方法文章

活体动物成像与细胞分选方法在神经退行性变研究中的应用 秀丽隐杆线虫 兴奋性坏死模型

DOI：

10.3791/61958

⸱

2021年1月22日

 ,  , 
1Cellular, Molecular, and Biomedical Science, CUNY School of Medicine, The City University of New York (CUNY), 2PhD Program in Biology, The CUNY Graduate Center, The City University of New York (CUNY)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在 C. elegans 兴奋性毒性模型中，本方案采用活体成像技术分析坏死性神经变性的调控机制、编码候选介导因子的基因作用以及线粒体的参与。通过细胞解离与分选，特异性获取处于风险中的神经元，用于神经变性与神经保护机制的细胞特异性转录组分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

兴奋性毒性坏死是神经退行性变的主要形式之一。这种程序性坏死由神经递质谷氨酸在突触部位的积聚及其对突触后受体的过度激活所触发。然而，目前对于导致此类神经退行性变特征性神经元肿胀形态的后续分子事件仍缺乏了解。其他方面，例如特定亚细胞区室的变化，或不同神经元亚型对损伤易感性差异的基础，也尚未得到充分研究。此外，在体外或离体实验体系中，多种因素可能干扰并扭曲此类神经退行性变的自然进程。因此，有必要在活体动物中研究兴奋性毒性坏死，通过监测干预措施对神经元坏死程度的调控作用，利用遗传操作便利且组织透明的模型生物进行实时观察 线虫模型系统 秀丽隐杆线虫. 本方案描述了研究兴奋性毒性坏死的方法 秀丽隐杆线虫 神经元，结合光学、遗传学和分子分析方法。为在 秀丽隐杆线虫，一个 谷氨酸转运蛋白基因的敲除（glt-3) 与神经元致敏的遗传背景相结合（nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) 以引起谷氨酸受体的过度刺激及神经元变性。在活体动物中，采用诺马尔斯基微分干涉差（DIC）、荧光及共聚焦显微镜技术，用于量化神经元变性程度、追踪荧光标记蛋白的亚细胞定位，并评估变性神经元中线粒体形态的变化。神经元荧光激活细胞分选（FACS）技术可用于特异性分离处于风险中的神经元，进而对神经元变性进行细胞类型特异性的转录组学分析。结合活体成像与FACS方法，并利用其优势，以及模式生物的遗传可操作性，可深入解析神经变性过程中的分子机制。 秀丽隐杆线虫 模式生物使研究人员能够利用该系统获得样本量大且可重复的数据。这些检测的结果可能转化为神经退行性疾病治疗干预的新靶点。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

兴奋性毒性是脑缺血中神经元死亡的主要原因，也是多种神经退行性疾病的重要促成因素1,2,3,4,5,6,7,8,9。脑部供氧血流中断（例如由血栓引起）会导致谷氨酸转运体功能障碍，从而引起突触间隙谷氨酸积聚。过量的谷氨酸会过度激活突触后谷氨酸受体（GluRs），导致大量钙离子（Ca2+）以催化性、非化学计量的方式进入神经元（图1A）。这种有害的钙离子内流会引发进行性的突触后神经退行性变，其形态学和机制学表现从凋亡到程序性坏死不等10,11,12。尽管谷氨酸受体拮抗剂在动物模型中干预成功，但多项旨在阻断Ca2+内流并促进细胞存活的临床试验在临床应用中均告失败13,14,15,16。导致这些失败的一个关键原因可能是：与动物模型不同，临床治疗通常在卒中发生数小时后才开始，此时干预措施会阻断晚期起效的神经保护机制，却无法有效中断谷氨酸受体下游的退行性信号传导14,16,17。另一种基于溶栓治疗的策略，仅能在极为有限的时间窗内实施，导致许多患者（尤其是居家发病且发病时间难以确定者）无法从中获益17。这些挫折凸显了有必要将兴奋性毒性的研究重点转向谷氨酸受体过度激活之后发生的事件，并将随后的退行性级联反应与同时发生的神经保护过程区分开来。这一研究方向有助于预防细胞损伤，并发现可在损伤发生后较晚阶段仍有效给药的药物靶点。

