本文介绍了一种使用独特设计的加热/固定装置进行啮齿类动物尾静脉注射的有效且高效的方法。通过简化血管扩张的启动过程和固定操作，该方案可对大量动物进行准确及时的静脉注射，同时将动物的不适降至最低。
本文内容
摘要
摘要
在啮齿类动物模型中，尾静脉注射是实验性物质静脉给药的重要方法。尾静脉注射通常需要对动物进行加温以促进血管扩张，这有助于识别血管并准确将针头置入血管腔内，同时需稳妥固定动物。尽管尾静脉注射在许多实验方案中属于常规操作，若操作得当并不属于高难度技术，但准确且一致的注射对于获得可重复的结果并最小化实验变异至关重要。传统上，在尾静脉注射前诱导血管扩张的方法通常依赖热源，例如加热灯、电热/可充电加热垫或预热至 37 °C 的水。尽管这些工具在标准实验室环境中易于获取，但其温度调控能力明显较差或有限。同样，尽管市面上有多种固定装置可供选择，但必须谨慎使用以避免对动物造成创伤。当前方法的这些局限性会在实验中引入不必要的变量，或导致不同实验和/或不同实验室之间结果不一致。
本文展示了一种改进的实验方案，采用一种创新装置，将独立的、温度可控的加热设备与可调节的固定装置整合为一个系统，从而实现高效、简化的尾静脉注射。我们以静脉注射真菌建立血流感染并诱发脓毒症的小鼠模型为例进行说明。该加热装置由一个具有热反射功能的丙烯酸盒构成，内置可调节的自动恒温器，可将内部温度维持在预设阈值。同样，锥形固定装置的宽度和高度也可调节，以安全适配不同体型的啮齿类动物。凭借该设备先进的多功能特性，本文所展示的技术有望成为涉及啮齿类动物尾静脉注射的多种研究领域的实用工具。
引言
啮齿类动物模型在生物医学研究中已被广泛应用。目前有大量近交系和远交系品系，以及基因修饰品系，可供全球实验室常规使用。尾静脉注射是啮齿类动物模型中需要进行静脉内（i.v.）给药时的基本方法之一。通常，与其他给药途径相比，静脉注射具有显著优势，例如通过绕过局部组织和消化道实现高吸收率，并能耐受广泛浓度范围或非生理pH值的溶液1,2,3,4。在其他可行的静脉注射途径（如隐静脉、眶后静脉窦）中，尾静脉被认为是啮齿类动物中最安全且最容易接近的血管2,3,5,6。因此，尾静脉注射已被广泛应用于多种啮齿类动物模型，包括传染病模型7,8,9、生物材料移植10,11、临床前治疗药物评估12,13以及毒理学分析14,15。
在成功的尾静脉注射中，给药的一致性和准确性是关键要求。令人惊讶的是，文献中对尾静脉注射的定性和定量评估表明，错误注射的情况频繁发生16,17。一项研究报道，训练有素的操作人员所进行的30次注射中，有12次在尾部残留了超过10%的注射剂量18。此外，在操作过程中，接受尾静脉注射动物的安全与舒适应被列为首要考虑因素。不当的固定可能导致动物受伤，以及一系列与应激相关的病理变化（例如体重减轻、免疫反应受损），这些因素可能对样本质量引入显著的变量19,20。这些错误可导致数据变异性的增加和实验重复性的降低，从而对研究结果产生负面影响。
在进行尾静脉注射时，由于血管直径较小（据估计小鼠尾静脉直径约为 300 µm），通常需要诱导动物血管扩张21。血管扩张可增强尾静脉的可见性，并有助于将针头与静脉腔内实现最佳对齐。已有多个实验室报道了多种方法，包括将尾巴浸入温水中22、使用温热的覆盖物、灯或吹风机对尾巴加热23,24，或将动物置于配备加热垫、培养箱或加热盒并结合上述热源的温暖环境中25。这些装置可以是为特定用途自制的，也可从商业供应商处获得。然而，许多装置缺乏温度调节功能，即使具备该功能，装置温度也难以稳定维持，常受室温波动影响。