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方法文章

鼻腔刷取采样及利用数字高速纤毛视频显微镜进行处理——针对新冠疫情的适应性改进

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DOI：

10.3791/61949

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2020年11月7日

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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

本文内容

摘要

为了确保原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断中纤毛功能分析的成功与高质量，必须采用精确且谨慎的呼吸道上皮取样与处理方法。为在新冠疫情期间持续提供PCD诊断服务，纤毛视频显微镜检测方案已更新，纳入了适当的感染控制措施。

摘要

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性运动纤毛病，可导致严重的耳鼻肺部疾病。由于不同诊断方法存在挑战，PCD 的诊断常被遗漏或延迟。数字高速视频显微镜（DHSV）是用于 PCD 诊断的工具之一，通过纤毛视频显微技术进行纤毛功能分析（CFA），包括纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式（CBP）分析，被认为是执行 CFA 的最佳方法。然而，DHSV 缺乏标准化且已发表的样本处理与分析操作流程。此外，该方法需使用活体呼吸道上皮组织，在 COVID-19 大流行期间带来了显著的感染控制问题。为在此次公共卫生危机期间持续提供诊断服务，纤毛视频显微技术的操作流程已进行调整，纳入了充分的感染控制措施。

本文介绍了一种改进的纤毛呼吸道样本采集及实验室处理方案，重点说明了为符合新型冠状病毒肺炎（COVID-19）感染防控措施所作的调整。我们描述了根据该方案处理和分析的16名健康受试者鼻刷样本的代表性纤毛功能分析（CFA）结果。此外，我们还阐述了获取和处理高质量纤毛上皮条带的重要性，因为不符合质量筛选标准的样本无法进行纤毛功能分析，可能降低该技术的诊断可靠性和效率。

引言

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性异质性运动纤毛病，其特征是呼吸道纤毛静止、运动缓慢或运动失调，导致黏液纤毛清除功能受损，并引发慢性耳-鼻-肺部疾病1,2,3,4。PCD 的临床表现包括自婴儿早期开始出现的慢性湿咳和慢性鼻塞，反复或持续的上下呼吸道感染进而导致支气管扩张，以及反复或慢性的中耳炎和鼻窦炎5,6,7。约半数 PCD 患者伴有器官位置异常，如内脏反位或内脏异位。部分患者还因男性精子不动或女性输卵管纤毛不动而出现不孕问题1,2,8。PCD 属罕见病，但其患病率难以准确界定，估计范围为 1:10,000 至 1:20,0009,10。然而，由于诊断困难及临床怀疑不足，PCD 的实际患病率可能更高。PCD 的症状与其他急慢性呼吸系统疾病的常见呼吸道表现相似，且确诊存在诸多诊断挑战，这些问题广为人知，常导致治疗不足和随访不充分2,5,9,11。

利用数字高速视频显微技术（DHSV）进行纤毛视频显微检查，是诊断原发性纤毛运动障碍（PCD）的工具之一4,8,12,13。DHSV 被认为是进行纤毛功能分析（CFA）的最佳方法，包括纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式（CBP）分析2,14,15,16。DHSV 使用活体呼吸上皮组织，通常通过鼻腔刷取获得13。

鉴于当前 COVID-19 疫情的暴发，PCD 诊断的确认显得尤为重要，因为有证据表明，潜在的呼吸系统疾病可能导致感染 COVID-19 后出现更严重的后果17,18。在当前大流行期间建立安全高效的 PCD 诊断服务，还可使确诊的 PCD 患者相比普通人群获得额外的保护措施19。

COVID-19 的传播主要通过飞沫传播20。鼻腔样本中病毒载量较高，提示无症状（或症状轻微）患者具有较高的传播风险20。此外，若病毒颗粒形成气溶胶，可在空气中悬浮至少 3 小时21。因此，呼吸科医护人员在进行临床诊疗及采集诊断样本时，会暴露于高浓度的病毒环境中22。同时，对活体呼吸道样本的操作也会使技术人员面临 COVID-19 污染的风险。尽管目前已有针对呼吸科医生和耳鼻喉科外科医生照护 COVID-19 患者的最佳实践建议并正在实施23，但在 COVID-19 大流行期间如何开展动态喉镜声门下成像（DHSV）仍缺乏相关指导建议。

