本文介绍了一种在植物体内精确且可重复地定量核苷/核苷酸的方法。该方法采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。
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方法文章
植物样品中核苷/核苷酸含量测定的HPLC-MS/MS样品制备方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
核苷/核苷酸是核酸的基本组成单元，也是辅底物和辅酶的组成部分，同时作为细胞信号分子和能量载体，参与多种细胞活动。本文介绍一种快速、可靠的植物中核苷/核苷酸绝对定量化方法。简言之，取100 mg均质化的植物材料，加入1 mL提取缓冲液（甲醇、乙腈和水按2:2:1比例混合）进行提取。随后，样品在冷冻干燥仪中浓缩5倍，然后注入高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC-MS/MS）。核苷酸在多孔石墨化碳（PGC）色谱柱上分离，核苷在C18色谱柱上分离。通过质谱监测每种核苷和核苷酸的质量跃迁。核苷和核苷酸的含量通过其外标品（ESTDs）进行定量。因此，利用该方法，研究人员可便捷地对不同植物中的核苷/核苷酸含量进行定量分析。
引言
核苷/核苷酸是所有生物体中的核心代谢组分，它们不仅是核酸和多种辅酶（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）的前体，还在磷脂、糖脂和多糖等大分子的合成中发挥重要作用。从结构上看，核苷由一个含氮碱基（可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶）和一个糖基团（核糖或脱氧核糖）组成1,2。核苷酸则在核苷的糖基团5号碳位置上连接有一个至三个磷酸基团3。植物体内的核苷酸代谢对种子萌发和叶片生长至关重要4,5,6。为了更深入理解核苷/核苷酸在植物发育过程中的生理功能，有必要建立在体内对不同类型核苷/核苷酸进行绝对定量的分析方法。
测量核苷/核苷酸最常用的方法之一是采用高效液相色谱法（HPLC）与紫外-可见光（UV-VIS）检测器联用4,7,8,9,
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方案
1 植物生长与材料采集
- 确保 拟南芥 种子用70%乙醇消毒10分钟，然后播种于含半倍浓度Murashige和Skoog营养物质的琼脂平板上。
- 孵育含有平板 拟南芥 种子于4 °C黑暗条件下放置48 h，随后转移至光照为55 µmol m⁻² s⁻¹、光周期为16 h光照的可控生长培养箱中-2 s-1 在22 °C下光照，20 °C下黑暗8小时。
- 收获100 mg两周龄幼苗（鲜重），液氮速冻后用于代谢物提取。
注意：研究人员在材料采集过程中应正确佩戴手套、防护眼镜和实验服，以避免人体组织污染。
2 核苷/核苷酸提取
- 将100 mg冷冻植物组织与7-8颗钢珠置于预冷的混合研磨仪中，在60 Hz频率下研磨5分钟。
- 配制提取液，其中甲醇、乙腈和水的体积比为2:2:1。
- 用1 mL提取液重悬匀浆物（包含大部分代谢物，但不含蛋白质）。
- 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心15分钟。
- 将0.5 mL上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并在液氮中速冻。
- 将冷冻样品在冷冻干燥仪中干燥，然后用0.1 mL含5%乙腈和95%水的溶液重悬。
- 在4....
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结果
此处以2周龄的Arabidopsis野生型（Col-0）幼苗为例，展示已知修饰核苷N1-甲基腺苷的鉴定与定量。质谱图谱显示，N1-甲基腺苷标准品产生的碎片离子为150 m/z和133 m/z（图2A），在Col-0提取物中也观察到相同的图谱（图2B）。由于150 m/z碎片离子丰度较高，因此选择282.1至150（m/z）的质量跃迁用于N1-甲基腺苷的定量。此外，目标峰的保留时间（RT）为7.05分钟（图3B），与N1-甲基腺苷标准品的保留时间相同（图3A）。综合上述数据，我们证明野生型幼苗体内存在N1-甲基腺苷池。
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讨论
生物体含有多种核苷/核苷酸，包括经典的和异常的核苷/核苷酸。然而，这些物质尤其是修饰核苷的来源及其代谢终产物仍不明确。此外，目前对核苷/核苷酸代谢的功能与稳态调控的理解仍有待深入和拓展。为了研究这些问题，需要采用一种精确且被公认为金标准的方法来鉴定和定量这些代谢物。本文介绍了一种利用质谱技术检测核苷/核苷酸的实验方案。以 N1-甲基腺苷为例，该方法可检测低至 0.02 ng 的标准品，且标准曲线具有很高的准确性（R2 = 0.999；图 4B）。与高效液相色谱法相比，基于质谱的方法具有更优的检测限和准确性。更重要的是，拥有 LC-MS/MS 设备的生物学实验室研究人员均可便捷地实施该方法。此外，该方法还可用于植物中其他已知结构代谢物的鉴定。
在活体条件下 核苷/核苷酸含量的绝对定量需要使用商业标准品化学物质。这些标准品可生成标准曲线，通过质谱记录的峰面积计算样品中目标代谢物的含量。标准品校准曲线的峰面积范围应覆盖样品中目标代谢物在质谱中测得的峰面积。此外，用于生成校准曲.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中央高校基本科研业务费（KJQN202060）、国家自然科学基金（31900907）、江苏省自然科学基金（BK20190528）、国际遗传工程与生物技术中心（CRP/CHN20-04_EC）对M.C.的资助，以及中央高校基本科研业务费（LGZD202004）对X.L.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| 乙酸铵 | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| 胞苷 | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| 鸟苷 | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb 柱 | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| 肌苷 | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-甲基腺苷 | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-甲基鸟苷 | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige 和 Skoog 培养基 | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A 柱 | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| 假尿苷 | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
参考文献
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine b....
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重印与许可
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