确定兴奋性毒性后续事件的一种方法是研究谷氨酸受体（GluR）过度激活下游的细胞死亡信号通路，例如导致线粒体功能崩溃的相关机制。线粒体生理功能和动态过程的严重障碍是神经退行性变的典型特征，这在兴奋性毒性中尤为明显18,19,20。尽管所有细胞的存活、活动及细胞稳态均依赖于线粒体的功能和可用性，但神经元尤其依赖线粒体产生的能量来支持信号的传递与传导。具体而言，神经元在突触后受体/通道激活后，需消耗约50%与信号相关的能量以恢复静息膜电位21，这一过程高度依赖氧气和葡萄糖。在脑卒中中观察到的葡萄糖和氧气供应减少会导致严重的线粒体改变，进一步降低ATP的生成19,22,23,24。然而，关于导致线粒体崩溃事件序列的研究结果存在争议，尚未达成共识。通过分析线粒体形态有助于理解引发线粒体病变的过程，因为形态是反映神经元健康状况的良好指标25,26,27,28,29。丝状线粒体代表健康的神经元状态，而碎片化的线粒体则提示存在显著的神经元损伤，可能最终导致细胞死亡。在不同遗传条件下对活体动物中的线粒体形态进行分析，有助于聚焦于兴奋性毒性中与线粒体依赖性神经退行性变相关的特定基因和通路。

另一种确定可能调控兴奋性毒性神经变性程度的后续事件的方法，是研究能够减轻兴奋性毒性部分效应的转录水平神经保护机制14,16。然而，关键神经保护转录因子缺乏特异性，且实验设计存在差异，这些因素阻碍了明确鉴定核心神经保护程序（尤其是在调控性坏死中）的努力取得成功。

因此，在研究兴奋性毒性中的下游死亡信号通路以及转录介导的神经保护作用时，研究者在实验结果的观察上遇到了巨大的困难并存在广泛争议。这些争议很可能源于使用离体（ex vivo）或体外（in vitro）的兴奋性毒性模型，以及不同实验设计特异性所带来的变异性。因此，聚焦于识别高度保守的核心机制，并在活体（in vivo）条件下对其进行研究，具有重要意义。线虫 C. elegans 作为一种简单的模式系统，因其具备强大且多样化的研究工具、核心细胞死亡通路的高度保守性，以及对其神经系统结构和连接关系的详尽了解，成为一种尤为有效的研究体系30,31,32,33。事实上，Driscoll 实验室在线虫机械感受神经元坏死性神经退行的遗传学分析方面所开展的开创性工作，充分展示了这一研究策略的强大优势34。尤为重要的是，在兴奋性毒性的研究中，线虫中信号通路的保守性涵盖了谷氨酸能神经传递的所有主要组分35,36。

线虫兴奋性毒性模型建立在这些开创性研究的基础之上，使研究人员能够研究类似于中风及其他受谷氨酸依赖性神经毒性影响的神经退行性疾病中发生的生化过程。为了在C. elegans中诱导兴奋性毒性条件，该实验方法采用一种兴奋性毒性品系，该品系结合了谷氨酸转运蛋白基因的敲除 （glt-3）以及神经元致敏的遗传背景（nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]），从而导致谷氨酸受体（GluR）的过度刺激和神经元退变37。该兴奋性毒性品系使30个特定的（表达glr-1的）神经元暴露于兴奋性毒性所致的神经退变中，这些神经元位于谷氨酸能突触连接的突触后。在这30个易损神经元中，随着动物发育进程，个别神经元会发生坏死（具有一定的随机性，同时部分偏好特定神经元38），与此同时，细胞残骸也逐渐被清除。结合多种突变品系的可获得性，该方法可用于研究影响神经退变和神经保护的多条信号通路。这些方法已被用于分析兴奋性毒性神经退变中部分下游的死亡信号级联39以及转录调控因子38,40。与其他线虫坏死性神经退变情况类似41，线虫的兴奋性毒性神经退变不涉及经典的细胞凋亡过程40。

本文方法学论文描述了在 C. elegans 中诱导、量化和操控兴奋性毒性坏死性神经退行性变的基本系统。此外，本文概述了目前用于简化线虫兴奋性毒性特定方面研究的两个主要实验方案。通过使用荧光报告基因和活体实时成像，研究人员可在兴奋性毒性神经退行性变的线虫模型中研究线粒体的参与及其动态变化。为确定特定神经保护性转录因子的作用，研究者可采用细胞类型特异性表达的荧光标记物，将线虫解离为单个细胞，并利用流式细胞术（FACS）分离出易受兴奋性毒性导致坏死的特定神经元。这些经细胞类型特异性分离的神经元随后可用于携带关键转录因子突变品系的RNA测序分析。综合而言，这些方法可使研究人员在活体条件下以高度清晰和精确的方式解析兴奋性毒性所致神经退行性变及神经保护的分子机制。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 用于研究兴奋性毒性神经变性的菌株 & 神经保护

