶皮层 内侧为FCX，外侧为FCX其余部分。扣带皮层是小鼠的MPFC对应区域。
    注意：该组织切片还将包含少量M2（次级运动皮层） ¹⁷ 且不可避免。
11. 在前连合水平做冠状切口，使所得冠状切片的头端面上可见前连合前肢部分的横截面，而尾端面则显示出其横行部分。此为确认该解剖位置的标志 NAC¹⁸。该 VS 由……组成 NAC 和 OT.
    注意：前连合中除横行部分外，还存在一前肢，称为前连合前部（pars anterior）。
12. 从侧脑室前角下方中线处开始，沿前连合横行部分进行水平方向的不完全横切，以分离上方的隔核以及 VS 腹侧。从外侧表面去除少量皮层组织 NAC 和 OT 将被移除。
13. 分离前部脑区 ST 通过弯头手术刀从外囊外侧切开，分离其上方的皮层组织，注意避免将纹状体组织混入皮层样本中。此时，分离 septal 细胞核 /SE 将在此切片中可见，并可轻松获取图 4viii).
    注意：前部与后部界限的 PFM 由分别与前连合和乳头体对齐的假想冠状面界定。内侧边界由外囊定义¹⁸.
14. 在间脑剩余半切面的外侧表面，沿嗅沟向尾侧做部分水平切口，但仅延伸至与乳头体水平的假想冠状面。在乳头体平面，从外侧皮质表面向内侧延伸1 mm，做部分冠状切口。 HY在此处，沿屏状核平面做矢状切口将释放 PFM (图 4ix 和 图4x).
    注意：在间脑剩余半切部分的内侧面上，将可见多个解剖结构，包括乳头体、后屈束和髓纹。可见一呈半圆形（背侧凹面）的结构，标志着两者之间的边界 丘脑 和 HY。该 HY 在正中矢状切面视图上，可通过视交叉的前腹侧、前连合的前背侧以及后方的乳头体和缰核髓纹进行清晰辨认。上述解剖标志在图谱中已有清晰展示。¹⁷ 以及在白化小鼠前脑组织中的情况¹⁹.
15. 在乳头体后方做一个冠状部分切口，仅延伸至下丘脑沟的外侧。此时，沿下丘脑沟全长进行矢状旁切口，即可游离 HY .
16. 翻转侧脑室以显露额外的边缘系统内部连接及剩余的边缘系统结构。观察间脑剩余半切面的内侧面时，使用弯钳是最佳选择，因其可使技术人员在周围其他精细结构间进行操作，便于切断穹窿，同时将弯钳插入侧脑室并轻轻扩张，通过钝性分离打开脑室并旋转 HC 从垂直方向向水平面旋转90°。可能需要使用#11刀片切开脉络膜动脉/脉络丛，因其尖端有助于进行精确切割。
17. 旋转 CNG 90°（但与之前方向相反） HC）置于水平面。使用镊子轻轻旋转 HC 再向外侧旋转180°，从而使内表面朝外 ERC 可见且朝上。
18. 呈扇形放射的有髓神经纤维，起源于 ERC 将汇聚形成角束，包括穿通路径及其与 HC. 旋转丘脑并 MB 从背侧向腹侧完全翻转180°以暴露 AY.
19. 如有需要，可抬起视束以显露终纹的附着处，因其含有沿丘脑室面外侧缘走行的纤维束，通往 AY 并绘制出轮廓 AY 澄清。
    注意： HC 穹窿和侧脑室将完全清晰可见，嵌于侧脑室内，可轻松取出。侧脑室内壁由软脑膜衬覆，并通过极为透明的软脑膜下区域显现出穿通束呈扇形的起始部 ERC 将可见²⁰.
20. 内侧的外表面 ERC 将可见一层明显的大型锥体细胞。此外，高尔基染色纤维的密集汇聚将是内侧区的一个显著特征 ERC在该解剖步骤中，外翻侧脑室后，这些纤维将透过衬于脑室内部表面的软脑膜，在内侧表面清晰可见，形成一个非常显著的扇形结构。
21. 注意观察纤维在皮层下聚集，向下延伸并离开腹侧 ERC，向后延伸，然后垂直上行并穿行 HC。这种扇形结构在 内质网-线粒体接触位点 将用于界定解剖范围。按顺序识别并移除 AY, ERC, CNG 和 HC 结构
    注意：定义一个良好的解剖标志对于 AY 解剖将是下一步的关键，以及终纹与后缘交界处的连接点 AY 将是一个很好的切入点。
22. 此时，剩余的结构包括 丘脑 和 MB通过观察位于其背侧表面、沿中线前后平面延伸的髓纹来确认丘脑的辨认。分离 丘脑 完全从 中脑 在丘脑后部与上丘之间进行冠状切口。 中国台湾 在此步骤中保存。
23. 此时应完整收集所有脑区组织，并立即（每获得一个样本后）将样品速冻保存，直至进一步处理。

