本文介绍了一种快速、动手操作的逐步实验方案，用于小鼠脑组织的取出以及从新鲜脑组织中分离特定脑区。在许多神经科学研究实验室中，获取脑区用于分子分析已成为常规操作。这些脑区在分离后立即冷冻，以获得高质量的转录组数据，用于系统水平的分析。
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本文内容
摘要
摘要
大脑是哺乳动物神经系统的指挥中心，也是一个具有巨大结构复杂性的器官。大脑受到颅骨的保护，其表面覆盖着被称为大脑皮层的灰质层，分布于两侧半球。在这层结构下方，还存在许多其他特化的结构，对维持生命所必需的多种生理现象至关重要。获取特定大体脑区的样本需要迅速而精确的解剖步骤。 需要明确的是，在显微层面，存在众多亚区，这些亚区很可能跨越了我们为本次解剖所人为划定的区域边界。
小鼠模型被常规用于研究人类大脑功能及疾病。基因表达模式的变化可能局限于特定脑区，这些脑区与特定表型相关，并因疾病状态而异。因此，结合大脑明确的结构组织来研究转录调控具有重要意义。要全面理解大脑，必须研究不同的脑区，明确它们之间的连接，并识别各脑区活动中的关键差异。对这些不同脑区进行更深入的理解，可能为神经科学领域的新疗法和改进疗法开辟道路。本文中，我们讨论了一种将小鼠大脑分离为十六个不同区域的逐步操作方法。在该操作中，我们聚焦于雄性C57Bl/6J小鼠（6-8周龄）的大脑取出，并利用神经解剖学标志物识别和取样多个离散的、功能相关且行为相关的 脑区。本研究将为神经科学领域奠定坚实基础，推动更聚焦的研究策略，以深入理解大脑功能。
引言
大脑与脊髓和视网膜共同构成 中枢神经系统，该系统通过遍布全身的特化、精确定位且相互作用的细胞类型来执行复杂行为1。大脑是一个复杂的器官，包含数十亿个相互连接的神经元和胶质细胞，具有精确的神经回路，执行多种功能。大脑呈两侧对称结构，具有两个不同的半球以及多样的细胞成分2。脊髓连接大脑与外界，受到骨骼、脑膜和脑脊液的保护，并负责向大脑传递和接收信息2,3,4。大脑表面即大脑皮层，表面凹凸不平，具有明显的褶皱结构，凸起部分称为脑回，凹陷部分称为脑沟，这些结构将大脑划分为不同的功能区域5。在脑体积较小的哺乳动物中，皮层表面较为光滑6,7。研究和表征人类大脑的结构对于理解不同脑区相关疾病及其功能回路至关重要。近年来，神经科学研究不断拓展，多种实验方法被用于研究大脑的结构与功能。分子生物学和系统生物学领域的进展开启了探索脑结构与分子功能之间复杂关系的新时代。此外，分子生物学、遗传学和表观遗传学的快速发展使我们能够深入理解系统功能背后的分子机制。这些分析可在更精细的局部层面进行，有助于精准定位....
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方案
动物饲养和实验操作均遵循欧洲、国家和机构层面的动物护理指南。所有动物实验均经美国陆军环境健康研究中心（现为沃尔特·里德陆军研究所，WRAIR）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在获得国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）认证的设施中进行。
注意：实验将使用通过颈椎脱位法处死的6至8周龄雄性C57BL/6j品系小鼠进行16本实验室未进行灌注操作，但本方案可能 可进行修改，以通过灌注清除血管中的血液 可进行操作。解剖所需的所有耗材均已列于下文 材料表解剖过程分为三个部分，包括 脑的取出、垂体的摘除以及脑组织的解剖。脑组织采集的目的是在提取RNA后，将其用于转录组学分析。一旦完成特定脑区的解剖，我们立即把各脑区组织转移至预先标记好的冻存管中，随后将冻存管置于液氮或-80 °C保存。
注意：进行此操作需要具备扎实的神经解剖学知识。必须学习并掌握脑组织的水平切面、纵向切面以及常规的横断切面。由于脑组织降解速度极快，操作过程中没有时间查阅解剖图谱。
1. 小鼠脑组织取出
- 用止血钳夹住离体头部的上颌（图2i），并用纱布垫将头皮进一步向前推移，以在颅骨背侧形成干燥的操作区域（图2ii）。 ....
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结果
我们对复杂大脑结构与功能的理解正在迅速发展和深化。大脑包含多个不同的区域，构建分子图谱有助于我们更好地理解大脑的工作机制。在本文中，我们介绍了将小鼠大脑解剖分离为多个不同区域的方法表1）。在本方案中，通过保留组织的坚固性并用生理盐水保持其湿润，以关键解剖标志为基础识别结构，从而实现即时解剖。该方法涵盖的区域较其他文献报道更为广泛21 并且与使用冷冻脑组织的解剖方法相辅相成22,23这些解剖获得的组织可根据研究需求进行保存并后续处理。本文所述方法为立即从颅骨中取出大脑，随后进行解剖，该方法可快速获取足量组织，适用于小鼠脑组织的下游检测。本团队已从多个解剖组织中提取RNA，并利用微阵列技术对脑组织（包括杏仁核、海马、内侧前额叶皮层、隔区、纹状体和腹侧纹状体）进行基因表达谱分析，相关结果已被发表。15. 这些收获的脑组织储存在 -80°C 在RNA提取前数月进行。该方法可与其他方法结合使用，以拓展脑.......