同样，在进行尾静脉注射时使用固定装置是必要的，因为不建议使用麻醉26,27。目前已有多种针对实验室特定需求或商业化生产的固定装置被开发出来。通常将动物置于一次性 50 ml 锥形管4、带槽的有机玻璃壁、隧道或锥形管28中，这些装置均可在限制动物活动的同时充分暴露其尾巴。然而，大多数固定装置由于材料刚性而存在尺寸限制。此外，尽管现代高复杂度装置具有实用且精密的设计，但在涉及大量动物的注射操作中似乎并不可行22。
血流感染及相关脓毒症的小鼠模型是必须使用该技术的典型情况之一。在所有严重临床脓毒症的微生物病因中，真菌性脓毒症往往是一种致命性疾病，即使接受抗真菌治疗，其死亡率仍超过>40%29。事实上，白色念珠菌（Candida albicans）感染已被报道为医院获得性血流感染（念珠菌血症）的第四大主要原因30,31。在腹腔内念珠菌病中，胃肠道中的微生物可通过血液播散，导致多微生物性脓毒症，其死亡率更高32,33,34。由于大多数医院获得性念珠菌血症病例来源于污染的中心静脉导管或留置医疗器械35,36，因此通过尾静脉注射将C. albicans经静脉接种，可较好地模拟人类脓毒症的发展过程，已成为血源性播散型念珠菌病小鼠模型中的常用方法37,38。在此模型中，通过调整静脉接种的C. albicans菌量，可延长或缩短数天内发生的死亡率39,40,41。
近期，本实验室开发了一种创新性的尾静脉注射优化方案，该方案采用一种集成了温度调控加热单元和可调节固定装置的新型设备，构成了一体化便捷系统。本方案使研究人员能够准确、及时地进行尾静脉注射，同时可对实验动物进行安全的预处理和固定，显著减少其在操作过程中的应激反应。此处展示的技术结合先进的加热与固定装置，可作为利用啮齿类动物模型的多种研究领域的实用工具。
方案
所有涉及尾静脉注射及使用加热/固定装置的动物实验方案均经当地机构动物护理委员会（IACUC）审查并批准。
1. 准备
- 将动物在饲养环境中适应至少1周，并自由提供食物和饮水。
注意：对于初次使用该注射技术的研究人员，选择毛色为白色或浅色的动物品系可能更为合适，因为尾静脉可通过皮肤清晰可见。深色毛发的小鼠品系（例如C57BL/6）或大鼠品系（例如Brown Norway）尾部色素沉着较深，导致静脉与周围组织的颜色对比度较低。强烈建议初学者接受充分培训，直至熟练掌握操作技能。 - 尾静脉注射用试剂
- 所有待注射试剂和溶液均需在无菌条件下配制。当注射微生物或细胞材料时，应在处理的各个步骤中采取预防措施，以维持无热原条件。
- 仅使用生理盐水（0.9% w/v 氯化钠）或平衡盐溶液（如磷酸盐缓冲液，PBS）作为尾静脉注射的溶剂。
警告：切勿使用水、油类或黏稠溶液，因其可能导致血管损伤。由于血液具有缓冲作用且啮齿类动物血流速度较快，pH值在4.5–8.0范围内的溶液通常可耐受。然而，强酸性或强碱性溶液可能在注射部位造成不必要的组织损伤，应避免使用。 - 尽量减少注射体积和频率。注射前将试剂调节至体温，并采用推荐的注射体积（小鼠≤200 µL，大鼠≤500 µL），以最大限度降低动物应激3。
- 确保每次装填的注射器和针头中溶液不含气泡；若存在气泡，必须彻底排除，以防发生栓塞风险。
注意：通常情况下，1 mL注射器配27 G、½英寸针头即可满足大多数尾静脉注射需求。 - 根据当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）的要求穿戴适当的个人防护装备（PPE），至少包括一次性或专用实验服以及乳胶或丁腈手套。进行尾静脉注射时，强烈建议佩戴护目镜。