为了在确保医护人员（进行样本采集）和技术人员（进行样本处理）安全的前提下，继续提供原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断服务，必须在新冠疫情期间对纤毛视频显微镜检查方案进行调整。目前，纤毛视频显微镜技术仅限于研究机构和专业诊断中心使用，因为纤毛纤毛分析（CFA）需要 extensive 的培训和经验。此外，目前在使用数字高速视频（DHSV）进行样本处理和分析时，仍缺乏标准化和精确的操作流程4,13。

本文的目的是描述DHSV的标准操作程序，特别针对采样和处理活体鼻上皮时的感染控制措施和安全规范。这将有助于在当前COVID-19疫情暴发期间持续提供高质量的原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断与诊疗服务。

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方案

已获得列日医院-医学院伦理委员会以及职业卫生与健康保护大学部门的批准。

1. 采集呼吸道纤毛上皮

  1. 确保受试者在采样前至少 4–6 周内无感染，且未使用鼻腔或吸入性药物。
  2. 制备添加物M199培养基：在细胞培养基 M199（500 mL）中加入抗生素溶液（5 mL 链霉素/青霉素（50 μg/mL））和抗真菌溶液（5 mL 两性霉素 B（2.5 μg/mL））。
  3. 准备 2 个 15 mL 带盖锥形管（每侧鼻孔一个），并在每个管中加入 3 mL 添加物M199培养基。
  4. 准备一支支气管细胞学刷（直径：2 mm，长度：11 mm）。剪断金属丝末端，使刷头长度约为 15 cm（图 1A,B）。进行鼻腔刷检时，使用 Weil-Blakesley 鼻钳夹持刷子（图 1B）。
  5. 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）适应性调整：避免处理未知 COVID-19 状态的活体鼻腔上皮样本。在进行鼻腔刷检以开展纤毛视频显微镜检查前 48 至 72 小时，应对患者进行 COVID-19 检测。该检测包括采集鼻咽拭子样本进行聚合酶链式反应（PCR）检测24,25。由于此时患者的 COVID-19 状态未知，医生及工作人员必须采取充分防护措施23,26，包括佩戴 FFP2 口罩、手套、面罩或护目镜，以及穿着长袖防水隔离衣。若无法进行、不可行或对 PCR 检测结果存疑，则所有鼻腔刷检样本的处理均应在生物安全二级（L2）实验室中进行。若患者确诊为 COVID-19 阳性，应推迟原发性纤毛运动障碍（PCD）的诊断检测，并考虑采用其他方法管理患者。
    注意：用于 COVID-19 检测的鼻咽拭子采样可能因损伤鼻腔呼吸上皮纤毛而导致继发性纤毛运动障碍27,28。为避免此情况，应在硬质内镜直视下将细棉拭子轻柔插入鼻腔至鼻咽部，避免损伤鼻甲或鼻中隔。随后在内镜监视下从鼻咽部采集样本并取出棉拭子。在设备充分的情况下，0° 硬质内镜检查可在成人和儿童中无创地顺利完成。

2. 获取呼吸纤毛上皮标本

新冠肺炎疫情防控措施：即使患者的新冠肺炎检测结果为阴性，鉴于存在假阴性率，仍要求患者在操作过程中佩戴外科口罩遮住口鼻，同时医师需佩戴手套、FFP2口罩和面部防护罩。

  1. 鼻刷样本制备
    1. 让患者擤鼻。
    2. 在鼻内镜下或盲视下进行鼻刷操作。若使用鼻内镜，应在鼻刷前检查双侧鼻腔（若48–72小时内已为进行新冠病毒鼻拭子检查而完成过内镜检查，则无需重复）。检查可评估黏膜状态（严重炎症可能在鼻刷时引起出血等）、下鼻甲情况（例如排除毛细血管扩张症的存在），以及鼻中隔是否偏曲（图1C）。
    3. 让患者平躺或舒适就坐，头部向后倚靠在椅背上（因为鼻刷操作会引起头部后仰的反射动作）。在鼻刷过程中，应由第二名护理人员固定患者头部，尤其在儿童中更需如此。
    4. 在鼻刷前将刷子在添加补剂的M199培养基中轻轻摇晃（湿润刷子可减少刷拭时的刺激）。
      注：可将刷子浸入添加补剂的M199培养基中湿润；若患者对其中所含抗生素（青霉素和链霉素）过敏，则应使用生理盐水湿润刷子。
  2. 鼻刷操作
    1. 无需局部或全身麻醉，轻柔插入鼻刷13。若使用鼻内镜，先将内镜置于鼻孔入口处以观察下鼻甲，再将细胞刷插入鼻腔。若进行“盲视”鼻刷，则沿鼻底将刷子插入鼻腔（图1D）。
      注：部分诊断中心使用含萘甲唑啉的棉片进行局部麻醉后再行鼻刷。
    2. 将刷子在下鼻甲后部区域前后移动数次，然后退出。操作者应能感觉到刷子与上皮摩擦，患者可能在刷拭侧出现单侧流泪现象。
      注：若鼻刷操作位置过于靠前，将无法获取纤毛细胞，因为前鼻腔由非纤毛化的移行上皮覆盖。
    3. 取样后，立即将鼻刷样本放入培养基中。通过在含有添加补剂的M199培养基的试管中振荡刷子，使获取的呼吸道上皮条脱落，然后盖紧试管（图1E）。
    4. 新冠病毒适应性操作：取样后，不要立即在添加补剂的M199培养基中振荡刷子以使上皮条脱落。应将刷子直接放入试管中，剪断金属丝使其完全置于管内，立即盖紧试管，并将样本置于密封的双层袋中。