  1. 使用线虫兴奋性毒性品系 ZB1102 作为标准兴奋性神经变性的参考基准。
    注意：C. elegans 中的谷氨酸依赖性兴奋性毒性通过品系 ZB1102 实现，该品系结合了一个谷氨酸转运蛋白的基因敲除（ko）和一个使这些动物神经元对神经毒性敏感的转基因，该转基因在谷氨酸能连接的突触后部分神经元中表达37。这种遗传组合被称为线虫兴奋性毒性品系，可从 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）免费获取。
  2. 为研究编码兴奋性坏死候选调控因子的基因的作用，将这些基因（例如 dapk-1 或 crh-1）的突变与线虫兴奋性毒性品系进行组合。
  3. 按照标准的 C. elegans 遗传杂交方法30 进行遗传杂交，具体步骤参见 wormbook.org42,43。
  4. 由于突变的分子基础通常已有记录，可通过 PCR 对特定基因座进行基因分型来追踪杂交后代。根据片段大小（适用于缺失突变）或测序结果（适用于点突变）区分野生型与突变型。
    注意：表 1 列出了本实验方案中用于研究不同神经变性和神经保护通路的品系。
  5. 所有关键品系均需通过两个独立的遗传谱系构建，并分别进行测试，以确认所观察表型的有效性。

2. 培养基与动物饲养

  1. 在标准NGM平板30,37,42或MYOB平板38,44上，于16-25 °C培养线虫，平板需接种OP50 E.coli，操作按标准方法进行。
    注意：MYOB平板与NGM平板结果一致，但制备略为简便。
  2. 始终保持实验品系营养充足。
    ​注意：饥饿会影响神经变性，并减少头部死亡神经元的数量。若线虫营养不良或处于饥饿状态，应将其转移至新鲜平板，并等待数代后再继续实验。饥饿的跨代效应将在数代后逐渐减弱。

3. 利用诺马尔斯基微分干涉差（DIC）显微技术定量分析头部退化神经元并进行评分

  1. 使用线虫兴奋性毒性品系（ZB1102：glt-3(bz34) IV; nuIs5 V）作为实验对照进行定量，代表正常的兴奋性毒性水平。该方案不会追踪同一只动物在不同发育阶段的变化，而是提供一个混合发育阶段动物群体的快照，因此总体上通过收集不同动物的信息来代表所有发育阶段。
    注意：nuIs5 转基因[Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45（在谷氨酸能连接的突触后神经元中表达激活型Gαs和GFP）会导致约每只动物有~1个头部神经元发生谷氨酸受体非依赖性的坏死性神经退行性变（在发育过程中的任何特定时间点）。加入glt-3 (ko)后，会以谷氨酸受体依赖的方式增加突触后表达nuIs5的神经元的坏死性神经退行性变，在三龄幼虫阶段（L3）可上升至每只动物4–5个死亡的头部神经元37。
  2. 对于测试品系，使用最近完成的遗传杂交所得的动物，或从-80 °C冻存库中复苏感兴趣的品系（这些冻存品系应来自新鲜杂交的后代）。在评分表型和神经退行性变之前，需等待数代（≥4代）。
  3. 从一个含有充分喂养的混合发育阶段动物的培养皿中切下并取出一小块琼脂，将其翻转后贴附到盖玻片上，使原本在琼脂表面爬行的动物朝向盖玻片。
    注意：动物仍可移动，但受到一定限制，无需麻醉即可观察。此类琼脂块可在更换为新的之前使用约1小时。
  4. 使用配备x10目镜和x40或x63物镜的倒置微分干涉差（DIC）显微镜，通过手动滑动盖玻片随机扫描动物。尽管下文所述的其他成像步骤可在正置或倒置显微镜上进行，但对琼脂块中线虫的检查必须使用倒置显微镜。
  5. 根据子宫的形态确定每只动物的发育阶段（可参考wormbook.org中的子宫示意图）。
  6. 对每只动物，记录其发育阶段以及死亡（即空泡化）神经元的数量。统计并记录头部死亡神经元总数、 retrovesicular ganglion（RVG，有助于特定细胞的识别）中死亡神经元的数量，以及尾部死亡神经元的数量（尾部不受谷氨酸影响，可作为内部对照，确认致敏转基因nuIs5完全激活）。
  7. 将数据记录在一个表格中，按发育阶段分类汇总同一品系的动物数据。
  8. 每次实验中，随机收集多个发育阶段的线虫数据；在多个不同日期进行多次评分实验，以获得足够用于统计分析的数据量。在多个发育阶段记录神经退行性变水平，并绘制类似于图1C的柱状图。
    注意：该方法可用于判断某种处理或突变是否在所有发育阶段均升高或降低神经退行性变水平（使分布整体上移或下移），或是否使神经退行性变的峰值提前或延后（使分布左移或右移）。
  9. 在不知晓基因型身份的情况下进行数据收集。在两个独立的遗传株系中重复实验（以最大程度减少不同株系间其他非预期遗传差异带来的影响），并将数据合并用于分析。
  10. 对每个品系，计算各发育阶段头部（包括retrovesicular ganglion）变性神经元数量的平均值及标准误（SEM）（图1D）。根据需要，对仅限retrovesicular ganglion和尾部神经元的死亡情况进行类似分析。