- 加热与固定装置
- 使用前仔细检查所有组件，确保装置无任何缺陷（图1）。
- 加热装置启动（图2A）
- 将加热单元放置于清洁、平整的实验台面上并接通电源，确认温控器电源指示灯呈绿色亮起。在加热腔内放置垫料材料，以保持内部干燥并有助于保温。
- 固定装置设置（图2B）
- 将固定单元置于加热单元旁，根据动物体型选择合适的锥形管尺寸。如有必要，手动调节柔性铝制锥形管的基部宽度，以实现对动物的充分固定。也可更换为定制尺寸的锥形管，以适应不同体型的小鼠或大鼠。
2. 尾静脉注射
- 仪器调整
- 设定内部温度
- 使用控制旋钮将恒温器设定至所需温度。确保加热指示灯呈红色亮起，且灯泡点亮。在灯泡亮起（加热）期间，密切监测内部温度显示。当达到目标温度时，恒温器会自动关闭灯泡，通常需要10–15分钟。
注意：设定高于环境温度的温度将启动加热器。通常情况下，标准动物房条件下的推荐饲养温度范围为20至26 °C，而实验小鼠的热中性（即舒适）温度被认为在30至32 °C之间42。因此，建议将保温室的内部温度略高于热中性温度，约为32–36 °C。切勿将恒温器设定高于体温。
- 使用控制旋钮将恒温器设定至所需温度。确保加热指示灯呈红色亮起，且灯泡点亮。在灯泡亮起（加热）期间，密切监测内部温度显示。当达到目标温度时，恒温器会自动关闭灯泡，通常需要10–15分钟。
- 调整固定平台位置
- 使用高度调节旋钮，将锥形筒的高度调整至操作者最适宜的高度。
- 设定内部温度
- 热处理（图3A）
- 当达到目标温度（32–36 °C）后，将动物从饲养笼中轻柔转移至保温室内。
注意：5–10分钟的热处理足以诱导血管扩张并增强尾静脉的可见度。然而，动物可在温控室内安全停留整个操作过程（通常为20–30分钟，无发热迹象）。保温室可安全容纳4–6只小鼠或1只大鼠。 - 监测动物是否出现急性热应激迹象（如呼吸急促、嗜睡、跳跃逃逸行为）。
警告：若动物出现高热迹象，应立即将其送回笼中并持续观察，直至恢复正常活动后再考虑重复使用。若原因为内部温度超出最佳范围，请确保关闭加热装置。
- 当达到目标温度（32–36 °C）后，将动物从饲养笼中轻柔转移至保温室内。
- 注射步骤
- 抓住动物尾根部，将其从保温室中取出，然后将其放入固定装置的锥形开口中。
警告：切勿抓住小鼠尾尖提起，这可能导致严重损伤。对于肥胖或怀孕小鼠，应采用其他替代操作方法28。 - 当动物用前肢抓住锥形筒远端边缘时，轻柔地向后拉尾部，并将尾部穿过开口狭缝。用一只手固定动物后部于锥形筒底部，使一条后肢从锥形筒伸出，从而使侧静脉位于12点钟位置。由于两侧各有一条侧静脉，任一侧后肢均可伸出（图3B）。
- 用非惯用手拇指和食指夹住尾部中段至尾部三分之二处，对侧静脉施加轻微张力，以维持尾部位置和血管扩张状态。
注意：热处理后扩张的静脉更易观察，有助于操作者快速确定最佳注射位点（图4）。 - 用浸有70%酒精的纱布或棉垫擦拭注射部位皮肤。清洁时应尽量轻柔迅速，避免刺激尾部。
注意：此步骤可根据机构IACUC的规定自行决定是否省略。 - 用惯用手持注射器，将针头与尾部平行放置。沿血流方向进针，针尖斜面朝上，角度为10–15°（图5A–B），穿透2–4 mm进入静脉管腔（图5C–D），然后缓慢注入溶液。