放置支架的导管和手术工具；支架手术的内镜视图；实验室设备的使用。
图1：鼻腔刷取技术。（A）完整的支气管细胞学刷（B）准备刷取：将刷丝末端剪断（约15 cm长），并用Weil-Blakesley鼻钳夹持（C）鼻腔内镜视图：鼻中隔（1）、下鼻甲（2）和中鼻甲（3）（D）在下鼻甲（2）后部进行鼻腔刷取。鼻中隔（1），中鼻甲（3）。（E）通过在添加补充物的M199细胞培养基中振荡刷子，使呼吸道上皮细胞条脱落。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 呼吸道纤毛上皮处理

  1. 采样后9小时内，在显微镜下分析鼻腔刷取样本，因为在此时间段内纤毛摆动频率（CBF）和纤毛摆动模式（CBP）均保持稳定（未发表数据）。
  2. 使用直立或倒置的光学显微镜，配备100倍油浸相位差或干涉差镜头。理想情况下，应将显微镜置于防震台上，因为外部振动（例如来自实验台的震动）可能引起纤毛摆动的人工假象13。

新冠肺炎疫情防控措施：操作人员在进行鼻腔样本处理时需佩戴个人防护装备，包括FFP2口罩、手套和长袖防水隔离衣。

  1. 准备观察室。
    1. 将纤毛上皮条悬置于自制的开放式观察室内，使纤毛可在显微镜下自由摆动并进行分析。该观察室通过在载玻片上粘附两个相邻的方形盖玻片（20 mm × 20 mm），并与另一长条形盖玻片（22 mm × 40 mm）之间保持15 mm间距而形成12（图2，图4A）。

针对 COVID-19 的调整：上述实验室自制的培养腔室为开放结构，允许样品与周围环境之间进行气体和湿度交换13。在 COVID-19 大流行的背景下，可使用封闭式观察腔室，其采用双面粘附间隔层（厚度为 0.25 mm）（图 3，图 4B）。将间隔层粘附在载玻片上，然后将盖玻片（22 mm × 40 mm）贴在间隔层上方。

显微镜载玻片制备过程，四联图，超白片，组织学染色。
图 2：自制开放式腔室的安装。（A）将两片方形盖玻片（20 mm × 20 mm）放置在载玻片上。（B）两片方形盖玻片之间间隔约 15 mm，并粘附在载玻片上。（C）在两片相邻的方形盖玻片之间加入少量补充型 M199 培养基中的纤毛上皮样本（约 60 μL），以填充腔室。（D）将一片长方形盖玻片（22 mm × 40 mm）覆盖在两片相邻的方形盖玻片上，密封腔室。请点击此处查看该图的放大版本。

