鼻腔刷取采样及利用数字高速纤毛视频显微镜进行处理——针对新冠疫情的适应性改进

摘要

为了确保原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断中纤毛功能分析的成功与高质量，必须采用精确且谨慎的呼吸道上皮取样与处理方法。为在新冠疫情期间持续提供PCD诊断服务，纤毛视频显微镜检测方案已更新，纳入了适当的感染控制措施。

摘要

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性运动纤毛病，可导致严重的耳鼻肺部疾病。由于不同诊断方法存在挑战，PCD 的诊断常被遗漏或延迟。数字高速视频显微镜（DHSV）是用于 PCD 诊断的工具之一，通过纤毛视频显微技术进行纤毛功能分析（CFA），包括纤毛摆动频率（CBF）和摆动模式（CBP）分析，被认为是执行 CFA 的最佳方法。然而，DHSV 缺乏标准化且已发表的样本处理与分析操作流程。此外，该方法需使用活体呼吸道上皮组织，在 COVID-19 大流行期间带来了显著的感染控制问题。为在此次公共卫生危机期间持续提供诊断服务，纤毛视频显微技术的操作流程已进行调整，纳入了充分的感染控制措施。

本文介绍了一种改进的纤毛呼吸道样本采集及实验室处理方案，重点说明了为符合新型冠状病毒肺炎（COVID-19）感染防控措施所作的调整。我们描述了根据该方案处理和分析的16名健康受试者鼻刷样本的代表性纤毛功能分析（CFA）结果。此外，我们还阐述了获取和处理高质量纤毛上皮条带的重要性，因为不符合质量筛选标准的样本无法进行纤毛功能分析，可能降低该技术的诊断可靠性和效率。

引言

原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性异质性运动纤毛病，其特征是呼吸道纤毛静止、运动缓慢或运动失调，导致黏液纤毛清除功能受损，并引发慢性耳-鼻-肺部疾病^1,2,3,4。PCD 的临床表现包括自婴儿早期开始出现的慢性湿咳和慢性鼻塞，反复或持续的上下呼吸道感染进而导致支气管扩张，以及反复或慢性的中耳炎和鼻窦炎^5,6,7。约半数 PCD 患者伴有器官位置异常，如内脏反位或内脏异位。部分患者还因男性精子不动或女性输卵管纤毛不动而出现不孕问题^1,2,8。PCD 属罕见病，但其患病率难以准确界定，估计范围为 1:10,000 至 1:20,000^9,10。然而，由于诊断困难及临床怀疑不足，PCD 的实际....

方案

已获得列日医院-医学院伦理委员会以及职业卫生与健康保护大学部门的批准。

1. 采集呼吸道纤毛上皮

1. 确保受试者在采样前至少 4–6 周内无感染，且未使用鼻腔或吸入性药物。
2. 制备添加物M199培养基：在细胞培养基 M199（500 mL）中加入抗生素溶液（5 mL 链霉素/青霉素（50 μg/mL））和抗真菌溶液（5 mL 两性霉素 B（2.5 μg/mL））。
3. 准备 2 个 15 mL 带盖锥形管（每侧鼻孔一个），并在每个管中加入 3 mL 添加物M199培养基。
4. 准备一支支气管细胞学刷（直径：2 mm，长度：11 mm）。剪断金属丝末端，使刷头长度约为 15 cm（图 1A,B）。进行鼻腔刷检时，使用 Weil-Blakesley 鼻钳夹持刷子（图 1B）。
5. 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）适应性调整：避免处理未知 COVID-19 状态的活体鼻腔上皮样本。在进行鼻腔刷检以开展纤毛视频显微镜检查前 48 至 72 小时，应对患者进行 COVID-19 检测。该检测包括采集鼻咽拭子样本进行聚合酶链式反应（PCR）检测^24,

结果

为了说明该技术的效率，我们展示了一组16名健康成年志愿者（5名男性，年龄范围22-54岁）的CFA实验结果。

在总共16名志愿者中，有14名（4名男性，年龄范围24-54岁）提供的鼻刷样本获得了足够符合选择标准的纤毛上皮边缘，可用于进行纤毛搏动频率分析（CFA）。在这14份鼻刷样本中，共记录到242个纤毛边缘，其中212个边缘符合预设的纳入标准并被纳入分析。所有这些边缘均以侧视轮廓进行记录（对每位志愿者均记录并分析了观察者上方的纤毛搏动情况，以评估是否存在环形纤毛搏动模式（CBP）¹³，但这些边缘未被用于CFA分析）。从所分析的单根纤毛或纤毛群共获得807次纤毛搏动频率（CBF）测量值及纤毛搏动模式（CBP）评估结果（Table 1）。每位健康受试者的CFA详细结果见Table 1。

14名符合纳入标准的受试者的平均纤毛摆动频率（CBF，±标准差）为14.79（±2.17）Hz。该结果与先前发表的在37 °C恒温.......

讨论

本文旨在提供一种使用鼻腔刷取样本进行纤毛功能分析（CFA）的标准操作流程，并针对COVID-19大流行期间的适当感染控制措施进行了调整。原发性纤毛运动障碍（PCD）的诊断具有挑战性，根据国际建议，目前需要结合多种诊断方法，包括鼻腔一氧化氮测定、使用高速数字视频显微镜（DHSV）进行CFA、透射电子显微镜（TEM）下的纤毛超微结构分析、免疫荧光法标记纤毛蛋白，以及针对PCD致病基因的遗传学检测^4,37。目前尚无任何单一检测方法能够诊断所有PCD患者^4,37。根据欧洲呼吸学会指南，只有通过TEM观察到典型的超微结构缺陷，或在PCD致病基因中发现双等位基因突变，方可确诊PCD。然而，这些检测方法存在15%-30%的假阴性率^{4,37,38<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形管	FisherScientific	352096	带盖 15 ml 高透明聚丙烯锥形管
两性霉素 B	LONZA	17-836E	抗真菌溶液
Blakesley-weil 鼻钳	NOVO SURGICAL	E7739-12	用于夹持刷子进行鼻腔刷取
支气管细胞学刷	CONMED	129	用于鼻腔刷取
棉签	NUOVA APTACA	2150/SG	用于新冠病毒检测
数字高速视频显微镜相机	IDTeu Innovation in motion	CrashCam Mini 1510
玻璃载玻片	ThermoScientific	12372098	用于构建观察室的显微镜载玻片
加热箱	IBIDI cells in focus	10918	用于加热样品
倒置光学显微镜	Zeiss	AXIO Vert.A1
物镜加热器	TOKAI HIT	TPiE-LH	用于加热油浸物镜
Medium 199 (M199), HEPES	TermoFisher Scientific	12340030	细胞培养基
Motion Studio X64	IDT Motion	version 2.14.01	软件
镜油	FischerScientific, Carl Zeiss	11825153
矩形盖玻片	VWR	631-0145	用于覆盖密封观察室
间隔垫片（Ispacer）0.25 mm	Sunjinlab	IS203	用于构建密闭的观察室
方形盖玻片	VWR	631-0122	用于构建实验室自制的开放式观察室
链霉素/青霉素	FisherScientific, Gibco	11548876	抗生素溶液