注意：若注射成功，推动活塞时应无阻力，且可见液体在静脉内流动。若遇阻力或注射部位上方出现白色水疱，应立即拔出针头，并在原进针点上方重新尝试第二次注射。切勿在初次注射点下方再次注射，否则液体会从原穿刺点渗出。若一侧侧静脉注射失败，可重新调整动物位置至对侧，尝试另一侧静脉。最大尝试次数取决于初始穿刺位置及穿刺失败后可能发生的肿胀程度。有关注射失误及相关损伤，请参照机构IACUC的相关规定。 - 拔出针头后，用拇指用力按压穿刺点，防止注入的溶液或血液反流。继续用干净纱布/棉片或纸巾轻柔按压，直至出血停止（图6）。
- 将动物放回笼中，并至少观察5分钟。确保动物恢复正常活动且无持续出血。
- 抓住动物尾根部，将其从保温室中取出，然后将其放入固定装置的锥形开口中。
3. 一种真菌性血流感染和脓毒症的小鼠模型
- 小鼠品系
- 将6周龄的雌性Swiss Webster远交系小鼠按照机构推荐的指导原则进行适应性饲养。或者，也可使用近交系/基因修饰小鼠品系（如C57BL/6背景），但需调整接种物（参见注释）。
注意（详见讨论部分）：由于尾部色素沉着较深，毛色较深小鼠的尾静脉通常比毛色较浅小鼠的更不易观察图4不同小鼠品系对真菌性败血症/致死的易感性存在差异。使用瑞士韦伯斯特以外的小鼠品系时，可能需要根据影响宿主免疫状态的相关因素（如遗传背景、年龄、性别、体型）进行额外的方案优化。例如，在C57BL/6小鼠中实现与瑞士韦伯斯特小鼠相当的死亡率，通常需要更高剂量的接种物（可达10倍）。
- 将6周龄的雌性Swiss Webster远交系小鼠按照机构推荐的指导原则进行适应性饲养。或者，也可使用近交系/基因修饰小鼠品系（如C57BL/6背景），但需调整接种物（参见注释）。
- 微生物
- 对于致死性攻击（败血症），划线接种冻存菌种 白色念珠菌 将DAY185菌株（或其他选择的菌株）接种至沙保葡萄糖琼脂培养基上，于30 °C培养2天。
- 将单个菌落接种于10 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基中，于30 °C振荡培养18小时至生长稳定期。
- 接种液溶液
- 在致死性攻击当天，收集肉汤培养物，并通过离心（800 ×）洗涤菌体沉淀3次 g) 于无菌 PBS 中。
- 通过台盼蓝染色排除法鉴定活酵母细胞，并使用血细胞计数板进行计数。将细胞浓度调整至 1 x 106 细胞/mL，置于室温下的无菌 PBS 中。
注意：每只动物将接种100 µL接种液。需准备过量的接种液体积（>500 µL），以补偿注射过程中可能的损耗。最终接种量为 1 x 105 每只小鼠的细胞数。可通过相应调整细胞浓度，将接种体积增加至200 µL。
注意：真菌接种液在注射前必须保持在室温。将接种液加热至体温可能诱导其从酵母相转变为菌丝相。相反，静脉推注低温溶液可迅速降低动物体温，应避免使用。
- 静脉接种
- 使动物复温，并按照第2节中的步骤诱导血管扩张。
- 使用1 mL注射器（配27 G、½英寸针头）向尾静脉注射100 µL接种液。
- 接种后监测
- 观察动物是否存在以下脓毒症引起的病征：i）毛发状态（如光滑、竖立凌乱），ii）活动情况（如自由活动、无反应），iii）体态（如蜷缩、僵直），iv）行为表现（如迟缓、不移动位置），v）胸部运动（如正常呼吸、呼吸困难），vi）眼睑状态（如睁开、闭合）43.
- 脓毒症评分
- 根据改良的小鼠脓毒症临床评估评分（M-CASS），在四个等级（0 至 3 分）中对观察到的发病情况进行评分，每个类别分别评定：0 分，正常；1 分，轻度；2 分，中度；3 分，重度43.