显示玻璃载片和试剂的色谱法示意图；展示毛细作用。
图 3：使用双面粘合垫片组装封闭腔室。（A）玻璃载片与双面粘合垫片。（B）移除垫片一侧的保护膜，并将垫片粘附到玻璃载片上。（C）移除双面粘合垫片另一侧的保护膜，然后向其中加入少量样本（约 60 μL）含纤毛上皮的补充型 M199 培养基。（D）将一块长方形盖玻片（22 mm × 40 mm）贴在垫片上，封闭腔室。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜装置，载玻片上的样本；示意图显示了显微镜物镜和观察室。
图4：使用数字高速视频显微镜（DHSV）进行纤毛视频显微观察所用主要观察室的示意图。（A）开放式悬滴技术：纤毛样本悬浮于细胞培养基液滴中，液滴置于由盖玻片与载玻片之间两个相邻盖玻片隔开形成的开放腔室内。（B）封闭式悬滴技术：纤毛样本悬浮于细胞培养基液滴中，液滴置于由间隔物夹在载玻片与盖玻片之间形成的封闭腔室内；间隔物牢固粘附于载玻片和盖玻片两侧。改编自 Kempeneers 等人13。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 温度控制
    1. 用气泡膜包裹显微镜（图5A,B）。
    2. 使用魔术贴带将镜头加热器固定在物镜周围（图5C）。
    3. 在进行温度控制检测前1小时打开镜头加热控制器。
    4. 打开显微镜，并确认显微镜已正确设置，因为穿过样品的光量可能会影响载玻片上的温度。
    5. 打开加热箱控制器（图5D）。
    6. 开始前检查参考探针是否正常工作。将参考探针尖端夹在手指之间，其读数应为体温。
    7. 将不含细胞的培养基置于载玻片中央，位于其上粘附的两个相邻方形盖玻片（20 mm × 20 mm）之间。
    8. 将参考探针尖端放入补充型M199培养基中，并用矩形盖玻片（22 mm × 40 mm）覆盖。确保探针完全被液体包围（否则温度可能下降）。
    9. 新冠肺炎适应性操作：若需在封闭腔室中使用垫片进行温度控制，可在垫片一侧切开一个孔（孔的尺寸应与参考探针相同）。将垫片粘贴到玻璃载玻片上，在垫片中央加入无细胞培养基。将参考探针尖端通过垫片上的孔插入溶液中，然后将矩形盖玻片（22 mm × 40 mm）贴附在垫片上。
    10. 将载玻片放入加热箱的加热板上，并用盖子封闭加热箱。
    11. 在油浸物镜上滴加镜油。
    12. 将加热箱放置在显微镜载物台上。
    13. 调节加热板和盖子的温度（盖子温度应比加热板高2 °C，以防止冷凝），使参考探针在介质中测得的温度为37 °C。
    14. 等待5分钟（使样品温度升至37 °C所需时间）。
    15. 调节物镜，使其逐渐靠近载玻片，直至镜头尖端接触盖玻片。
    16. 移动物镜，使参考探针的中部出现在显微镜视野中。
      注意：请确保探针在计算机屏幕上可见（以便在观察纤毛样本前确认相机系统正常工作）。当观察探针中部时，屏幕应完全呈黑色。
    17. 调节镜头加热器的温度（以补偿油浸物镜接触盖玻片时的温度损失）。当物镜接触盖玻片时，应确保参考探针在介质中测得的温度为37 °C。
      注意：理想情况下，应在温度受控的房间内操作，以确保上述设定温度保持稳定。若室温未受控，则每天进行纤毛视频显微镜观察前均需执行此温度校准检查。
    18. 完成温度检查后，将载玻片从加热箱中取出。
    19. 用酒精清洁载玻片和参考探针尖端，并妥善存放。
    20. 使用异丙醇和镜头清洁纸以环形运动方式清洁物镜。

显微镜装置、成像实验、镜头特写、科研实验室中的光学分析。
图 5：DHSV 实验室中使用的设备。（A）配备100倍油浸相衬物镜的显微镜放置在防震台上，以避免外界振动对纤毛功能分析造成伪影。（B）显微镜周围包裹着气泡膜，以防止环境空气导致热量散失。（C）油浸物镜会导致热量散失，可通过使用物镜加热器（箭头所示）来避免。（D）样本通过加热箱进行加热。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 呼吸道纤毛上皮样本的制备

