本文介绍了一种在植物体内精确且可重复地定量核苷/核苷酸的方法。该方法采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。
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方法文章
植物样品中核苷/核苷酸含量测定的HPLC-MS/MS样品制备方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
核苷/核苷酸是核酸的基本组成单元，也是辅底物和辅酶的组成部分，同时作为细胞信号分子和能量载体，参与多种细胞活动。本文介绍一种快速、可靠的植物中核苷/核苷酸绝对定量化方法。简言之，取100 mg均质化的植物材料，加入1 mL提取缓冲液（甲醇、乙腈和水按2:2:1比例混合）进行提取。随后，样品在冷冻干燥仪中浓缩5倍，然后注入高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）。核苷酸在多孔石墨化碳（PGC）色谱柱上分离，核苷在C18色谱柱上分离。通过质谱监测每种核苷和核苷酸的质量跃迁。核苷和核苷酸的含量通过其外标品（ESTDs）进行定量。因此，利用该方法，研究人员可便捷地对不同植物中的核苷/核苷酸含量进行定量分析。
引言
核苷/核苷酸是所有生物体中的核心代谢组分，它们不仅是核酸和多种辅酶（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）的前体，还在磷脂、糖脂和多糖等大分子的合成中发挥重要作用。从结构上看，核苷由一个含氮碱基（可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶）和一个糖基团（核糖或脱氧核糖）组成1,2。核苷酸则在核苷的糖基团5号碳位置上连接有一个至三个磷酸基团3。植物体内的核苷酸代谢对种子萌发和叶片生长至关重要4,5,6。为了更深入理解核苷/核苷酸在植物发育过程中的生理功能，有必要建立在体内对不同类型核苷/核苷酸进行绝对定量的分析方法。
测量核苷/核苷酸最常用的方法之一是采用高效液相色谱法（HPLC）与紫外-可见光（UV-VIS）检测器联用4,7,8,9,10,112013年，Dahncke和Witte使用高效液相色谱法（HPLC）定量分析了多种核苷类型 拟南芥7。与野生型植株相比，他们发现靶向鸟苷脱氨酶基因的T-DNA插入突变体中鸟苷含量显著升高。利用该方法还在植株中定量检测到另一种嘧啶核苷——胞苷，由此鉴定出一个 真正 胞苷脱氨酶基因4然而，基于紫外检测器的该方法难以区分光谱和保留时间相似的核苷，例如鸟苷和黄苷。HPLC方法的检测限相对较高，因此常用于体内含量较高的核苷测定，如胞苷、尿苷和鸟苷。
此外，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）也可用于核苷的测定。得益于此，Hauck 等人成功在 A. thaliana 的种子中检测到尿苷以及核苷分解代谢途径的下游代谢物——尿酸12。然而，气相色谱通常用于分离挥发性化合物，不适用于热不稳定的物质。因此，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）可能是对核苷/核苷酸进行 体内鉴定、分离和定量分析更为合适且准确的分析技术13,14。已有若干先前研究报道，可使用HILIC色谱柱实现核苷和核苷酸的分离15,16，并采用同位素标记的内标物进行化合物的定量17。然而，这两类组分的成本均相对较高，尤其是商品化的同位素标记标准品。本文中，我们报道了一种经济可行的LC-MS/MS方法用于核苷/核苷酸的测定。该方法已成功用于多种核苷/核苷酸（包括ATP、N6-甲基-AMP、AMP、GMP、尿苷、胞苷和假尿苷1,5,6,18）在植物和果蝇（Drosophila）中的定量分析。此外，本文所述方法也可应用于其他生物体。
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方案
1 植物生长与材料采集
- 确保 拟南芥 种子用70%乙醇消毒10分钟，然后播种于含半倍浓度Murashige和Skoog营养物质的琼脂平板上。
- 孵育含有平板 拟南芥 种子于4 °C黑暗条件下放置48 h，随后转移至光照为55 µmol m⁻² s⁻¹、光周期为16 h光照的可控生长培养箱中-2 s-1 在22 °C下光照，20 °C下黑暗8小时。
- 收获100 mg两周龄幼苗（鲜重），液氮速冻后用于代谢物提取。
注意：研究人员在材料采集过程中应正确佩戴手套、防护眼镜和实验服，以避免人体组织污染。
2 核苷/核苷酸提取
- 将100 mg冷冻植物组织与7-8颗钢珠置于预冷的混合研磨仪中，在60 Hz频率下研磨5分钟。
- 配制提取液，其中甲醇、乙腈和水的体积比为2:2:1。
- 用1 mL提取液重悬匀浆物（包含大部分代谢物，但不含蛋白质）。
- 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心15分钟。
- 将0.5 mL上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并在液氮中速冻。
- 将冷冻样品在冷冻干燥仪中干燥，然后用0.1 mL含5%乙腈和95%水的溶液重悬。
- 在4 °C条件下，以40,000 × g 离心0.1 mL溶液10分钟，将上清液转移至进样瓶中用于LC-MS/MS检测。
3 LC-MS/MS 测定
- 通过将1.1 g乙酸铵溶解于2 L双去离子水中，配制10 mM乙酸铵缓冲液（流动相A）。用10%氨水和乙酸调节pH至9.5。