- 可选方案：抗真菌败血症疫苗接种
- 在致死性攻击前14天，给小鼠接种 Candida dubliniensis 菌株 Wü284 或减毒株 C. albicans 菌株，例如 Δefg1/Δcph1 突变体（1×105 每只小鼠的细胞数），如第3.2–3.4节所述，替代 C. albicans 第185天
- 对已免疫的小鼠进行致死性攻毒实验，具体操作如3.2–3.4节所述，并监测由脓毒症引起的疾病症状，相关症状描述见3.5–3.6节。
结果
加温舱内的温度由内置传感器持续检测，并通过恒温器自动调节。首先，将恒温器的控制旋钮设定在78、85、90或95 °F（26、29、32或95 °C），以选择目标温度。加热器启动后（图7，黄色圆点），灯泡发热使舱内温度在最初5–15分钟内迅速上升，升温速度取决于设定温度。当传感器检测到的内部温度超过设定温度时，加热器会关闭灯泡（灰色圆点）。在所有实验组中，初始温度峰值应比设定温度高出5–7 °C，以补偿动物转移过程中的热量损失。随后，设备将自动重复加热循环，使加温舱维持在设定温度。
使用本方案通过尾静脉注射成功获得的实验数据示例见图8。在导致败血症的血流性念珠菌病小鼠模型中，通过尾静脉注射向Swiss Webster小鼠攻击Candida albicans（每只小鼠1 × 105个细胞），可迅速引发败血症并导致病原体播散，3–4天内出现高死亡率（空心圆点）（图8A）。相比之下，若预先通过静脉注射给予减毒酵母菌株Candida dubliniensis进行预免疫/疫苗接种，则可保护动物免于败血症，在致死性静脉攻击C. albicans后实现>95%的存活率（实心圆点）。这种在进行性死亡率与疫苗介导保护之间的对比结果，在四次独立实验中均能重复获得（补充图1）。使用其他减毒酵母菌株（如减毒的C. albicans突变株Δefg1/Δcph1）也可实现类似的保护效果（数据未显示）。败血症的发生可被有效监测，并与死亡率相关联；未接种疫苗且遭受致死性感染的动物表现出显著加重的败血症相关病态，而接种疫苗组在致死性攻击后仅表现出轻微症状（图8B）。
图1：啮齿类动物加热与固定装置的说明。 （A） 显示加热装置的外部视图，该装置包括：
- 恒温器盖——用手握住把手向上抬起，以露出恒温器
- 电气外壳——永久密封，用于防护
- 舱盖——在动物转移时向上抬起
- 加热舱——可拆卸，使用前用垫料覆盖底部
- 固定装置——不使用时可收纳于加热设备中
- 电源开关——嵌入式摇杆开关，用于主电源的开启和关闭
- 电源线——电压/电流：120V/10A
(B) 显示加热装置的内部结构：
- 白炽灯泡——100 瓦时的光输出
- 灯泡防护罩——可拆卸，便于更换灯泡
- 温度传感器探头——位于腔体内部
- 腔体内置温度计——置于腔体内，用于监测温度
(C) 显示了加热装置恒温器的组成部分：
- 内部温度温度计
- 温控器——自动调节加热器
- 设定点控制杆——最低/最高：78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)
- 温控器电源指示灯——绿灯表示正常运行
- 温控器加热指示灯——加热循环期间红灯亮起
(D) 显示固定装置的各个组成部分：
- 锥形管 – 专为啮齿类动物固定设计的可塑性铝制管
- 尾部通道 – 特殊形状设计，便于尾部顺畅定位
- 锥形管升降平台 – 提供稳固的锥形管底部抬升功能
- 高度调节旋钮 – 用于手动调节高度
- 剪刀式千斤顶 – 高度调节范围为 45–140 mm (1.77-5.52”)
- 支撑板 – 配有橡胶脚垫以增强稳定性 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：啮齿类动物保温与固定装置。（A）使用前，将装置的两个部分并排置于洁净的实验台面上。（B）接通保温装置电源后，温控器启动加热元件。灯泡持续亮起并散发热量，直至保温腔达到设定温度。保温装置会自动重复加热循环，以维持内部温度恒定。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：置于加热与固定装置中的小鼠（C57BL/6）。（A）小鼠接受热处理以促进血管扩张。将动物（每组处理4–6只小鼠）从饲养笼转移至装置的加热舱，并进行至少5–10分钟的热处理。（B）用于尾静脉注射的小鼠固定操作。将小鼠从加热舱转移至固定装置的锥形开口，使其尾巴穿过开放的狭缝。轻柔地将小鼠向后拉至锥形末端，直至尾根部到达锥尖。当小鼠朝锥底方向被轻柔地横向旋转时，使其一条后腿朝上，从狭缝中微微伸出，从而使侧尾静脉处于12点钟位置。请点击此处查看本图的放大版本。