  1. 轻轻摇动试管，使纤毛在试管内均匀分散（避免纤毛粘附在其他带纤毛的组织条、黏液或碎片上，从而妨碍其自由摆动）。
    注意：此步骤对于获得“最佳边缘”状态的纤毛上皮至关重要（图12）。
  2. 用移液器从试管中部吸取约 50 μL 含补充成分的 M199 培养基中的纤毛上皮样本。
  3. 将样本置于自制腔室中（置于两片相邻的方形盖玻片（20 mm × 20 mm）之间），并用矩形盖玻片（22 mm × 40 mm）覆盖。注意避免产生气泡。
  4. 新冠肺炎适应性操作：在微生物安全柜内执行步骤 4.1–4.3。微生物安全柜内的操作流程如下：
    1. 在准备样本前 10 分钟开启微生物安全柜（以确保环境无菌）。
    2. 操作前，使用 70% 乙醇对整个微生物安全柜内部进行消毒。
    3. 将所有必需材料在放入微生物安全柜前，均用 70% 乙醇消毒。
    4. 仅在微生物安全柜内打开一次含有样本的 15 mL 圆锥形离心管，然后在含补充成分的 M199 培养基中用韦尔-布莱克斯利鼻镊轻轻搅动，使上皮条脱落。
    5. 将间隔垫圈粘贴在载玻片上，并移除双面粘合间隔垫圈的保护膜。
    6. 轻轻摇动试管，使纤毛在试管内均匀分散。
    7. 用移液器从试管中部吸取少量含补充成分的 M199 培养基中的纤毛上皮样本（约 60 μL），并填充至间隔垫圈腔室内。
    8. 将矩形盖玻片（22 mm × 40 mm）贴附在间隔垫圈上，封闭腔室。
    9. 在将载玻片移出微生物安全柜前，对其进行表面消毒。
    10. 将载玻片从微生物安全柜中取出。
    11. 离开微生物安全柜时更换手套。
    12. 使用完毕后，等待 10 分钟再关闭微生物安全柜（以确保在关闭柜门前环境已恢复无菌状态）。
  5. 将载玻片放入加热盒的载物板中，并用盖子封闭加热盒。
  6. 在油浸物镜上滴加镜油。
  7. 将加热盒放置在显微镜载物台上。
  8. 开启加热盒和物镜加热器。
    注意：物镜加热器必须在使用前 1 小时开启。
  9. 根据步骤 3.4 中获得的数值，调节加热盒和物镜加热器控制器的温度设置。
  10. 等待 5 分钟（当加热盒和物镜加热器均采用预设参数时，样本温度升至 37 °C 所需时间）。
  11. 将物镜缓慢靠近载玻片，直至镜头尖端接触盖玻片。

5. 观察呼吸道纤毛边缘

  1. 将高速摄像机固定到显微镜上，将摄像机连接至计算机，然后打开摄像机。
  2. 打开计算机。
  3. 通过软件将数字高速显微摄像系统连接至计算机（使通过目镜观察到的图像可投射至显示器上）。
    1. 打开软件后，主菜单将自动弹出（图6A）。
      注意：该软件是实验室用于图像采集与处理的程序。该系统可记录视频序列，并以降低的帧率或逐帧方式进行回放。该软件可免费下载。
    2. 点击 相机（图6A）。
    3. 当出现 相机枚举筛选器 时，选择 确定（图6B）。
    4. 点击 刷新列表；选择相机名称；选择 接口： 专家模式，然后点击 打开（图6C）。
    5. 在停靠对话框菜单顶部的相机控制栏中，选择 实时（图6D）。
    6. 点击 播放 以查看图像，点击 停止 以结束查看（图6D）。

数据采集的相机设置界面；软件示意图中的图像采集与回放选项。
图6：软件使用的说明：在显示器上可视化呼吸纤毛边缘。（A）打开软件后，直接显示主菜单。（B）关闭相机枚举筛选器。（C）选择相机并设置界面：专家模式。（D）实时模式可在显示器上显示显微镜下所见图像。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 调整相机采集设置（位于右上角）(图7).
    1. 开启 采集参数设置 选择 相机，然后调整帧率： 频率（Hz）：500 （见下文）图7A).
    2. 开启 采集设置 选择 相机，然后调整感兴趣区域（ROI）（图7A).
      注意：ROI 的计算使用油浸 x100 物镜观察标定刻度，并将其投影到显示器上，以确定对应于 50 µm （当您希望记录纤毛边缘，其测量长度约为 50 µm （见下文）。
    3. 开启 采集参数设置 选择 记录，然后调整视频的持续时间及记录的总帧数（若选择的帧速率为500 Hz，则2秒持续时间对应1000帧）图7B).
      注意：根据我们的经验，至少需要 2 秒钟的视频长度，才能对 CBF 和 CBP 进行完整的分析。
    4. 选择 文件 然后 保存相机配置 保存新的采集设置（为此新配置输入名称，如有必要，还可添加备注）图7C，D).
    5. 要打开此新相机配置，请打开 文件 和 加载相机配置 (图7C).