4. 特定退化头部神经元的鉴定

  1. 将单个（或少量）动物固定在琼脂垫上46，并用四甲唑（tetramisole）使线虫麻痹（见下文第5节）。
  2. 使用荧光与微分干涉相差（DIC）组合显微镜（直立式或倒置式），定位特定的空泡化神经元。
  3. 通过追踪该空泡化神经元的GFP标记的突起，并将其胞体位置及突起形态与WormAtlas47中已知表达glr-1的神经元进行比对，确定其具体的神经元身份。
    ​注意：也可借助霍伯特实验室即将推出的多色标记快速鉴定神经元的新方法辅助识别48。

5. 利用报告基因菌株的荧光显微镜技术对神经元线粒体形态进行活体成像

  1. 对于退化突触后神经元中线粒体变化的成像（在原始兴奋性毒性品系中，这些神经元以细胞质GFP标记），观察mito-mCherry荧光。
  2. 将待测兴奋性毒性品系与标记突触后神经元线粒体发出红色荧光的品系进行杂交（通过在glr-1启动子驱动下表达荧光蛋白与TOM-20 N端的融合蛋白；有关构建体和品系的详细信息，参见49）。现在可使用常规落射荧光显微镜（直立或倒置）或共聚焦显微镜对动物进行成像。
  3. 为使线虫麻痹而不影响神经元存活，将5 µL 10 mM 左旋咪唑滴加到新制备的琼脂糖垫上。有关垫片制备的详细方案，请参见Arnold等人的研究46。
  4. 将动物置于左旋咪唑液滴中心，并加盖盖玻片。
  5. 用指甲油密封盖玻片边缘，并静置使其干燥。
  6. 在左旋咪唑处理后20分钟内，使用配备微分干涉差（DIC）和荧光成像功能的显微镜，利用20倍物镜定位线虫。
  7. 找到线虫头部（或目标神经元）后，切换至100倍油镜，聚焦于胞体中线粒体的荧光标记。
  8. 使用DIC、GFP和TxRed滤光片设置采集Z轴层扫图像。

6. 神经元线粒体形态学评分 & 定量分析

  1. 通过活体成像观察线虫，或在图像采集后使用 ImageJ 或其他成像软件分析线粒体形态。
  2. 为便于识别和重复分析特定神经元，可鉴定逆行囊泡神经节中的三个神经元：RIGL/R 和 AVG（在某些情况下，由于兴奋性毒性导致的细胞残骸清除，可能仅存在两个神经元）。
  3. 将线粒体分为三类主要形态：丝状、中间型和碎片化50,51,52。
    注：丝状线粒体在神经元胞体中呈现为连续的细长结构，通常围绕细胞核分布；中间型线粒体表现为至少存在一个明显的丝状网络结构，但伴有断裂，并在胞体中同时出现部分碎片化；碎片化线粒体则显示线粒体网络完全断裂，形态肿胀，并分散分布于整个胞体中（图 2A）。
  4. 对每条线虫，统计具有丝状、中间型或碎片化线粒体的神经元百分比，总计分析至少 30 条线虫。
  5. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后 Tukey 检验，比较不同品系间各类线粒体形态的差异53。

