体外延时活细胞成像技术用于探究细胞向耳蜗柯蒂氏器的迁移

摘要

本研究中，我们采用共聚焦显微镜结合包含科尔蒂器的耳蜗上皮组织体外孵育方法，实时成像观察细胞向受损组织迁移的过程。

摘要

为了研究间充质干细胞（MSCs）对细胞再生和治疗的影响，该方法通过将MSCs与耳蜗上皮共培养，追踪其迁移行为和形态学变化。在分离过程中，利用产生的部分前庭膜将柯蒂氏器固定在塑料盖玻片上。当移除玻璃圆筒后，原本被限制在其中的MSCs向耳蜗上皮迁移。这些细胞主要定位于柯蒂氏器的蜗轴区域，排列方向与神经纤维相似。然而，部分MSCs定位于螺旋缘区域，并呈现水平方向的拉长形态。此外，在卡那霉素处理后，MSCs向毛细胞区域的迁移增加，且其形态转变为多种不同形式。综上所述，本研究结果表明，MSCs与耳蜗上皮的共培养对于通过细胞移植开发治疗方法以及研究可评估多种条件和因素的细胞再生具有重要价值。

引言

听力损失可能先天发生，也可能由多种因素逐渐引起，包括衰老、药物和噪声。由于负责听力的毛细胞一旦受损，其功能很难恢复，因此听力损失通常难以治疗¹。根据世界卫生组织估计，全球约有4.61亿人患有听力损失，占世界人口的6.1%。其中，93%为成人，7%为儿童。

已尝试多种方法治疗听力损失，其中利用间充质干细胞（MSCs）的再生方法已成为一种颇具前景的治疗策略。当组织受损时，间充质干细胞会自然释放到循环系统中，并迁移至损伤部位，通过分泌多种分子形成促进再生的微环境²。因此，建立一种通过外源植入的间充质干细胞迁移至靶器官，并分泌强效免疫调节、促血管生成及抗凋亡分子，从而促进受损细胞功能恢复的方法至关重要^3,4,5。

间充质干细胞（MSCs）向受损组织迁移的归巢过程可能是需要克服的最重要障碍。MSCs具有系统性归巢机制，其过程包括一系列连续步骤：黏附/滚动、活化、停滞、跨内皮迁移/渗出以及迁移^6,7,8。目前，研究人员正在积极探索改善这些步骤的方法。已尝试多种策略，包括基因修饰、细胞表面工程、体外预处理以及磁导向技术^6,7。此外，已有若干研究尝试通过引导MSCs归巢至受损耳蜗部位，以促进听觉毛细胞的保护与再生。然而，在体内追踪MSCs耗时且费力，并需要高度专业化的技术⁹。

为解决这一问题，已开发出一种方法，通过延时共聚焦显微镜观察间充质干细胞（MSCs）在耳蜗中的归巢过程，该方法可连续数小时拍摄细胞的迁移图像。图1。它于20世纪初开发^th 世纪，并且最近已成为研究特定细胞迁移的有力工具。

图1：图形摘要。（A）使用镊子将分离的耳蜗柯蒂氏器黏附在塑料盖玻片上后，将盖玻片置于35 mm玻璃底共聚焦培养皿中，（B）放置玻璃圆筒。（C）向玻璃圆筒内加入培养基后，（D）小心地在圆筒外加入含培养基的GFP标记的间充质干细胞（MSCs）。（E）过夜孵育后，（F）移除玻璃圆筒，并使用共聚焦显微镜拍摄图像。缩写：GFP = green fluorescent protein；MSCs = mesenchymal stem cells。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有涉及ICR小鼠的研究方案均经延世大学原州医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验按照世界医学协会的伦理准则进行。在本方案中，怀孕的ICR小鼠饲养在12/12小时光照/黑暗循环环境中，并可自由获取食物和水。