相机配置图形用户界面；菜单选项、采集设置、帧率；成像设置流程。
图7：软件使用的说明：用于记录纤毛边缘跳动视频的相机采集参数调整。（A）在采集设置 Camera 中，调整视频录制的感兴趣区域（ROI）和帧率（Rate）。（B）在采集设置 Record 中，根据先前选择的帧率，设置视频录制的持续时间（即所需帧数）。（C）可使用 Save camera Cfg 功能保存新的相机配置设置。Load Camera Cfg 可用于重新打开已保存的配置设置以供后续使用。（D）新的相机配置设置可进行命名，必要时还可添加备注。请点击此处查看本图的高清版本。

  1. 通过目镜观察，查找样本中的细胞或碎片，然后进行聚焦。
  2. 检查图像是否在显示器上可见，并通过调节聚光镜（若使用相差物镜，则同时调节微分干涉（DIC）棱镜）来优化图像质量，必要时调整焦距。
  3. 寻找纤毛上皮条状组织。

6. 呼吸道纤毛边缘的筛选

注意：该实验系统可从三个不同的平面观察纤毛的跳动：侧视剖面、直接朝向观察者跳动的平面，以及正上方平面（图8）。

细胞膜变形过程，侧视图示意图，展示不同方向的力施加情况。
图8：DHSV技术可实现对跳动纤毛在三个不同平面上的观察。 (A）在侧向轮廓中。B）直接朝向观察者跳动且。 (C）的正上方。转载自 Kempeneers 等人。16. 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 仅记录长度至少为 50 μm 的完整且未受破坏的纤毛上皮边缘。
  2. 对于侧面轮廓上的记录，根据 Thomas 等人29的评分系统（图 9）判断边缘质量。仅使用正常边缘（图 9A）或带有轻微突起的边缘（图 9B）进行纤毛功能分析。排除孤立细胞（图 9E）。

显示纤毛细节的显微图像；显微镜研究中的生物细胞结构。
图9：Thomas 等人29 提出的纤毛上皮边缘质量评分系统的代表性图像。（A）正常边缘：定义为长度 > 50 μm 的完整、均匀的纤毛上皮条带；（B）具有轻微突起的纤毛边缘：定义为长度 > 50 μm 的边缘，其细胞从上皮边缘线向外突出，但顶端细胞膜的任何位置均未超过相邻细胞纤毛尖端的高度；（C）具有显著突起的纤毛边缘：定义为长度 > 50 μm 的边缘，其细胞从上皮边缘线向外突出，且至少有一个位置的顶端细胞膜高于相邻细胞纤毛的尖端；（D）孤立的纤毛细胞：定义为长度 > 50 μm 的上皮边缘上唯一的纤毛细胞；（E）单个细胞：定义为彼此之间或与其他细胞类型无接触的纤毛细胞。比例尺：5.5 μm。引自 Thomas 等人29 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 仅使用无黏液和碎片、且以所选记录边缘模式跳动的纤毛进行纤毛功能分析（CFA）。仅选择能够沿边缘提供至少2个纤毛拍打频率（CBF）和纤毛拍打模式（CBP）评估位置的纤毛边缘。
  2. 用于CFA的样本必须至少提供6个以侧向观察模式跳动并满足上述标准的纤毛边缘；最多分析20个以侧向模式跳动的纤毛边缘。
  3. 额外至少使用1个以上方观察模式跳动的纤毛边缘，用于表征纤毛拍打模式（CBP）。

7. 记录纤毛边缘

  1. 使用每秒500帧的相机帧率记录纤毛搏动边缘，并将其投射到高分辨率显示器上。为实现对纤毛搏动频率（CBF）和纤毛搏动模式（CBP）的分析，最低帧率需达到每秒400帧13。另以每秒30帧的帧率记录一条边缘，用于评估颗粒清除效率。
  2. 在停靠对话框菜单顶部的相机控制栏中，选择实时（Live）（图6D）
  3. 选择播放（Play）以查看图像，选择停止（Stop）以结束查看（图6D）
  4. 要记录边缘，点击录制（Record）（图6D）。如需在保存前查看录制内容，请在停靠对话框菜单顶部的相机控制栏中选择回放（Playback）。选择播放（Play）以查看已录制的视频，选择停止（Stop）以结束查看（图10A）。
    注意：在保存前请先停止查看已录制的边缘。