7. 用于神经退行风险神经元FACS分析的线虫解离缓冲液与试剂制备

  1. 按如下方法制备 M9 缓冲液：3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl，加 H2O 至 1 L。通过高压灭菌进行灭菌。加入 1 mL 经滤膜过滤灭菌的 1 M MgSO4。室温保存。
  2. 按如下方法制备卵缓冲液：118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2；通过高压灭菌进行灭菌。加入经 0.2 μm 瓶顶滤器预先过滤的 2 M HEPES（pH 7.3）储备液，使其终浓度为 25 mM。用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.3（不超过 10 mL）。使用渗透压计确保最终渗透压在 335–345 mOsm 之间。用 0.2 μm 瓶顶滤器对卵缓冲液进行过滤灭菌。4 °C 保存。
    ​注意：使用 MgCl2·6H2O 和 CaCl2·2H2O 配制相应的 MgCl2 和 CaCl2 储备液时，盐类更易溶解。也可配制 10 倍浓度的卵缓冲液储备液，使用时用无菌去离子水稀释即可。
  3. 按如下方法制备 SDS-DTT 溶液：20 mM HEPES（pH 8.0）、0.25% SDS、200 mM DTT、3% 蔗糖。在组织培养超净台中，使用 0.2 μm 注射器滤器对 SDS-DTT 溶液进行灭菌。分装为 300 µL 每份，用铝箔包裹避光，于 -20 °C 保存。
  4. 按如下方法制备蛋白酶溶液：在细胞解离当天，用卵缓冲液配制 15 mg/mL 的蛋白酶溶液。置于冰上保存。

8. 神经元特异性 FACS 的年龄同步化

  1. 使用同时携带兴奋性毒性基因型（以及其他所需突变）和强荧光标记转基因表达的动物，该标记可用于高效分选（例如 FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54。将动物培养在两至三个100 mm NGM/MYOB平板上，于20 °C培养至平板上充满以成年雌雄同体为主的线虫。
  2. 用M9缓冲液将线虫从平板上冲洗下来，使用10 mL玻璃移液管将线虫转移至50 mL锥形管中。
  3. 在室温下以250×g离心2.5分钟，弃去上清液。
  4. 用10 mL漂白液（2% 10 N NaOH 和5%新鲜家用漂白剂溶于无菌去离子水中）重悬线虫沉淀。
  5. 将锥形管水平放置于摇床上，低速摇动，确保线虫不沉降至管底。漂白液可裂解成年线虫的角质层，但不会影响胚胎，因为胚胎受到卵壳的保护。
    1. 此漂白步骤约需5分钟，但时间可能有所变化。为防止过度漂白，应每分钟取样一次进行监测：轻轻从每管中吸取10 µL样品置于玻璃显微镜载片上，使用解剖显微镜观察线虫状态。
  6. 当大多数成年雌雄同体线虫已被裂解但尚未完全溶解时，立即向锥形管中加入卵缓冲液以终止漂白过程。
  7. 为收集卵/胚胎，以250×g离心2.5分钟，弃去上清液，并用卵缓冲液再次洗涤。
  8. 重复上述洗涤步骤四次。
  9. 轻轻吹打沉淀重悬卵，并将其接种至四个100 mm已接种细菌的NGM/MYOB平板上。于20 °C培养3天，使胚胎孵化并发育。
    ​注意：此时平板上应已充满以成年雌雄同体为主的线虫。
  10. 通过重复本漂白/年龄同步化流程再次进行年龄同步化。
  11. 将卵接种至八个100 mm NGM/MYOB平板上，于20 °C培养至目标幼虫阶段。