1. 耳蜗解剖

1. 使用超净工作台前，开启紫外灯照射约30分钟以进行灭菌，并用70%乙醇喷洒所有表面，待其自然干燥。
2. 将解剖器械置于70%乙醇中浸泡10分钟，取出后干燥备用。
3. 使用手术刀对出生后3-4天的小鼠进行断头处理（图2A）。
4. 将头颅置于超净工作台内的体视显微镜下，并用70%乙醇浸泡组织。
5. 迅速将组织浸入组织解离液（1× Hank's平衡盐溶液，1 mM HEPES）中，以去除残留乙醇。
6. 用手术刀沿颅骨中线切开（图2B、C）。
7. 向前牵拉皮肤暴露颅骨，并剪开耳部的外耳道（图2D）。
8. 沿眼部连线方向从颅骨前部向后部剪开（图2E）。
9. 打开颅骨，用钝头镊子取出前脑、小脑和脑干（图2F、G）。
10. 使用显微镊子将耳蜗从颞骨中分离出来（图2H）。
11. 将耳蜗转移至含有组织解离液的培养皿中。
12. 仔细剥离全部耳蜗骨囊，仅保留耳蜗内部的软组织（图2I、J）。
13. 用一对镊子夹住耳蜗的蜗轴，另一对镊子夹住耳蜗管，缓慢分离两部分组织（图2K）。
14. 轻轻剥离血管纹和盖膜以将其去除（图2L、M）。
15. 将灭菌的塑料盖玻片放入新的组织解离液中，然后将柯蒂氏器置于直径为9 mm的盖玻片上，确保基底膜朝下（图2N–P）。
16. 用镊子按压前庭膜及残留的蜗轴组织，使其紧贴盖玻片，从而固定组织（图2N-P）。
17. 将带有嵌入组织的盖玻片转移至直径为35 mm的共聚焦培养皿中央。
18. 将玻璃克隆环放置于培养皿上，使耳蜗外植体位于培养皿中央，并在环内加入100 µL外植体培养基（DMEM/F12，10%胎牛血清（FBS），1% N2补充剂，氨苄青霉素（10 µg/mL））¹⁰（图2Q）。
19. 在玻璃环外的2 mL培养基（45% DMEM + 45% DMEM/F12，10% FBS，1% N2补充剂，10 µg/mL氨苄青霉素）中接种5 × 10³个来源于小鼠骨髓的绿色荧光蛋白（GFP）标记的间充质干细胞（MSCs）（图2R）。
    1. 当MSCs融合度达到80–90%时，使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化进行传代。
20. 小心将共聚焦培养皿转移至湿润培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
21. 吸除环内外所有培养基，然后从共聚焦培养皿中移除玻璃克隆环。
22. 向共聚焦培养皿中加入2 mL新鲜培养基，并将组织培养皿置于湿润培养箱中继续培养，直至准备进行分析。

图 2．小鼠耳蜗的解剖及柯蒂器官与间充质干细胞（MSCs）的共培养。 （A）小鼠断头，（B）和（C）头部正中矢状面解剖，（D）和（E）脑组织冠状面解剖，（F）和（G）脑组织与颞骨的去除，（H）耳蜗，（I）骨性耳蜗壁的去除，（J）耳蜗的分离，（K）耳蜗管与蜗轴的分离，（L）血管纹（SV）和螺旋韧带（SL）与柯蒂器官的分离，（M）盖膜的去除，（N-P）将耳蜗固定于塑料盖玻片上，（Q）共聚焦培养皿中盖玻片与玻璃圆筒的位置，（R）间充质干细胞（MSCs）的接种。白色标尺（A-E）= 1 cm；橙色（F, G, P）和黄色标尺（H,I）= 1 mm；绿色标尺（J-O）= 0.5 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 时间序列成像

1. 对于本实验，使用配备载物台式培养箱系统的共聚焦显微镜系统。
2. 打开共聚焦显微镜、荧光光源和计算机。
3. 将共聚焦显微镜载物台上的台式培养箱的条件设置为 37 °C 和5% CO₂ 大气
4. 将样品皿置于样品皿固定容器上，盖上样品皿固定盖，然后用顶部加热盖封闭腔室。
5. 调整放大倍数和焦距，以在视野中定位耳蜗柯蒂氏器和间充质干细胞（MSCs）。
6. 打开图像处理软件。在 定位 选项，选择一个 20倍平场复消色差物镜（数值孔径0.8） 和一个 0.5倍裁剪区域.
7. 下方 采集，点击 智能设置 并选择 EGFP.
8. 打开 通道 标签下方 采集，并设置 激光功率 至 0.2%, 的 针孔 至 44 µm， 这些 主增益 到 750 V，以及 数字增益 到 1.0.
9. 点击 ESID 在……下方 成像装置，并设置 ESID增益 到 4 以及 数字增益 至 7.5.
10. 点击 瓷砖 和 利益相关方 以生成 210 块瓦片。
11. 开放 聚焦策略 并选择 聚焦模式.
12. 下 时间序列，设置 持续时间 到 24 h 以及 间隔 至 10 min.
13. 在下方 采集，设置 帧大小 到 512 x 512 像素，扫描速度 到 8， 方向 到 双向的，该 平均 到 4x，以及 每像素位数 到 16.
14. 点击 开始实验 开始实验。