成像软件界面；视频采集设置、文件保存选项、播放控制、数据管理。
图10：软件使用的说明。（A）回放模式。要查看记录的纤毛边缘跳动视频序列，请选择回放模式，点击播放以观看图像，点击停止以结束观看。帧率可进行调整，以改善对纤毛功能的分析。（B, C）保存跳动纤毛边缘的视频记录。（B）要保存视频，请选择文件，然后选择保存采集数据。（C）输入所记录视频的名称，并选择视频的存储位置。请确保将记录保存为.RAW文件。（D）选择待分析的跳动纤毛边缘记录：要打开视频记录，请选择文件，然后选择打开，再选择图像。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将视频保存到数据库中（图10B,C）。
    1. 点击左上角的文件，然后选择保存采集数据（图10B）。
    2. 在保存采集数据界面中，输入所录制视频的名称，并确保录制文件以RAW文件格式保存（图10C）。
  2. 视频保存完成后，返回实时成像模式（返回停靠对话框菜单顶部的相机控制栏，并选择实时）（图6D）。
  3. 重复上述步骤，录制满足CFA所需选择标准的纤毛边缘数量。
    注意：可在制备载玻片后最多20分钟内，从同一张载玻片上录制多个符合选择标准的跳动纤毛边缘（以避免干燥）。若超过20分钟仍无法获得足够数量的符合标准的边缘，则需制备新的载玻片。
  4. 从加热盒中取出载玻片。
  5. 移除矩形盖玻片，并将其丢弃至指定的医疗危险废物容器中。
  6. 使用70%乙醇和吸水纸清洁载玻片（其上粘有两个方形盖玻片）。清洁后，该载玻片可重复使用。
  7. 应对COVID-19的调整措施：将带有盖玻片和间隔物的载玻片放入密封袋中，脱下手套和口罩并一同放入密封袋内，然后将密封袋投入指定的医疗危险废物容器中。

8. 纤毛功能分析

  1. 进行手动纤毛摆动频率（CBF）和纤毛摆动模式（CBP）评估的初步准备
    1. 打开软件。
    2. 点击左上角的文件，然后选择打开，再选择图像（图10D）。
    3. 选择待分析的视频。
    4. 进入停靠对话框菜单顶部的相机控制栏，选择播放（图10A）。点击播放以查看录制的视频，点击停止以结束查看。
  2. 手动纤毛摆动频率（CBF）分析
    1. 仅使用侧缘区域进行CBF评估。
    2. 将纤毛边缘划分为大约5个相邻区域，每个区域长约约10 μm（图11）。
    3. 以降低的帧率识别并观察单根纤毛或纤毛群，每个区域最多进行2次CBF测量，从而在每条边缘上最多获得10次CBF测量值（图11）。
    4. 记录一组纤毛完成5个摆动周期所需的帧数。
    5. 通过简单计算转换为CBF：（CBF = 录制帧率（Hz）/（5次摆动所需帧数）× 5）13,16,30。静止不动的纤毛记为CBF = 0 Hz13。
      注意：在回放录制视频时调整播放帧率（图10A）。当所分析的纤毛摆动非常缓慢时，此操作尤为重要。提高帧率有助于判断纤毛是摆动极慢还是完全不动。
    6. 对于每个样本，计算侧缘区域所有CBF测量值（包括静止纤毛）的平均CBF，以均值（标准差）或（95%置信区间）表示。

显微镜图像，毛发横截面，纤维结构分析，放大比例尺 20 µm，材料研究。
图11：代表性优质边缘图像，以及划分为5个区域以进行CFA分析。 优质纤毛上皮边缘被划分为5个相邻区域，每个区域长10 μm。在每个区域内最多进行2次CBF测量（和2次CBP评估），因此沿每条边缘最多可获得10次CBF测量值（和CBP评估值）。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 纤毛运动模式（CBP）的手动分析
    1. 为评估运动障碍的标志物，仅使用侧视图；使用朝向观察者及俯视的平面来表征CBP类型13。目前存在多种CBP评估方法与评分系统。以下描述本实验室所采用的方法及运动障碍标志物的定义。
    2. 样本中每种不同CBP所占百分比
      1. 对每个已识别并用于纤毛摆动频率（CBF）测量的纤毛或纤毛群（图11），以降低的帧率进行CBP分析：将纤毛在一个完整摆动周期中所走精确路径，与DHSV分析中观察到的正常CBP进行比较12,30。
      2. 为每个分析的纤毛或纤毛群分配一种特定的CBP（正常、不动、僵硬、环形、异步（纤毛摆动不协调）或运动障碍性13）。
      3. 对每个样本，计算其中每种特定CBP所占百分比；样本的CBP以观察到的主要CBP为准。
    3. 计算三项运动障碍标志物。
      1. 计算不动指数（IMI）：样本中不动纤毛所占百分比（CBF=0的纤毛数 / 样本中CBF读数总数 × 100）。IMI以均值（标准差）或（95%置信区间）表示1,16,31。
      2. 计算运动障碍评分（DKS）：将每条带纤毛的边缘分为四个象限，确定其中存在运动障碍性（或异常摆动）纤毛的象限数量。由此可计算出0至4分的DKS（0分：整个边缘CBP均正常；1分：≤25%纤毛CBP异常；2分：≤50%纤毛CBP异常；3分：≤75%纤毛CBP异常；4分：全部纤毛CBP异常）。计算样本的中位DKS（四分位距）16,29。
      3. 计算正常摆动纤毛百分比：定义为样本中具有正常CBP的纤毛所占百分比（正常CBP读数 / 样本总CBP读数 × 100）。