9. 用于流式细胞术的完整线虫细胞解离

  1. 将同步培养的线虫生长至所需发育阶段。用M9缓冲液和玻璃移液管轻轻冲洗100 mm培养皿，将线虫转移至50 mL锥形管中。
  2. 加入冷M9缓冲液至45 mL。将管子置于冰上30分钟，使线虫通过重力沉降到管底，而培养皿中的残留细菌碎片则漂浮在上清液中。
  3. 去除上清液，并用新鲜M9缓冲液洗涤线虫。
  4. 再次在冰上进行30分钟的重力沉降。
  5. 去除上清液，加入M9缓冲液至45 mL，以250 × g 离心5分钟。
  6. 将沉淀转移至微量离心管中，加入M9缓冲液至1 mL。
  7. 在台式离心机上以14,000 rpm离心1分钟，去除上清液。
  8. 为破坏角质层，用SDS-DTT重悬线虫沉淀，所用体积约为沉淀体积的两倍，对L2至成虫阶段的线虫在室温下轻轻摇动孵育4分钟。
    注意：SDS-DTT孵育时间不得超过4分钟，因为更长时间的处理会显著降低荧光蛋白信号。由于SDS-DTT对光敏感，使用时不应超过3个月，以免溶液随时间失去活性；解离效果最佳时应使用新配制的SDS-DTT溶液。
  9. 加入1×卵缓冲液（pH 7.3，335–345 mOsm）至1 mL，以终止SDS-DTT处理。
  10. 在台式离心机上以14,000 rpm离心1分钟，去除上清液。
  11. 为进一步破坏角质层并解离动物细胞，用室温的蛋白酶溶液重悬沉淀，所用体积为沉淀体积的三倍。
  12. 在室温下孵育15–30分钟。
  13. 每5分钟用P-200或P-1000移液器上下吹打40次，移液枪头需接触管底。
    注意：移液枪头接触管底产生的压力有助于线虫解离。建议使用滤芯枪头，以防止在快速吹打过程中线虫意外进入移液器杆内。
  14. 孵育15分钟后，取5 µL样品轻轻吹打后置于载玻片上，在解剖显微镜下观察解离进展。当大多数（约90%）完整线虫已破裂时，解离过程即完成。
    注意：若仍有大量线虫保持完整，可延长蛋白酶孵育时间。
  15. 在细胞培养超净台中，加入1×卵缓冲液至1.5 mL，以终止蛋白酶处理。
  16. 转移至FACS管中，加入5 mL卵缓冲液，以800 × g 离心5分钟。
  17. 去除上清液，用3 mL卵缓冲液重悬沉淀。
  18. 在新的FACS管上放置70 µm细胞筛网帽，将细胞悬液通过筛网加入，以800 × g 离心1分钟。收集流出的细胞悬液。
  19. 在新的FACS管上放置5 µm细胞筛网帽，将细胞悬液通过筛网加入，以800 × g 离心1分钟。
  20. 在卵缓冲液中加入DAPI，使其终浓度为0.5 µg/mL，加盖或遮光后置于冰上避光保存。
  21. 尽快进行FACS分析。荧光蛋白信号会随时间和光照暴露而减弱，因此应尽可能快速完成解离流程，并在解离完成后立即进行FACS分析。
    注意：线虫解离方案改编自Miller实验室55,56,57、Murphy实验室58和Shaham实验室59的方案。

10. 用于鉴定的流式细胞仪操作修改 秀丽隐杆线虫 神经元

  1. 在分选 C. elegans 神经元时，使用 4 升冷藏（4 °C）的卵缓冲液代替标准鞘液。
    注意：C. elegans 细胞的渗透压远高于哺乳动物细胞，标准鞘液会导致神经元破裂。所有仪器设置和校准均需在加入卵缓冲液后进行，因为卵缓冲液的黏度与标准鞘液不同。分选技术人员需运行诊断微珠以确保激光正常工作。
  2. 当分选的神经元将用于后续转录组学研究时，直接将至少 100,000 个 GFP+ 细胞分选至含有 10 µL RNase 抑制剂的 800 µL Trizol-LS 中。
  3. 将 Trizol 中的细胞颠倒混匀 15 次。
  4. 在干冰/乙醇浴中速冻，并于 -80 °C 保存，直至准备为一次 RNA 测序实验提取所有样本的 RNA。
    ​注意：尽管大多数分选细胞均直接收集至 Trizol 中用于转录组分析，仍需保留少量收集于卵缓冲液中的 GFP+ 分选细胞（每种品系均需保留），以便通过显微镜验证分选效率。

11. FACS 门控策略

  1. 检测GFP阳性信号时，使用488 nm激光配合530/30滤光片和502长通（LP）滤光片。
  2. 检测DAPI阳性和阴性细胞时，使用405 nm激光配合450/50滤光片。
  3. 检测可能被误判为GFP阳性细胞的自发荧光细胞时，使用488 nm激光配合610/20滤光片和595 LP滤光片（个人交流，Stanka Semova，运营经理，流式细胞术资源中心，洛克菲勒大学）。
  4. 采用标准设门策略，去除侧向散射面积（SSC-A）较大而前向散射面积（FSC-A）较小的事件，这些事件可能代表细胞团块或碎片。
  5. 先圈选前向散射单细胞，再圈选侧向散射单细胞。
  6. 分离具有高GFP信号和低自发荧光信号的细胞。
    注意：自发荧光较强而GFP信号较弱的细胞并非真正的GFP阳性细胞。
  7. GFP+设门的阈值通过比较GFP阴性细胞（如N2）与GFP阳性细胞来确定55,56。
  8. 根据DAPI对死细胞的选择性通透性，使用活/死细胞设门去除死细胞：活/死设门的阈值通过比较未染色细胞与DAPI染色细胞来确定。
    ​注意：在分选多个样本时，样本之间应冲洗液流，以确保无交叉污染。

12. 对分选后的神经元进行显微镜观察，以验证FACS设门策略的有效性

  1. 用疏液笔在玻璃显微镜载玻片上画一个圆圈。
  2. 将10 µL用卵缓冲液悬浮的分选细胞悬液移入圆圈内。将盖玻片覆盖在样品上，并用指甲油密封盖玻片边缘。
  3. 待指甲油干燥后，在正置/倒置荧光显微镜下检查，确认分选的细胞确实主要为GFP+细胞。
    ​注意：每次分选后均应进行此项检查，以验证FACS设门策略57。

