Method Article

使用数字高速睫状视频显微镜进行鼻刷采样和处理 – 适应 COVID-19 大流行

DOI:

10.3791/61949

⸱

November 7th, 2020

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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

In This Article

Summary

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为了保证PCD诊断的成功和高质量的睫状功能分析，一种精确而仔细的呼吸上皮取样和处理方法至关重要。为了在COVID-19大流行期间继续提供PCD诊断服务，睫状视频显微镜检查方案已更新，以包括适当的感染控制措施。

Abstract

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原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性活动性纤毛病，可导致严重的耳鼻肺疾病。由于不同诊断方式的挑战，PCD诊断经常被遗漏或延迟。睫状视频显微镜使用PCD诊断工具之一的数字高速视频显微镜（DHSV）被认为是进行睫状功能分析（CFA）的最佳方法，包括睫状搏动频率（CBF）和搏动模式（CBP）分析。然而，DHSV缺乏标准化的、公布的处理和分析样品的操作程序。它还使用活呼吸道上皮，这是 COVID-19 大流行期间的一个重要感染控制问题。为了在这场健康危机期间继续提供诊断服务，睫状视频显微镜检查方案已经过调整，以包括适当的感染控制措施。

在这里，我们描述了纤毛呼吸道样本采样和实验室处理的修订方案，重点介绍了为遵守COVID-19感染控制措施而进行的调整。描述了从16名健康受试者获得的鼻刷样品中CFA的代表性结果，根据该协议进行处理和分析。我们还说明了获得和处理最佳质量上皮纤毛条的重要性，因为不符合质量选择标准的样品现在确实允许CFA，这可能会降低该技术的诊断可靠性和效率。

Introduction

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原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种遗传性异质性活动性纤毛病，其中呼吸纤毛静止，缓慢或运动障碍，导致粘液纤毛清除受损和慢性耳窦肺疾病1，2，3，4。PCD的临床表现是婴儿早期开始的慢性湿咳和慢性鼻塞，复发性或慢性上呼吸道和下呼吸道感染导致支气管扩张，以及复发性或慢性中耳炎和鼻窦炎5，6，7。大约一半的PCD患者表现为器官偏侧性缺陷，例如位位逆位或位位模糊。一些患者还由于男性精子不动和女性输卵管不动纤毛而出现不孕问题1，2，8。PCD 很少见，但患病率难以定义，范围为 1:10，000 至 1:20，0009，10。然而，由于诊断困难和缺乏临床怀疑，PCD 的实际患病率被认为更高。PCD的症状与其....

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Protocol

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获得了列日医院-教师伦理委员会和大学卫生与健康保护部的批准。

1.呼吸道纤毛上皮取样

  1. 在采样前，确保受试者至少 4-6 周没有感染，并且没有鼻腔和吸入药物。
  2. 制备补充的M199制剂:用抗生素溶液（5mL链霉素/青霉素（5μg/ mL））和抗真菌溶液（5mL两性霉素B（2.5μg/ mL））补充细胞培养基199（M199）（500mL）。
  3. 准备 2 个（每个鼻孔一个）带盖的 15 mL 锥形管，并用 3 mL 补充的 M199 填充每个管。
  4. 准备支气管细胞学刷（厚度:2毫米，长度:11毫米）。切断电线的末端，确保刷子长约 15 厘米（图 1A，B）。要在进行鼻刷时握住刷子，请使用Weil-Blakesley鼻钳（图1B）。
  5. COVID-19 适应: 避免处理 COVID-19 状态未知的活鼻上皮样本，在鼻刷前 48 至 72 小时对患者进行 COVID-19 检测以进行睫状视频显微镜检查。该 COVID-19 测试包括来自鼻咽拭子样本24，25 的聚合酶链反应。由于患者目前尚不清....

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Results

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为了说明该技术的效率，我们在一系列16名健康成年志愿者（5名男性，年龄范围22-54岁）中展示了CFA的结果。

在总共16名志愿者中，来自14名（4名男性，年龄范围24-54岁）的鼻刷样本提供了足够合适的上皮边缘，满足进行CFA所需的选择标准。从这14个鼻刷样本中，共记录了242个纤毛边缘，212个边缘符合定义的纳入标准并进行了分析。所有这些边缘都记录在侧向剖面中（记录并分析了每个志愿者从观察者上方跳动的纤毛，以评估是否观察到圆形CBP13，但CFA不包括这些边缘）。从分析的纤毛或纤毛组中共获得了807个CBF测量和CBP评估（表1）。每个健康受试者的CFA详细结果见 表1。

样本符合纳入标准的14名受试者的平均CBF（±标准差）为14.79（±2.17）Hz。这与先前在37°C受控温度下进行DHSV的实验室中公布的参考数据一致16，

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Discussion

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本文旨在为使用鼻刷样本的CFA提供标准操作程序，并在COVID-19大流行期间根据适当的感染控制考虑进行调整。PCD诊断具有挑战性，根据国际建议，目前需要一组不同的诊断测试，包括鼻一氧化氮测量，使用DHSV的CFA，使用透射电子显微镜（TEM）的睫状超微结构分析，使用免疫荧光标记睫状蛋白，以及PCD致病基因4，37的基因检测。目前，没有单一的测试可以诊断出每个PCD4，37患者。根据欧洲呼吸学会指南，只有 TEM 的标志性超微结构缺陷和 PCD 致病基因中的双等位基因突变才能确诊 PCD。不幸的是，这些测试的假阴性结果率为15-30% 4，37，38，39。

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Disclosures

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这些作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢Jean-François Papon，Bruno Louis，Estelle Escudier以及巴黎东部PCD诊断中心的所有团队成员在访问他们的PCD诊断中心期间的可用性和热烈的欢迎，以及众多的交流。我们还要感谢罗伯特·赫斯特和莱斯特PCD中心的所有团队成员的欢迎和时间，建议和专业知识。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 锥形管FisherScientific35209615 ml 带盖高透明度聚丙烯锥形管
两性霉素 BLONZA17-836E抗真菌溶液
Blakesley-weil 鼻镊NOVO SURGICALE7739-12用于握住刷刷牙的刷子
支气管细胞学刷CONMED129用于鼻腔刷牙
棉签NUOVA APTACA2150/SG用于 COVID-19 检测
数字高速视频显微镜相机IDTeu 运动创新CrashCam Mini 1510
载玻片ThermoScientific12372098用于创建可视化室的显微镜载玻片
加热箱聚焦的 IBIDI 细胞10918用于加热样品
倒置光学显微镜蔡AXIO Vert.A1
镜头加热器TOKAI HITTPiE-LH用于加热油浸透镜
介质 199 （M199），HEPESTermoFisher Scientific12340030细胞培养介质
Motion Studio X64IDT Motion版本 2.14.01软件
OilFischerScientific，Carl Zeiss
矩形盖玻片VWR631-0145用于覆盖观察室
垫片 （Ispacer） 0.25 毫米SunjinlabIS203用于创建密封封闭的观察室
方形盖玻片VWR631-0122用于创建实验室建造的开放式观察室
链霉素/青霉素FisherScientific、Gibco11548876抗生素解决方案
司 11825153

References

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  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H.

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