图4：小鼠尾部侧静脉的识别。（A）未经处理的Swiss Webster小鼠的尾部。将小鼠置于固定装置中，未进行预先加热以引起血管扩张。尾部侧静脉可识别为一条位于皮肤下方的细而深色的血管。（B）经加热装置处理10分钟后的Swiss Webster小鼠尾部。经热处理的小鼠被固定，准备进行尾静脉注射。由于血管扩张导致血管直径增大，尾部侧静脉可通过皮肤清晰可见。（C）经加热装置处理10分钟并被固定的C57BL/6小鼠尾部。尽管由于深色素皮肤与静脉之间对比度较低，静脉的可见性不如浅色的Swiss Webster小鼠明显，但血管扩张仍增强了深色素皮肤下尾静脉的可见性。红色箭头指示尾部侧静脉的位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：在经热处理的小鼠（Swiss Webster）中进行尾静脉注射。（A–B）将针头插入尾部外侧静脉的注射部位。针头（27 G，½ 英寸）平行于尾静脉放置，斜面朝上，指向血流方向并插入。（C–D）针头置于尾静脉内并进行注射。将针头尖端进一步推进静脉管腔内 2–4 mm。拇指置于注射器推杆上，以缓慢而稳定的压力注入所需体积。椭圆形圆圈标示注射部位。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：注射后操作流程。（A）注射部位出现出血区域。拔针后立即出现出血及注射液回流现象。通过拇指对注射部位施加牢固压迫，可最大程度减少该情况。（B）注射部位形成血凝块。使用干净纱布或擦拭巾轻柔压迫，有助于注射伤口处血液凝固。箭头指示注射部位。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：使用过程中加温腔室的内部温度。加温装置在指定的设定温度下启动加温。在45分钟内监测装置加温腔室的内部空气温度，并记录加热循环（灯泡开启/黄色圆点，关闭/灰色圆点）。橙色区域表示诱导啮齿类动物血管舒张的最佳温度范围。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：脓毒症死亡率与疫苗介导的保护作用在致死性攻击后的比较 Candida albicans. 小鼠（8周龄Swiss Webster雌性）通过静脉注射接种减毒活疫苗 都柏林假丝酵母 Wü284 (Cd），随后通过静脉注射野生型进行致死性攻击 C. albicans 第185天（1 x 105 细胞/只）14天后。A在致死性攻击后的10天内评估死亡率。B动物被监测脓毒症发病情况，并根据改良的小鼠脓毒症临床评估评分（M-CASS）进行评分43数据来自4次独立实验，每组10只小鼠，采用Mantel-Cox log-rank检验进行分析。**** p < 0.0001。SEM，均值标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充图1：血液感染中脓毒症死亡率及疫苗介导存活率的可重复性 白色念珠菌 挑战 每个图板代表包含在累积结果中的四次独立实验的数据 图8A每项实验均使用每组10只小鼠进行，并采用Mantel-Cox对数秩检验进行分析。 Ca 白色念珠菌。都柏林念珠菌。 **** p < 0.0001. *** p < 0.01. 请点击此处下载该图片。
讨论
在动物模型中，稳定且准确的给药是确保实验可靠性的关键要求。这一点在静脉注射（i.v.）时尤为重要，因为注射药物的全身生物利用度相较于其他给药途径显著更高且起效更快3。因此，尾静脉注射中的操作误差可能对研究结果产生不利影响。传统上，由于操作简便和使用方便，腹腔（i.p.）注射而非静脉注射一直是啮齿类动物实现全身给药的最常用方法。然而，在将动物的临床前检测结果转化为临床应用时，给药途径的重要性愈发凸显。因此，有必要持续改进啮齿类动物实验方案，以促进尾静脉注射的成功实施。