13. 利用质量控制自动化电泳系统进行RNA提取及RNA质量定量

注意：所有 RNA 操作均需格外小心，以避免受到 RNase 污染（包括试剂和耗材的仔细准备，以及遵循最佳的 RNase 安全操作规范）。

注意：所有涉及含有苯酚和/或氯仿样品的操作步骤均须在通风橱中进行。

  1. 在室温下解冻含有 Trizol 的细胞冻存管。
  2. 使用带滤芯的 P200 移液器吸头，上下吹打数次以充分匀浆样品。
  3. 室温孵育 5 分钟。
  4. 每使用 1 mL Trizol 裂解试剂，加入 0.2 mL 氯仿，然后牢固盖紧管盖。
  5. 颠倒离心管 15 次，并在 20–25 °C 下孵育 2–3 分钟。
  6. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。混合物将分为下层红色酚-氯仿相、中间层和上层无色水相。
  7. 仅收集含有 RNA 的上层水相，并转移至新的低 DNA/RNA 结合 1.5 mL 离心管中。
    注意：在某些情况下，若从细胞分选仪落入 Trizol 中的细胞在卵缓冲液中的比例超过 1:3 的样品:Trizol-LS 比例，卵缓冲液中的高盐浓度可能导致分层倒置；若发生此情况，应添加更多 Trizol-LS，并重复颠倒混匀和离心步骤。此外，在分选后若观察到样品体积增加，应注意维持 1:3 的比例；若比例未达标，应在开始 RNA 提取前补充足够的 Trizol。
  8. 使用 RNA 提取柱试剂盒进一步纯化 RNA。
  9. 使用质控自动化电泳系统测定 RNA 完整性数值（RIN），并确认用于后续 RNA 测序实验的 RNA RIN 值不低于 8.0。

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结果

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兴奋性毒性线虫模型及空泡变性神经元的鉴定
此处展示的数据引自先前发表的研究37,38。为模拟兴奋性毒性诱导的神经变性，将谷氨酸转运蛋白基因敲除（glt-3）与神经元致敏的转基因背景（nuIs5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP]）相结合。该转基因结构在表达谷氨酸受体1（GLR-1，AMPA受体的关键亚基）的神经元中表达，并通过这些相同神经元中表达的GFP荧光进行追踪。使用微分干涉差显微镜（DIC）观察变性神经元，其表现为肿胀的空泡（图1B）。当nuIs5转基因结构与glt-3 ko组合时，头部死亡神经元的数量显著增加。当敲除所有在这些细胞中介导谷氨酸诱导电流的谷氨酸受体（GluRs）时，该数量大幅减少，提示存在谷氨酸依赖性的神经变性，这...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管普遍存在的争议和失败表明，兴奋性毒性是一种极难解析的过程，但在秀丽线虫中对兴奋性毒性的分析提供了一种极具吸引力的策略，可用于阐明这种关键神经退行性病变中保守的神经元死亡通路。研究者可以依赖该系统中丰富的研究工具，尤其是线虫的通体透明特性（便于进行活体分析）以及大量可存活的突变体（可从秀丽线虫遗传中心（CGC）免费获取，或通过EMS诱变、CRISPR等技术在实验室内部制备）。此外，由于线虫神经系统中特定神经元的功能已被充分描述，其鉴定相对简便，这进一步推动了研究进展。事实上，目前研究者已能够识别并量化特定神经元的退变过程38，并针对这些神经元开展线粒体损伤或转录组学分析。这有助于揭示赋予特定细胞类型独特易损性或抗性的细胞类型特异性机制。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中可用的强大分子工具以及该模式生物在遗传操作上的便利性，使研究人员能够更深入地探究兴奋性毒性过程中导致神经元细胞死亡及其保护机制的生物学基础。此外，线虫的通体透明特性还允许在活体动物中研究兴奋性毒性特定背景下动态的生物学过程，例如线粒体形态的...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Mano实验室和Li实验室（现任及前任）所有成员的帮助与支持。感谢罗格斯大学（Rutgers Univ.）Monica Driscoll博士在开创线虫坏死性神经退行性变分析方面的工作以及持续的支持；感谢纽约市立学院（CCNY）Chris Li博士提供的支持与建议；感谢纽约市立学院流式细胞术核心设施的Jeffery Walker、纽约市立学院的Bao Voung以及洛克菲勒大学分选核心设施（Rockefeller Univ. Sorting Facility Core）的Stanka Semova在细胞分选方面的实践支持与指导；感谢罗格斯大学Chris Rongo博士提供的试剂；感谢范德堡大学（Vanderbilt Univ.）David Miller博士、普林斯顿大学（Princeton Univ.）Coleen Murphy博士、Shai Shaham博士、Menachem Katz博士 & 凯瑟琳·瓦兰达斯（以上三人均为洛克菲勒大学） 秀丽隐杆线虫 解离方案。

