体外延时活细胞成像技术用于探究细胞向耳蜗柯蒂氏器的迁移

摘要

本研究中，我们采用共聚焦显微镜结合包含科尔蒂器的耳蜗上皮组织体外孵育方法，实时成像观察细胞向受损组织迁移的过程。

摘要

为了研究间充质干细胞（MSCs）对细胞再生和治疗的影响，该方法通过将MSCs与耳蜗上皮共培养，追踪其迁移行为和形态学变化。在分离过程中，利用产生的部分前庭膜将柯蒂氏器固定在塑料盖玻片上。当移除玻璃圆筒后，原本被限制在其中的MSCs向耳蜗上皮迁移。这些细胞主要定位于柯蒂氏器的蜗轴区域，排列方向与神经纤维相似。然而，部分MSCs定位于螺旋缘区域，并呈现水平方向的拉长形态。此外，在卡那霉素处理后，MSCs向毛细胞区域的迁移增加，且其形态转变为多种不同形式。综上所述，本研究结果表明，MSCs与耳蜗上皮的共培养对于通过细胞移植开发治疗方法以及研究可评估多种条件和因素的细胞再生具有重要价值。

引言

听力损失可能先天发生，也可能由多种因素逐渐引起，包括衰老、药物和噪声。由于负责听力的毛细胞一旦受损，其功能很难恢复，因此听力损失通常难以治疗¹。根据世界卫生组织估计，全球约有4.61亿人患有听力损失，占世界人口的6.1%。其中，93%为成人，7%为儿童。

已尝试多种方法治疗听力损失，其中利用间充质干细胞（MSCs）的再生方法已成为一种颇具前景的治疗策略。当组织受损时，间充质干细胞会自然释放到循环系统中，并迁移至损伤部位，通过分泌多种分子形成促进再生的微环境²。因此，建立一种通过外源植入的间充质干细胞迁移至靶器官，并分泌强效免疫调节、促血管生成及抗凋亡分子，从而促进受损细胞功能恢复的方法至关重要^3,4,5。

间充质干细胞（MSCs）向受损组织迁移的归巢过程可能是需要克服的最重要障碍。MSCs具有系统性归巢机制，其过程包括一系列连续步骤：黏附/滚动、活化、停滞、跨内皮迁移/渗出以及迁移^6,7,

方案

所有涉及ICR小鼠的研究方案均经延世大学原州医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验按照世界医学协会的伦理准则进行。在本方案中，怀孕的ICR小鼠饲养在12/12小时光照/黑暗循环环境中，并可自由获取食物和水。

1. 耳蜗解剖

1. 使用超净工作台前，开启紫外灯照射约30分钟以进行灭菌，并用70%乙醇喷洒所有表面，待其自然干燥。
2. 将解剖器械置于70%乙醇中浸泡10分钟，取出后干燥备用。
3. 使用手术刀对出生后3-4天的小鼠进行断头处理（图2A）。
4. 将头颅置于超净工作台内的体视显微镜下，并用70%乙醇浸泡组织。
5. 迅速将组织浸入组织解离液（1× Hank's平衡盐溶液，1 mM HEPES）中，以去除残留乙醇。
6. 用手术刀沿颅骨中线切开（图2B、C）。
7. 向前牵拉皮肤暴露颅骨，并剪开耳部的外耳道（图2D）。
8. 沿眼部连线方向从颅骨前部向后部剪开（图2E）。
9. 打开颅骨，用钝头镊子取出前脑、小脑和脑干（

结果

间充质干细胞（MSCs）在三维模式下的体外迁移能力通常通过Transwell系统或传统的伤口愈合方法来评估，以观察其在二维（2D）模式下的迁移情况¹¹。耳蜗柯蒂氏器是一种复杂的结构，由多种细胞组成，包括博伊特歇尔细胞（Boettcher cells）、克劳迪乌斯细胞（Claudius cells）、代特尔细胞（Deiters cells）、支柱细胞（pillar cells）、亨森细胞（Hensen's cells）、外毛细胞、内毛细胞、神经纤维、基底膜以及网状板层（reticular lamina）¹²。当将MSCs移植至由上述复杂细胞构成的组织中时，采用适当的技术来确定细胞被招募和定植的具体位置，对于理解基于MSCs的细胞治疗及再生机制至关重要。此外，为了明确MSCs在组织损伤存在或缺失条件下如何实现局部定位，相较于细胞仅单向随机向下迁移的Transwell系统，采用如伤口愈合法等二维方法更为合适。

讨论

将间充质干细胞（MSCs）移植至受损部位以促进受损细胞再生的研究已广泛开展，其治疗效果显著。已有报道称，MSCs的移植及其后续分化可恢复因3-硝基丙酸诱导听力损失的大鼠的听力¹³。尽管Lee等人 已将MSCs通过静脉途径应用于人体，但并未获得明显的听力改善效果¹⁴。直至最近，已有近12项实验尝试通过MSC移植在啮齿类动物模型中恢复听力。尽管由于研究间的异质性导致结果尚不明确，但已有一定证据表明MSCs可能促进听力恢复。

多种与趋化作用相关的生长因子和趋化因子参与了移植干细胞向损伤区域的迁移，无论其为异质性或同质性环境¹⁵。趋化因子是调控细胞迁移的关键分子，参与组织稳态、免疫应答以及伤口愈合过程。趋化因子在体内诱导的趋化作用可能与体外情况不同，这是由于体内与体外实验条件存在差异。尽管体外实验条件本身具有一定局限性，但开展体内研究以促进细胞的有效迁移、募集和再生仍极为困难¹⁶。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS 缓冲液	GenDEPOT	P2100-104
4% 甲醛溶液	T&I	BPP-9004
氨苄青霉素	sigma	A5354-10ml
牛血清白蛋白（BSA）	sigma	A4503-100G
共聚焦培养皿	SPL	200350
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM800
盖玻片	SPL	20009
DMEM/F12 培养基	Gibco	10565-018
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16140071
含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂	sigma	F6057
镊子	Dumont	0508-L5-P0
HBSS 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	14065056
HEPES 缓冲剂	Thermo Fisher Scientific	15630080
N2 添加剂	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 试剂	abcam	ab176759
载物台培养箱	TOKAI HIT	WELSX
表达 GFP 的 C57BL/6 小鼠间充质干细胞	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787