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结果

为了说明该技术的效率，我们展示了一组16名健康成年志愿者（5名男性，年龄范围22-54岁）的CFA实验结果。

在总共16名志愿者中，有14名（4名男性，年龄范围24-54岁）提供的鼻刷样本获得了足够符合选择标准的纤毛上皮边缘，可用于进行纤毛搏动频率分析（CFA）。在这14份鼻刷样本中，共记录到242个纤毛边缘，其中212个边缘符合预设的纳入标准并被纳入分析。所有这些边缘均以侧视轮廓进行记录（对每位志愿者均记录并分析了观察者上方的纤毛搏动情况，以评估是否存在环形纤毛搏动模式（CBP）13，但这些边缘未被用于CFA分析）。从所分析的单根纤毛或纤毛群共获得807次纤毛搏动频率（CBF）测量值及纤毛搏动模式（CBP）评估结果（Table 1）。每位健康受试者的CFA详细结果见Table 1。

14名符合纳入标准的受试者的平均纤毛摆动频率（CBF，±标准差）为14.79（±2.17）Hz。该结果与先前发表的在37 °C恒温...

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讨论

本文旨在提供一种使用鼻腔刷取样本进行纤毛功能分析（CFA）的标准操作流程，并针对COVID-19大流行期间的适当感染控制措施进行了调整。原发性纤毛运动障碍（PCD）的诊断具有挑战性，根据国际建议，目前需要结合多种诊断方法，包括鼻腔一氧化氮测定、使用高速数字视频显微镜（DHSV）进行CFA、透射电子显微镜（TEM）下的纤毛超微结构分析、免疫荧光法标记纤毛蛋白，以及针对PCD致病基因的遗传学检测4,37。目前尚无任何单一检测方法能够诊断所有PCD患者4,37。根据欧洲呼吸学会指南，只有通过TEM观察到典型的超微结构缺陷，或在PCD致病基因中发现双等位基因突变，方可确诊PCD。然而，这些检测方法存在15%-30%的假阴性率4,37,38<...

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披露

这些作者没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢 Jean-François Papon、Bruno Louis、Estelle Escudier 以及巴黎东部原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断中心全体成员在我们访问该中心期间提供的便利、热情接待以及富有成效的交流。同时，我们也感谢 Robert Hirst 及莱斯特 PCD 中心全体成员的热情接待、宝贵时间、专业建议与技术指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 锥形管FisherScientific352096带盖 15 ml 高透明聚丙烯锥形管
两性霉素 BLONZA17-836E抗真菌溶液
Blakesley-weil 鼻钳NOVO SURGICALE7739-12用于夹持刷子进行鼻腔刷取
支气管细胞学刷CONMED129用于鼻腔刷取
棉签NUOVA APTACA2150/SG用于新冠病毒检测
数字高速视频显微镜相机IDTeu Innovation in motionCrashCam Mini 1510
玻璃载玻片ThermoScientific12372098用于构建观察室的显微镜载玻片
加热箱IBIDI cells in focus10918用于加热样品
倒置光学显微镜ZeissAXIO Vert.A1
物镜加热器TOKAI HITTPiE-LH用于加热油浸物镜
Medium 199 (M199), HEPESTermoFisher Scientific12340030细胞培养基
Motion Studio X64IDT Motionversion 2.14.01软件
镜油FischerScientific, Carl Zeiss11825153
矩形盖玻片VWR631-0145用于覆盖密封观察室
间隔垫片（Ispacer）0.25 mmSunjinlabIS203用于构建密闭的观察室
方形盖玻片VWR631-0122用于构建实验室自制的开放式观察室
链霉素/青霉素FisherScientific, Gibco11548876抗生素溶液

参考文献

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