Mano 实验室获得了美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（NIH NINDS）的资助（项目编号：NS096687、NS098350、NS116028），资助对象为 I.M.，此外还通过美国国立卫生研究院 U54 CCNY-MSKCC 合作项目（项目编号：CA132378/CA137788）获得资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂VWRAAA10752-0E
蛋白胨VWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
漂白剂任何家庭
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
细胞滤网，PluriStrainer mini 70 μmPluriSelect43-10070-40
细胞滤网，PluriStrainer mini 5μmPluriSelect43-10005-60
离心机 - 15-50 mL Sorval 台式  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
离心机 - 微型离心机；Eppendorf 5424VWRMP022629891
氯仿VWR97064-680
胆固醇SigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
干冰联合城市冰立方
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
乙醇（100%）VWREM-EX0276-1S
乙醇（90%）VWRBDH1160-4LP
FACS 管美国科学1450-2810
滤器吸头 美国科学1126-7810
10 mL 玻璃刻度吸管 美国科学公司1071-0810
加热块 BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
浸油 - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
异丙醇VWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
低吸附 1.5 mL 离心管美国科学4043-1021
Metamorph 成像软件Molecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl₂2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO₄4VWR97061-438 
荧光成像用共聚焦显微镜蔡司LSM 880
用于荧光成像的倒置显微镜蔡司Axiovert 200 M
显微镜  相机Q-ImagingRetiga R1
用于荧光成像的显微镜光源LumencorSOLA SE Light Engine
显微镜，诺马尔斯基微分干涉差（DIC）ZeissAxiovert Observer A1
显微镜，诺马尔斯基微分干涉差（DIC）尼康Eclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
培养皿，100 mmFisher SciFB0875712
60 mm 培养皿TriTechT3308
移液控制器TEquipmentP2002
Pipettor P10 吸头美国科学1110-3000
Pipettor P1000 吸头美国科学1111-2020
Pipettor P200 吸头美国科学1110-1000
蛋白酶KSigmaP8811-1G
RNA酶清除喷雾Fisher Sci7000TS1
无RNase血清学移液管美国科学公司1071-0810
无RNase的50 mL离心管美国科学5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
硫酸链霉素SigmaS6501-100G
蔗糖VWRAAJ63662-AP
SUPERase·RNase 抑制剂中Fisher SciAM2694
质量控制自动化电泳系统：TapeStation - 高灵敏度RNA ScreenTape 安捷伦5067-5579 
Tapestation - 高灵敏度RNA ScreenTape Ladder 安捷伦5067-5581 
Tapestation - 高灵敏度RNA ScreenTape样品缓冲液 安捷伦5067-5580
Tapestation - IKA MS3 涡旋振荡器安捷伦/IKA4674100
Tapestation - IKA 涡旋振荡器适配器，2000 rpm 安捷伦/IKA3428000
TapeStation - 上样提示 安捷伦5067-5152 或 5067-5153
Tapestation - 光学八联管盖安捷伦401425
Tapestation - 光学八联管条安捷伦401428
质量控制自动化电泳系统：TapeStation 2200安捷伦G2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris 碱Fisher SciBP152-500
Tris 盐酸盐Fisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 水汽压渗透压仪Fisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP分配器VWR25485-003

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523(2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1(1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Brockie, P. J., Maricq, A. V. Ionotropic glutamate receptors: genetics, behavior and electrophysiology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  36. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  37. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  38. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  39. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25(2015).
  40. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060(2014).
  41. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  42. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  43. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  44. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  45. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  46. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368(2020).
  47. Altun, Z. F., Herndon, L. A., Crocker, C., Lints, R., Hall, D. H. WormAtlas. , Available from: www.wormatlas.org (2019).
  48. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  49. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).
  50. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  51. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  52. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  53. Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  54. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180(2016).
  55. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  56. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42(2005).
  57. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  58. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  59. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882(2019).
  60. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  61. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  62. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  63. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  64. Zhang, S., Kuhn, J. R. Cell isolation and culture. WormBook. , Available from: www.wormbook.org 1-39 (2013).

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