- 为核苷检测配制2 L超纯100%甲醇（流动相B1）；为核苷酸检测配制2 L超纯100%乙腈（流动相B2）。
- 将步骤2.7中预处理后的各样品代谢物提取液0.02 mL注入配备二元泵（LC）的高效液相色谱系统，并与三重四极杆质谱仪（MS）联用。
警告：HPLC系统采用C18色谱柱（50 × 4.6 mm，粒径5 µm；工作温度25 °C），以流动相A和B1进行核苷分离（图1A）；采用多孔石墨化碳（PGC）色谱柱（50 × 4.6 mm，粒径5 µm；工作温度25 °C），以流动相A和B2进行核苷酸分离（图1B）。每个样品重复进样三次，以实现技术重复。 - 按照表1所示条件设置C18色谱柱的程序，按照表2所示条件设置PGC色谱柱的程序。设定流速为0.65 mL min-1。
注意：质谱仪监测质量转换（表3）。八种核苷和五种核苷酸（包括经典核苷/核苷酸及其修饰形式）的质量谱分析条件列于表3中。 - 记录每种目标化合物的峰面积（图1）。
4 标准校准曲线的绘制
- 将按照第2节所述方法制备的六个样品提取液混合在一起，并进行涡旋振荡。然后，将混合液再次等量分装至六个提取液中，以获得各自的背景值。
- 分别向这六个提取液中加入六种不同浓度的标准品，并按照步骤3.3逐一进样。
- 通过步骤3.4和3.5中描述的质量转换，记录每种标准品在不同浓度下的峰面积。
- 以每种标准品的峰面积对其标称浓度作图，绘制六点校准曲线。
注意：步骤3.5中记录的核苷/核苷酸峰面积应落在标准校准曲线的范围内。 - 计算每种标准化合物的直线方程：Y = aX + b
5 种代谢物的定量分析
- 使用步骤 3.5 中记录的峰面积和步骤 4.5 中的公式计算代谢物含量。
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结果
此处以2周龄的Arabidopsis野生型（Col-0）幼苗为例，展示已知修饰核苷N1-甲基腺苷的鉴定与定量。质谱图谱显示，N1-甲基腺苷标准品产生的碎片离子为150 m/z和133 m/z（图2A），在Col-0提取物中也观察到相同的图谱（图2B）。由于150 m/z碎片离子丰度较高，因此选择282.1至150（m/z）的质量跃迁用于N1-甲基腺苷的定量。此外，目标峰的保留时间（RT）为7.05分钟（图3B），与N1-甲基腺苷标准品的保留时间相同（图3A）。综合上述数据，我们证明野生型幼苗体内存在N1-甲基腺苷池。
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讨论
生物体含有多种核苷/核苷酸，包括经典的和异常的核苷/核苷酸。然而，这些物质尤其是修饰核苷的来源及其代谢终产物仍不明确。此外，目前对核苷/核苷酸代谢的功能与稳态调控的理解仍有待深入和拓展。为了研究这些问题，需要采用一种精确且被公认为金标准的方法来鉴定和定量这些代谢物。本文介绍了一种利用质谱技术检测核苷/核苷酸的实验方案。以 N1-甲基腺苷为例，该方法可检测低至 0.02 ng 的标准品，且标准曲线具有很高的准确性（R2 = 0.999；图 4B）。与高效液相色谱法相比，基于质谱的方法具有更优的检测限和准确性。更重要的是，拥有 LC-MS/MS 设备的生物学实验室研究人员均可便捷地实施该方法。此外，该方法还可用于植物中其他已知结构代谢物的鉴定。
在活体条件下 核苷/核苷酸含量的绝对定量需要使用商业标准品化学物质。这些标准品可生成标准曲线，通过质谱记录的峰面积计算样品中目标代谢物的含量。标准品校准曲线的峰面积范围应覆盖样品中目标代谢物在质谱中测得的峰面积。此外，用于生成校准曲...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中央高校基本科研业务费（KJQN202060）、国家自然科学基金（31900907）、江苏省自然科学基金（BK20190528）、国际遗传工程与生物技术中心（CRP/CHN20-04_EC）对M.C.的资助，以及中央高校基本科研业务费（LGZD202004）对X.L.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| 胞苷 | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| 鸟苷 | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb 柱 | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| 肌苷 | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-甲基腺苷 | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-甲基鸟苷 | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige 和 Skoog 培养基 | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A 柱 | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| 假尿苷 | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
参考文献
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
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重印与许可