结果

我们对大脑复杂结构和功能的理解正在迅速发展和深化。大脑包含多个不同的区域，构建分子图谱有助于我们更好地理解大脑的工作机制。在本文中，我们讨论了将小鼠大脑解剖为多个不同区域的方法表1）。在本方案中，通过保留组织的坚固性并使用生理盐水保持其湿润，以关键解剖标志为基础识别结构，从而实现即时解剖。该方法涵盖的区域较其他文献报道更广泛。²¹ 并且与使用冷冻脑组织的解剖方法相辅相成^22,23这些解剖获得的组织可根据研究需求进行保存并后续处理。本文所述方法为立即从颅骨中取出脑组织，随后进行解剖，该方法可快速获取足量组织，适用于小鼠脑组织的下游检测。本团队已从多个解剖组织中提取RNA，并利用微阵列技术对脑组织的基因表达谱进行检测，涉及的脑区包括杏仁核（AY）、海马（HC）、内侧前额叶皮层（MPFC）、隔区、纹状体和腹侧纹状体（VS），相关结果已发表。¹⁵这些收获的脑组织在提取RNA前于-80°C保存数月。该方...

讨论

哺乳动物的大脑是一个复杂的器官，由多种形态各异、功能独特、分子特征多样且执行专门而独立功能的多个脑区组成。本文所报告的脑组织解剖方法可根据实验室的具体需求实现多种目标。在我们的实验室中，我们评估了暴露于类似创伤后应激障碍（PTSD）应激的小鼠多个脑区中的转录水平¹⁶。我们希望进一步研究小鼠品系遗传背景²⁴对多个脑区基因表达水平的影响。本实验方案包含多个关键步骤，为确保实验的可重复性，这些步骤均需仔细考虑。大脑各个局部区域在神经病理状态下发挥着不同的作用，但目前尚缺乏关于应研究的特定脑区的详尽知识。因此，生成与脑区相关的数据集至关重要。这样，数据不仅可以按脑区进行查询，还可以按数据类别（例如转录组、蛋白质、细胞（细胞构筑）或其他）进行检索，从而获得更精确的信息。此前已有研究显示，可在显微镜下对新鲜大鼠脑组织中的嗅球、前额皮层、纹状体和海马等组织进行解剖²⁵。另一种方法是在脑组织冷冻状态下进行切片解剖¹⁴，随后提取RNA和蛋白质，但该方法仅适用于具有明...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>脑组织取出
Deaver 剪刀	Roboz 外科手术器械库	RS-6762	5.5" 直尖/锐利
Deaver 剪刀	Roboz 外科手术器械库	RS-6763	5.5" 弯曲双刃/双刃
精细手术剪	Roboz 外科手术器械库	RS-6703	4.75" 弯曲双刃/双刃
精细手术剪	Roboz 外科手术器械库	RS-6702	4.75" 直尖/锐利
光控手术剪	Roboz 外科手术器械库	RS-6753	5" 弯曲的锐/锐
微型刮刀，两端为圆角和平头渐细设计			不锈钢镜面抛光
操作剪刀 6.5"	Roboz 外科手术器械库	RS-6846	弯曲双刃/双刃
组织镊	Roboz 外科手术器械库	RS-8160	4.5” 1×2 齿，2 mm 尖端宽度
刮刀（可选）	Roboz 外科手术器械库	RS-8321 多种款式可供选择	Lempert 咬骨钳 6.5" 2X8毫米
<强>垂体解剖
手术刀柄	Roboz 外科手术器械库	RS-9843	#3号实心手术刀柄 4"
和刀片	Roboz 外科手术器械库	RS-9801-11	无菌手术刀片：#11，100片/盒，40 mm
超细镊子 Inox	Roboz 外科手术器械库	RS-4955	尖端尺寸 0.025 X 0.005 mm
<强>脑解剖
放大目镜	宾夕法尼亚工具公司	40-178-6	2.2倍外置与3.3倍内置透镜放大倍数，矩形放大镜
解剖冷板	Cellpath.com	JRI-0100-00A	冰山冷板 &和；碱
格劳费镊子，全弧形超精细	Roboz 外科手术器械库	RS-5138	0.5 mm 尖端 4” （10 cm）长
手术用照明剪刀	Roboz 外科手术器械库	RS-6753	5" 弯曲双刃/双刃
手术刀柄	Roboz 外科手术器械库	RS-9843（上文重复）	#3 型实心手术刀柄 4"
以及刀片（特别是 #11 型）	Roboz 外科手术器械库	RS-9801-11（上文已重复）	无菌手术刀片：#11，100片/盒，40毫米
刮刀	亚马逊	MS-SQRD9-4	双头刮刀，一端方形一端圆形
组织镊	Roboz 外科手术器械库	RS-8160（上文重复）	4.5” 1X2 齿