本方案的关键进展在于采用了一种创新的温度调控加热装置，该装置能够有效诱导啮齿类动物血管扩张，显著提高尾静脉的可见度和进针对准的准确性。温度调控性能差的加热方法（如使用灯照）、局部血管扩张剂或皮肤刺激物（如二甲苯）不仅效果不可靠，而且对动物存在安全隐患，应避免使用44。与其他传统方法（如将尾巴浸入温水中）不同，该装置具备自动调节功能，可同时安全地处理多只动物。此外，本方案还通过使用优化设计的固定装置，实现了动物快速而稳固的固定，使其体位最有利于显露尾部侧静脉，进一步增强了操作的可靠性。
目前许多固定装置采用的透明管状结构，尽管在实际设计上较为合理，但对每只动物的操作耗时较长，从而延长了固定过程45。对于具有攻击性特征、配合度较低的啮齿类品系，这一问题可能更为突出46,47。相比之下，该固定装置的半封闭锥形结构可实现动物的快速定位，有助于缩短固定时间。结合使用这一创新且高度优化的加热/固定系统，整个操作流程得以简化，显著加快注射进程，从而实现对大批量动物快速而有效的给药。在本实验室中，通常采用该方案在1小时内即可完成30只小鼠从加热处理到注射后监测的全部注射流程。
尽管该设备具有先进功能，但仍存在一些明显的缺点：首先是设备本身以及加温舱内常规灯泡更换的成本问题。然而，除了注射效率高、速度快之外，该设备经久耐用，可重复使用，并且与大多数常用消毒剂兼容，可在每次使用后对设备进行彻底清洁，从而弥补了初期投入成本。其次，在工作空间有限的情况下，本方案的一个缺点可能是需要一个专用的实验台区域，其面积需足够大，以便并排放置两台设备以进行注射操作。然而，由于该设备可广泛用于涉及静脉注射的多种啮齿类动物实验方案，因此有可能像异氟烷蒸发器等其他共用的动物房设备一样，成为核心仪器。此外，这两台设备均易于搬运，在不使用时可打包收纳。
本方案所述的小鼠真菌性败血症静脉致死性攻击模型，可高度模拟 C. albicans 人类血液感染的重要病原体，已被广泛用于研究真菌毒力、评估抗真菌治疗效果以及表征宿主对感染的免疫应答37,39,48为了获得可重复的感染效果，通过尾静脉注射进行静脉接种是本方案中最关键的步骤，以确保将病原体准确注入血液。事实上，动物对不同水平的 假丝酵母 静脉注射挑战；接种剂量过低会导致非预期的自发恢复，而剂量过高则会使动物过早死亡。对于特定病原体，能够诱导稳定程度的脓毒症/死亡率的接种量范围，在很大程度上取决于真菌菌株和小鼠菌株的类型。
本方案采用Swiss Webster小鼠，接种剂量为1 x 105 野生型 C. albicans 在1天内可重复地诱发脓毒症发病，随后病情进行性发展，导致5–7天内死亡率达到100%。相比之下，接种量高于1 x 105 通常导致加速死亡（即在1 × 106，5 × 10，3–4天5）以及低于 1 × 105 属于亚致死剂量。与文献中大量报道一致，非白色念珠菌 假丝酵母 物种替代 C. albicans 结果 显著降低的致死率40,49此外，小鼠品系的选择，甚至种群来源，都可能因不同品系间易感性的差异而对感染结果产生显著影响，这一点已被其他研究者报道。39,40,41,50,51,52,53,54,55因此，在设计实验时应同时考虑这两点。
经致死剂量静脉攻击后，真菌细胞通过血液迅速扩散，并开始侵袭多个器官，其中受影响最严重的是肾脏41。其他受累器官包括脑、脾和骨髓48,56。然而，在早期时间点，急性败血症是最终的致死原因37。如代表性结果所示，可通过小鼠败血症临床评估评分（Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis, M-CASS）对败血症严重程度进行定量评估，该评分基于受攻击动物所表现出的败血症症状43,57。在多种致命性败血症的替代标志物中，低体温已被认为是临床和实验性败血症中即将死亡的关键预测指标43,58,59。
尽管尚未开展正式研究直接比较该模型中近交系与远交系小鼠的差异，但采用远交系Swiss Webster小鼠执行本方案所获得的数据在各项脓毒症参数上均表现出极高的可重复性，尽管其存在预期的遗传异质性。通常情况下，死亡模式出现在3至5天内，属于急性脓毒症的可靠模型，这由致死性攻击后数小时内脓毒症发病率及炎症标志物水平迅速升高所证实50,51。对于较长的存活时间（7–10天），死亡可能由微生物负荷导致靶器官及中枢神经系统发生致死性组织损伤所致。根据所使用的接种剂量，可选择脓毒症或微生物负荷模型，以适用于评估免疫功能，或对抗炎治疗方案、抗真菌疗法/疫苗的反应。