3. 图像文件修改

1. 在处理下，点击拼接，并将最小重叠设置为5%，最大偏移设置为10%。
2. 点击视频导出，选择无压缩，并将速度设置为7.5。

4. 免疫染色

1. 小心吸去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤样本两次，每次 5 分钟。
2. 用含 4% 甲醛的 PBS 固定样本 15 分钟，再用 PBS 洗涤样本 3 次，每次 5 分钟。
3. 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 对样本进行通透处理 10 分钟，再用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
4. 加入 250 µL 鬼笔环肽-iFluor 647 试剂（用 PBS 按 1:1000 稀释），在摇床上室温孵育 1 小时。
5. 用 PBS 洗涤样本 3 次，每次 5 分钟。
6. 将盖玻片转移至载玻片上，加入两滴封片液。
7. 轻轻盖上盖玻片。
8. 用透明指甲油密封盖玻片，置于 4 °C 避光保存，直至观察细胞。
9. 使用共聚焦显微镜，选择合适的滤光片，在激发/发射波长（Ex/Em）= 650/665 nm 下观察鬼笔环肽信号，在 Ex/Em = 488/507 nm 下观察 EGFP 信号。

结果

间充质干细胞（MSCs）在三维模式下的体外迁移能力通常通过Transwell系统或传统的伤口愈合方法来评估，以观察其在二维（2D）模式下的迁移情况¹¹。耳蜗柯蒂氏器是一种复杂的结构，由多种细胞组成，包括博伊特歇尔细胞（Boettcher cells）、克劳迪乌斯细胞（Claudius cells）、代特尔细胞（Deiters cells）、支柱细胞（pillar cells）、亨森细胞（Hensen's cells）、外毛细胞、内毛细胞、神经纤维、基底膜以及网状板层（reticular lamina）¹²。当将MSCs移植至由上述复杂细胞构成的组织中时，采用适当的技术来确定细胞被招募和定植的具体位置，对于理解基于MSCs的细胞治疗及再生机制至关重要。此外，为了明确MSCs在组织损伤存在或缺失条件下如何实现局部定位，相较于细胞仅单向随机向下迁移的Transwell系统，采用如伤口愈合法等二维方法更为合适。

讨论

将间充质干细胞（MSCs）移植至受损部位以促进受损细胞再生的研究已广泛开展，其治疗效果显著。已有报道称，MSCs的移植及其后续分化可恢复因3-硝基丙酸诱导听力损失的大鼠的听力¹³。尽管Lee等人 已将MSCs通过静脉途径应用于人体，但并未获得明显的听力改善效果¹⁴。直至最近，已有近12项实验尝试通过MSC移植在啮齿类动物模型中恢复听力。尽管由于研究间的异质性导致结果尚不明确，但已有一定证据表明MSCs可能促进听力恢复。

多种与趋化作用相关的生长因子和趋化因子参与了移植干细胞向损伤区域的迁移，无论其为异质性或同质性环境¹⁵。趋化因子是调控细胞迁移的关键分子，参与组织稳态、免疫应答以及伤口愈合过程。趋化因子在体内诱导的趋化作用可能与体外情况不同，这是由于体内与体外实验条件存在差异。尽管体外实验条件本身具有一定局限性，但开展体内研究以促进细胞的有效迁移、募集和再生仍极为困难¹⁶。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS 缓冲液	GenDEPOT	P2100-104
4% 甲醛溶液	T&I	BPP-9004
氨苄青霉素	sigma	A5354-10ml
牛血清白蛋白（BSA）	sigma	A4503-100G
共聚焦培养皿	SPL	200350
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM800
盖玻片	SPL	20009
DMEM/F12 培养基	Gibco	10565-018
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16140071
含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂	sigma	F6057
镊子	Dumont	0508-L5-P0
HBSS 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	14065056
HEPES 缓冲剂	Thermo Fisher Scientific	15630080
N2 添加剂	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 试剂	abcam	ab176759
载物台培养箱	TOKAI HIT	WELSX
表达 GFP 的 C57BL/6 小鼠间充质干细胞	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787