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讨论
哺乳动物的大脑是一个复杂的器官，由多种形态各异、功能独特、分子特征多样且执行专门而独立功能的多个脑区组成。本文所报告的脑组织解剖方法可根据实验室的具体需求实现多种目标。在我们的实验室中，我们评估了暴露于类似创伤后应激障碍（PTSD）应激的小鼠多个脑区中的转录水平16。我们希望进一步研究小鼠品系遗传背景24对多个脑区基因表达水平的影响。本实验方案包含多个关键步骤，为确保实验的可重复性，这些步骤均需仔细考虑。大脑各个局部区域在神经病理状态下发挥着不同的作用，但目前尚缺乏关于应研究的特定脑区的详尽知识。因此，生成与脑区相关的数据集至关重要。这样，数据不仅可以按脑区进行查询，还可以按数据类别（例如转录组、蛋白质、细胞（细胞构筑）或其他）进行检索，从而获得更精确的信息。此前已有研究显示，可在显微镜下对新鲜大鼠脑组织中的嗅球、前额皮层、纹状体和海马等组织进行解剖25。另一种方法是在脑组织冷冻状态下进行切片解剖14，随后提取RNA和蛋白质，但该方法仅适用于具有明.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Seshmalini Srinivasan女士、Stephen Butler先生和Pamela Spellman女士提供的实验协助，以及Dana Youssef女士对稿件的编辑。谨此感谢美国陆军医学研究与发展司令部（USAMRDC）提供的经费支持。本研究还得到了日内瓦基金会的贡献，并由美国陆军研究办公室通过军事与作战医学研究领域指挥部III提供的资金予以支持。
免责声明：
材料已通过沃尔特·里德陆军研究所审查，对其展示和/或发表无异议。本文所含观点或主张仅为作者个人见解，不应被视为官方立场，亦不代表美国陆军部或国防部的真实观点。研究是在经批准的动物使用方案下，于AAALAC认证机构中开展的。 符合《动物福利法》及其他有关动物及动物实验的联邦法规和条例的认证机构，并遵循下述声明中的原则 实验动物护理和使用的指南，NRC出版物，2011年版。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>脑组织取出 | |||
| Deaver 剪刀 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6762 | 5.5" 直尖/锐利 |
| Deaver 剪刀 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6763 | 5.5" 弯曲双刃/双刃 |
| 精细手术剪 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6703 | 4.75" 弯曲双刃/双刃 |
| 精细手术剪 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6702 | 4.75" 直尖/锐利 |
| 光控手术剪 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6753 | 5" 弯曲的锐/锐 |
| 微型刮刀，两端为圆角和平头渐细设计 | 不锈钢镜面抛光 | ||
| 操作剪刀 6.5" | Roboz 外科手术器械库 | RS-6846 | 弯曲双刃/双刃 |
| 组织镊 | Roboz 外科手术器械库 | RS-8160 | 4.5” 1×2 齿，2 mm 尖端宽度 |
| 刮刀（可选） | Roboz 外科手术器械库 | RS-8321 多种款式可供选择 | Lempert 咬骨钳 6.5" 2X8毫米 |
| <强>垂体解剖 | |||
| 手术刀柄 | Roboz 外科手术器械库 | RS-9843 | #3号实心手术刀柄 4" |
| 和刀片 | Roboz 外科手术器械库 | RS-9801-11 | 无菌手术刀片：#11，100片/盒，40 mm |
| 超细镊子 Inox | Roboz 外科手术器械库 | RS-4955 | 尖端尺寸 0.025 X 0.005 mm |
| <强>脑解剖 | |||
| 放大目镜 | 宾夕法尼亚工具公司 | 40-178-6 | 2.2倍外置与3.3倍内置透镜放大倍数，矩形放大镜 |
| 解剖冷板 | Cellpath.com | JRI-0100-00A | 冰山冷板 &和；碱 |
| 格劳费镊子，全弧形超精细 | Roboz 外科手术器械库 | RS-5138 | 0.5 mm 尖端 4” （10 cm）长 |
| 手术用照明剪刀 | Roboz 外科手术器械库 | RS-6753 | 5" 弯曲双刃/双刃 |
| 手术刀柄 | Roboz 外科手术器械库 | RS-9843（上文重复） | #3 型实心手术刀柄 4" |
| 以及刀片（特别是 #11 型） | Roboz 外科手术器械库 | RS-9801-11（上文已重复） | 无菌手术刀片：#11，100片/盒，40毫米 |
| 刮刀 | 亚马逊 | MS-SQRD9-4 | 双头刮刀，一端方形一端圆形 |
| 组织镊 | Roboz 外科手术器械库 | RS-8160（上文重复） | 4.5” 1X2 齿 |
参考文献
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S.
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