除了静脉致死性攻击模型外，通过腹腔注射（i.p.）在小鼠体内造成C. albicans的腹腔内感染也可导致播散性念珠菌病及继发性败血症，尽管与细菌病原体Staphylococcus aureus共接种时，相较于C. albicans单一感染，其死亡率具有协同增强作用51,60,61。在腹腔致死性攻击模型中，需要显著更高的微生物接种量（每只小鼠1.75 × 107 C. albicans/8 × 107 S. aureus），以引发多微生物性腹膜炎，并促使病原体从腹腔扩散至血液。类似地，在经免疫抑制剂和/或黏膜损伤剂处理的小鼠中，胃肠道感染C. albicans可导致真菌细胞易位进入血液，进而引发真菌性败血症62,63。尽管接种途径不同，这三种疾病模型中继发性真菌败血症的机制大体相似，均涉及对Candida不受控制的全身性促炎反应，最终导致器官衰竭37,51,61。同样，在人类中，正是宿主免疫反应的过程——而不仅仅是念珠菌血症本身——导致了医疗机构相关性血行播散性念珠菌病的高发病率和高死亡率64,65。
利用当前的真菌败血症模型，我们在此证明，通过静脉注射预先免疫/接种非致病性的 C. dubliniensis 或减毒的 C. albicans 突变株，可实现对致死性 C. albicans 感染的保护作用，同时显著降低败血症的发病率。这种保护作用由先天性的 Gr-1+ 髓系来源的抑制性细胞介导，这些细胞似乎在骨髓中被诱导产生，属于一种训练型先天免疫66,67。目前正在进行研究，以进一步阐明这种由先天免疫介导的新型保护机制在抗 C. albicans 血流感染中的作用。
综上所述，这种创新的啮齿类动物保温/固定装置在高效、有效地开展大规模多组动物静脉注射研究方面发挥了重要作用。因此，我们将该装置命名为“每分钟一只小鼠”（Mouse a Minute）。该装置的技术参数可向通讯作者索取，以便采购类似设备。本文所展示的技术可作为多种研究领域中利用尾静脉注射的啮齿类动物模型的实用工具。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由LSUHSC基金会（PLF）资助，并部分由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的U54 GM104940项目资助，该项目为路易斯安那临床与转化科学中心提供资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 白色念珠菌DAY185菌株 | 卡内基梅隆大学 | N/A | 由Aaron Mitchell实验室提供 |
| 白色念珠菌efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ | 田纳西大学健康科学中心 | N/A | 由Glen Palmer实验室提供 |
| 都柏林念珠菌Wü284菌株 | 爱尔兰都柏林三一学院 | N/A | 由Gary Moran实验室提供 |
| 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 551NCICr:SW | 雌性Swiss Webster小鼠；6–8周龄 |
| 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 556NCIC57BL/6 | 雌性C57BL/6小鼠；6–8周龄 |
| 27G，½英寸针头 | 贝克顿·迪金森公司 | 305109 | 可由其他供应商替代 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GE公司 | SH30028.02 | 可由其他供应商替代 |
| 啮齿类动物加热与固定装置（Mouse a Minute） | 路易斯安那州立大学健康科学中心 | 定制订单 | Mouse a Minute可向路易斯安那州立大学健康科学中心定制 |
| 沙保葡萄糖琼脂（SDA） | 贝克顿·迪金森公司 | 211584 | 可由其他供应商替代 |
| 1 mL注射器 | 贝克顿·迪金森公司 | 309659 | 可由其他供应商替代 |
| 台盼蓝溶液 | 西格玛公司 | T8154 | |
| 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基 | 菲舍尔科技公司 | BP2469 | 可由其他供应商替代 |
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